1、2019/5/2,1,寄 生 虫 检 验 技 术,广州医学院病原生物学教研室陈 代 雄,2019/5/2,2,一、定义,通过一定的检验方法诊断 寄生虫病之学问 寄生虫病的实验室诊断方法,2019/5/2,3,二、范畴,病原学诊断技术：粪检、血检等 免疫学诊断技术：ELISA、HIA等 核酸诊断技术：PCR、核酸探针等它们各有特点与用途，现分别介绍于下：,2019/5/2,4, 病原学诊断技术,定义：通过检获病原体进行寄生虫病诊断的方法 意义：它通过从患者体内或其排泄、分泌物中检获寄生虫来进行诊断，因而具有确诊价值。 它是最重要的寄生虫病实验诊断方法。,2019/5/2,5,第一节 粪便检查 最
2、常用的寄生虫病原学诊断方法,一、定性诊断方法：(有无？什么？) （一）肉眼检查与鉴定1、虫体收集方法：（1）拣虫法：大型肠道蠕虫 蝇蛆蛔虫、姜片虫、带绦虫孕节,2019/5/2,6,（2）水洗过筛法：检查肠道蠕虫带绦虫头节 （3）水洗沉淀法：小型肠道蠕虫 钩虫、鞭虫、肝吸虫等,2019/5/2,7,2、虫体检查与鉴定 （1）直接观察法：大型蠕虫 小型蠕虫 肉眼观察 放大镜or解剖镜观察 形态特点、活动 形态、活动 鉴定,2019/5/2,8,（2）压片法和注射墨汁或卡红法 （3）乳酸酚透明法小型肠道蠕虫 透明 观察其体表和内部结构 虫种鉴定,带绦虫 孕节,子宫 侧支数,虫种鉴定,2019/5/
3、2,9,（二）湿涂片法：（最常用）,优点：简便、快速缺点：由于取材少，故检出率较低， （但对蛔虫、姜片虫等检出效果好）连续涂片三张，可提高检出率。,2019/5/2,10,方法1、生理盐水（NS）直接涂片法用于检查：蠕虫卵、原虫滋养体2、碘液染色法用于检查：原虫包囊注意：涂片要用NS 保持其形态 与活动能力,等渗,2019/5/2,11,（三）浓集法 特点：与湿涂片法相反。,1、沉淀法： 原理：虫卵比重 水（溶剂） 方法：（1）自然沉淀法：最常用的沉淀法 适于检查：蠕虫卵比重较大的原虫包囊(少数),2019/5/2,12,注意：对于比重较小的钩虫卵和原虫 包囊效果不好。,（2）其他：离心沉淀法
4、倒置沉淀法 醛醚沉淀法汞碘醛离心沉淀法上述方法，各有特点,2019/5/2,13,2、浮聚法： 原理：虫卵比重 （比重较大的）溶液 方法：（1）饱和盐水浮聚法：最常用 （比重：1.20） 适于检查：线虫卵(钩虫卵尤佳)带绦虫卵微小膜壳绦虫卵 不适于查：吸虫卵 (比重1.2)原虫包囊,2019/5/2,14,（2）硫酸锌离心浮聚法操作：适于检查：原虫包囊、卵囊 线虫卵 微小膜壳绦虫卵粪类圆线虫幼虫肝吸虫等部分吸虫卵,2019/5/2,15,（四）幼虫孵化法,1、毛蚴孵化法：用于血吸虫病诊断。适用情况：粪便直接涂片法或自然沉淀法检查阴性无显微镜时 方法：30g粪便 滤去粗渣 沉淀沉 渣孵 化近水面
5、处是否有毛蚴活动？,去上清,烧瓶，加“凉开水”,2530 46小时,观察,2019/5/2,16,2、钩蚴培养法：用于钩虫病的诊断 适用情况：粪便镜检阴性无显微镜时 操作方法： 特点：检出率高，可作虫种鉴定但费时较长（35天）且冬天需保温,2019/5/2,17,2019/5/2,18,（五）特殊染色法,1、主要用于原虫的鉴定：原虫小不经染色内部结构很难看清如：阿米巴 拟染色体、核 虫种区别染色方法：多2、蠕虫经普通方法难于鉴定时例：钩虫美洲钩虫？十二指肠钩虫？,铁苏木素染色,2019/5/2,19,二、定量诊断方法,原理：定量粪便中 虫卵数 用途：估计寄生虫感染数量与程度判断防治效果 （虫多
