1、表达载体和特殊用途的载体摘要：目的基因能够有效转入受体细胞，并在其中维持高效表达，很大程度上取决于所采用的载体，载体的改进和新载体的构建是基因工程研究中十分重要的内容。表达载体和特殊用途的载体是在克隆载体的基础上不断发展起来的，其构建原理和构建步骤各有特点，随着载体的发展，表达载体和特殊用途的载体发挥着越来越大的作用。关键词：表达载体 特殊用途的载体 构建原理 构建步骤 应用1 表达载体1.1 表达载体的概念表达载体是可携带 DNA 片段进入宿主细胞进行复制并进行转录、翻译的载体。一般在克隆载体基础上增加了基因表达的调控元件。表达载体的类型很多可分为质粒表达载体、病毒表达载体、人工染色体和可转
2、移表达载体等类型。每种类型中的不同载体又有其不同的适用宿主。1.2 表达载体构建原理1.21 质粒表达载体构建原理和步骤质粒表达载体组成：在以质粒为基本骨架的克隆载体的基础上，组装启动子、转录终止子和核糖体结合位点等表达元件而构建成的。质粒表达载体又可以分为原核表达载体和酵母表达载体。1.211 原核表达载体构建原理和步骤首先，原核表达载体的表达元件主要包括启动子、转录终止子和核糖体结合位点。其中，启动子主要有 lac，trp，tac，T7 噬菌体启动子和 1PL 启动子。根据其表达方式，可分为组成型表达，诱导型表达，融合型表达（表达载体的多克隆位点上有一段融合表达标签(tag)，表达为融合蛋
3、白(N 端融合或 C端融合)，可方便后续的蛋白分离纯化或检测。GST（谷胱苷肽 S 转移酶基因标签或 6His 标签） ，分泌型表达。原 核 表 达 载 体 构 建 原 理 ：1.获 得 目 的 基 因（1）通过 PCR 方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点） ，PCR 循环获得所需基因片段。 （2）通过 RT-PCR 方法：提取总 RNA，以 mRNA 为模板，逆转录形成 cDNA 第一链，以逆转录产物为模板进行 PCR 循环获得产物。2 构 建 重 组 表 达 载 体（1）载体酶切：将表达质粒用限制性内切酶（同引物的酶切位点）进
4、行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用胶回收 Kit 或冻融法回收载体大片段。（2）PCR 产物双酶切后回收，在 T4DNA 连接酶作用下连接入载体。3 获 得 含 重 组 表 达 质 粒 的 表 达 菌 种（1）将连接产物转化大肠杆菌，根据重组载体的标志（抗 Amp 或蓝白斑）作筛选，挑取单斑，碱裂解法小量抽提质粒，双酶切初步鉴定。 （2）测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确,进入下步操作。否则应筛选更多克隆，重复亚克隆或亚克隆至不同酶切位点,（3） 以此重组质粒 DNA 转化表达宿主菌的感受态细胞。典型的原核表达载体：pGEX-4T-1 是 pGEX 系列载体之一，由 pBR322 基本骨架改造而来，带 ampr，在启动子 tac 和多克隆位点之间加入 2 个与表达蛋白分离纯化和检测有关的序列，其一是 GST：其二是凝血蛋白酶切割位点的编码序列，当外源基因插入后，可在大肠杆菌 BL21 菌株中表达，产生融合蛋白。pGEX-4T-1 原核表达载体1.212 酵母表达载体构建原理和步骤由于原核生物和真核生物存在糖基化、酰基化等翻译后修饰反应机制的差异，真核基因的原核表达难以获得有活性的蛋白。酵母成为真核表达的首选系统。