6、 卵多） （一）改良加藤法（加藤厚涂片法） 特点：简便、快捷，被WHO认可 方法：取约41.7mg粪便 厚粪膜 透明 镜检（3036，30min）,甘油孔雀绿溶液,2019/5/2,20,2019/5/2,21,适于：蠕虫卵检查 注意：粪膜厚度适当透明时间适当（二）司徒耳氏 (STOLLS) 虫卵计数法检查： 蠕虫卵 （三）小管浮聚法： 主要用于钩虫卵计数（定量诊断在感染度低时误差较大）,2019/5/2,22,注意事项 （准确性） 1、粪便要新鲜(无污染)，及早送检 2、送检的粪量要恰当 一般：510g自然沉淀法：30g查带绦虫头节：24h粪便 3、注意粪便的性状、颜色等，特别注意有无粘液、
7、脓液、血液等如：果酱样便 4、粪便中酵母菌、花粉等应注意与虫卵、原虫包囊等区别,2019/5/2,23,粪便要新鲜 份量要恰当性状要观察 杂物要区别,2019/5/2,24,第二节 肛周检查,一、虫卵检查主要用于 蛲虫病、带绦虫病 的诊断方法：肛门拭子法1、透明胶纸法 2、棉签拭子法注意：蛲虫卵检查时间清晨便前二、成虫检查诊断：蛲虫病时间：晚间，小孩熟睡后（哭闹时）,2019/5/2,25,2019/5/2,26,第三节 血液及骨髓检查,在我国血液、骨髓内的寄生虫主要有： 疟原虫、丝虫、杜氏利什曼原虫一、血中疟原虫检查 （一）采血1、采血时间：Pv、Pm：发作后数小时 十几小时Pf ：发作后马
8、上采血,2019/5/2,27,2、采血部位：耳垂指尖（左手无名指为宜）婴幼儿可于足跟采血 （二）涂片厚血膜：（需溶血） 用于流调 薄血膜：（不要溶血）用于临检 各有特点，可结合运用,2019/5/2,28,2019/5/2,29,（三）染色：瑞氏染色 姬氏染色特点：染色快速 染色费时较长血片易腿色 染色效果稳定、色泽鲜明不能长期保存 可长期保存用于：临床检验 教学 （四）镜检：1、是否是疟原虫？(注意与WBC、Pt等区别）2、是哪一种疟原虫？,2019/5/2,30,二、血中微丝蚴（mf）检查（一）厚血膜法：最常用1、采血：（1）采血时间 W.b10PM 2AMB.m 8PM 4AM（2）采
9、血部位：指尖or耳垂（3）采血量：三大滴（60mm3）2、涂片：1.52.5cm2厚血膜3、溶血：,2019/5/2,31,4、染色：品蓝染色德氏苏木素染色5、镜检：是否mf？哪种mf？（二）微孔薄膜过滤浓集法：用于血中mf密度较低者效果更好（三）海群生白天诱出法用于夜间无法采血者,2019/5/2,32,三、骨髓中查杜氏利什曼原虫黑热病诊断髂骨穿刺法：常用特点：安全、可靠骨髓涂片 镜检（M中：无鞭毛体）利杜体,瑞氏or姬氏染色,2019/5/2,33,第四节 排泄物及分泌物检查,一、痰液可能查见： 肺吸虫卵细粒棘球绦虫原头节蛔蚴、钩蚴粪类圆线虫幼虫痢疾阿米巴大滋养体 卡氏肺孢子虫包囊尘螨、粉
10、螨注意：早上起床后，用力咳出气管深部的痰液（晨痰）,2019/5/2,34,（一）肺吸虫卵检查：（除原虫均可用）1、直接涂片法：简便2、浓集法：（可检出率）方法：24h痰液 消化数小时离心 10min 镜检沉渣 （二）卡氏肺孢子虫包囊检查方法：痰液涂片 姬氏染色 镜检,510%NaOH,2019/5/2,35,二、尿液检查：丝虫mf、阴道毛滴虫等埃及血吸虫（来自非洲或中东者） 方法：取尿液35ml 离心 镜检沉渣三、阴道分泌物检查：阴道毛滴虫方法：NS直接涂片法,2019/5/2,36,四、十二指肠引流液十二指肠引流液包括：十二指肠液胆总管液胆囊液肝胆管液用于诊断：贾第虫病、华支睾吸虫病胆道蛔
11、虫病、姜片虫病 肝片吸虫病、粪类圆线虫本法常在临床症状可疑、多次粪检 阴性时（需排除肿瘤时）使用,2019/5/2,37,五、脑脊液（csf）可查见 弓形虫、锥虫痢疾阿米巴棘球蚴的原头节肺吸虫、血吸虫卵广州管圆线虫（幼虫）方法：csf （23ml） 离心镜检沉渣（or 染色后镜检）,2019/5/2,38,六、浆膜腔积液 （一）胸、腹腔积液（取510ml）可查见：弓形虫、丝虫mf、肺吸虫卵、棘球蚴等 （二）鞘膜积液可查见：班氏mf,2019/5/2,39,第五节 活 检,一、皮肤 （一）皮下包块与结节1、囊尾蚴、裂头蚴、并殖吸虫等 包块手术 检获虫体 鉴定2、皮肤型利什曼病：活检病变组织 涂片
12、 切片染色 镜检,2019/5/2,40,（二）疥螨：检查皮损 捉虫方法 针挑法刀刮法（三）蠕形螨透明胶纸粘贴法：常用（四）蝇蛆：皮肤蝇蛆症,2019/5/2,41,二、肌肉 （一）囊尾蚴、裂头蚴、并殖吸虫 检查方法: 同上（二）旋毛虫幼虫疼痛肌肉（腓肠肌or二头肌）压片 镜检（囊包）,2019/5/2,42,三、淋巴结 用于检查：丝虫杜氏利什曼原虫弓形虫 方法：1、穿刺法2、摘除法,2019/5/2,43,四、直肠粘膜 （一）血吸虫卵1、问题：粘膜中发现虫卵能否确诊？为什么？2、虫卵死活鉴别方法 非染色法染色法 3、意义：诊断与疗效考核 （二）痢疾阿米巴大滋养体 病变组织的活检物 镜检or刮
13、拭物,2019/5/2,44,五、肝可查见：痢疾阿米巴血吸虫卵利什曼原虫等,2019/5/2,45,第六节 人工培养,1、原理：阿米巴、利什曼原虫等培养增加其数量检查培养物 诊断2、特点：方法复杂条件要求高费时长因此，临床很少使用,2019/5/2,46,第七节 动物接种与病原分离,病理组织或分泌物 接种(感染) 动物盲传几次病原体生长繁殖数量增加 解剖动物检查 诊断：弓形虫、利什曼原虫等临床很少用：原因同上,2019/5/2,47,II 免疫学诊断,可弥补病原学诊断的不足，因此被 广泛应用。是寄生虫病重要诊断方法。一、原理：寄生虫侵入人体，其本身及代谢产物对人体均是抗原（Ag），因此，人体将
14、产生相应的抗体（Ab）,故可通过免疫学方法检测寄生虫的特异性Ag或Ab来进行寄生虫病诊断。,2019/5/2,48,二、诊断价值：1、可用于寄生虫病的辅助诊断或排除某些寄生虫感染。2、检测寄生虫的特异性抗原或对其Ab滴度进行动态观察结合临床可确诊寄生虫病。,2019/5/2,49,第一节 方法与技术体液免疫检测技术 包括细胞免疫检测技术一、寄生虫抗原的种类整体寄生虫抗原排泄分泌抗原寄生虫粗抗原纯化抗原固相抗原,检测Ab 检测Ag,2019/5/2,50,二、被检测的寄生虫抗体 IgM 是出现最早、持续时间较短的抗体检测特异性IgM具有早期诊断价值IgG 是水平高、持续时间长的抗体特异性IgG是
15、诊断的主要目的抗体抗体水平与感染度及病程呈正相关IgE与IgA,2019/5/2,51,三、方法（多，只简介） (一) 皮内试验：（类似青霉素皮试） (某)寄生虫Ag 皮内 皮肤反应特点：简便快速但多交叉反应用途：临床辅助诊断流行病学调查时初筛,注入,观察,2019/5/2,52,(二) 血清学检查 取材：血清、Csf、尿等1、沉淀试验原理：AgAb结合 产生 沉淀物举例：环卵沉淀试验血吸虫病诊断双向免疫扩散试验2、染色试验用于弓形虫病诊断,2019/5/2,53,3、凝集试验原理：寄生虫Ag 血清中相应Ab结合 载体(RBC)表面结合 AgAb特异反应间接表现 红细胞凝集,2019/5/2,
16、54,优点：操作简便、价格低廉敏感性与特异性均较好常用方法：间接RBC凝集试验胶乳凝集试验,2019/5/2,55,4、免疫标记技术原理：标 记 物标记 已知Ag 已知Ab 测定未知Ab 未知Ag检测标记物 诊断寄生虫病特点：敏感性高特异性亦好 为目前最为理想的免疫学诊断技术，应用广泛。,2019/5/2,56,种类：根据标记物不同，常用的有荧光素(免疫标记技术)酶同位素胶体金酶联免疫吸附试验(ELISA)应用最为广泛。目前，国内外已开发出多种寄生虫病快速ELISA诊断试剂盒用于临床。,2019/5/2,57,第二节 应 用一、临床应用免疫诊断的一般前提：1. 无“离体阶段” 旋毛虫、囊虫病各
17、种幼虫移行症2. 高度怀疑，但（由于各种原因）找不到离体阶段：轻度感染早期感染：卫氏并殖吸虫等慢性和晚期感染：血吸虫、丝虫异位寄生：血吸虫等深部组织寄生：肠外阿米巴病,2019/5/2,58,3、提示性或排除性诊断：例如：颅内占位性病变 痢疾阿米巴 血吸虫 寄生虫 肺吸虫 囊虫 棘球蚴 肿瘤、,原因,2019/5/2,59,二、优点：敏感性高方便易于进行大批量自动化检测特异性较好、快速和无损伤性三、免疫学诊断的局限性（一）假阳性和交叉反应（二）假阴性（三）试剂的标准化（四）结果判断的人为因素影响,2019/5/2,60,四、免疫学检测结果的判断与处理 （一）与流行病学和临床资料相结合 （二）参
18、考免疫反应的滴度 （三）考虑实验中的各种影响因素 （四）进行动态检测和重复检测 （五）参考文献和咨询寄生虫学专家 （六）诊断性治疗,2019/5/2,61,III 核酸(基因)诊断技术,一、概述：它是近年来迅速发展起来的一门新的诊断技术，在寄生虫病诊断和研究中应用越来越广泛。人们预言，21世纪将是分子生物学世纪，因此，本技术将是寄生虫诊断技术的一个发展方向。,2019/5/2,62,二、原理：检测寄生虫特异的DNA 诊断寄生虫病 三、特点：优点：敏感性高（ng、pg级） （Example:Pool-Blood ）特异性强 且有确诊价值。 缺点：费用较昂贵检测条件要求较高。,2019/5/2,6
19、3,四、方法：1、PCR法（聚合酶链反应）原理：寄生虫某一特异DNA序列 PCR 大量扩增 检测 诊断（目前已开发出许多关于遗传病、性病、传染病、寄生虫病的PCR诊断试剂盒用于临床）,2019/5/2,64,2、核酸探针原理：标记特异核酸片段 杂交 探查其对应的互补序列诊断,2019/5/2,65,五、应用：目前主要用于下列寄生虫病的诊断：利什曼病 疟 疾弓形虫病肺孢子虫病锥 虫丝虫病恙虫病,2019/5/2,66,寄生虫标本的固定和保存, 概述意义：通过防止寄生虫虫体发生细胞自溶、腐败、变质或组织干缩等破坏，便于标本的长久保存，以满足诊断或科学研究需要的技术。,2019/5/2,67,（一）
20、固定与保存的一般要求：1、标本越新鲜越好2、根据标本选择相应的固定和保存方法3、记录标本的采集时间、地点及患者姓名,2019/5/2,68,（二）常用固定液1、福尔马林：常用浓度为 510%的甲醛溶液2、酒精：常用浓度为7075%3、其他：甲醇、乙酸、肖氏液氯化汞、聚乙烯醇等,2019/5/2,69, 固定与保存方法,原虫的固定与保存 一、玻片法： （一）腔道原虫：粪便or分泌物 涂片 40的肖氏液 5min 碘酒脱汞70%酒精中保存 （二）组织or血液原虫：组织液or血液 涂片 甲醇固定 染色,立即置于,2019/5/2,70,二、液浸法：用于原虫包囊的保存 粪便+ 5%福尔马林 混悬液 经
21、6080目铜筛过滤 滤液沉淀34h弃上清加5%福尔马林保存,2019/5/2,71,三、低温法 （一）4冰箱：时间不宜超过4h （二）液氮保存：1、保存时间较长2、保持原虫生物学活性,2019/5/2,72,蠕虫的固定与保存 基本过程： 洗涤 （伸展） 固定保存 一、线虫：大型线虫 小型线虫（蛔、鞭） （钩、蛲） 生理盐水洗涤 7080 加热 70%酒精固定 甘油酒精固定 于 70%酒精中保存,2019/5/2,73,二、吸虫大型吸虫 小型吸虫 生理盐水洗涤 薄菏脑酒精(伸展) 玻片压平10%甲醛固定24h5%甲醛中保存,2019/5/2,74,三、绦虫 大型绦虫 小型绦虫 清水洗涤数次 NS洗涤 4,NS浸泡过夜 3%福尔马林固定35h 3%福尔马林固定24h 5%福尔马林保存,2019/5/2,75,四、蠕虫卵水洗沉淀虫卵 去上清沉渣加入等量10%福尔马林固定保存 （如虫卵内为卵细胞or受精蛔虫卵，则需将固定液加热至70。）,2019/5/2,76,昆虫的固定与保存1、干标本保存：（针插法）用途：保存有翅昆虫成虫方法：（昆虫针）针插虫体 插于昆虫盒软木板 旁置o r玻璃管软木塞,樟脑,2019/5/2,77,2、湿标本保存：（液浸法） 用途：保存无翅昆虫及有翅昆虫的卵和幼虫期 处理方法： 昆 虫 70%酒精（6070）固定一天 保存于5%甘油酒精中,
