1、免疫组化显色系统,Visualization Systems of Immunohistochemistry(IHC),免疫组化技术原理,用标记物或显色物标记抗体或抗原 通过免疫学中的抗原与已知抗体反应来检测组织或细胞内的抗原成分 免疫组化染色是一项综合性技术 组织材料的准备 免疫组化染色前处理 免疫组化染色(一抗, 显色系统),免疫组化原理图标注解,一抗 1,一抗 2,抗兔二抗,抗鼠二抗,组织抗原1,抗原2,过氧化物酶,碱性磷酸酶,双染阻断剂,显色剂(棕色),显色剂(红色),葡聚糖骨架分子,回顾过去,直接法,二步间接法,三步间接法,酶免疫复合物法,链亲和素-生物素法(ABC),目前常用的显色
2、系统,一步法: EPOS ( Enhanced Polymer One-Step Staining) 二步法: EnVision Systems 双染: General Doublestain 三步法: LSAB (Labeled Sstreptavidin-biotin) 催化放大系统:CSA (Catalyzed Signal Amplication System) 动物研究试剂盒: ARK (Animal Research Kit),一步法EPOS,原理: 在一抗上通过多聚骨架标记过氧化物酶.即一抗上已标记过氧化物酶. 这种一抗与抗原结合后即可直接显色.,多聚骨架分子,特异性一抗,组织抗
3、原,过氧化物酶,一步法EPOS,主要实验流程,组织片脱蜡,水化,阻断(S2001),TBS冲洗(S1968),一抗/HRP(U),TBS冲洗(S1968),显色剂 DAB或AEC(K3467或K0697),水漂洗,素木精复染(S3309),一步法EPOS,特点: 一抗孵育后直接显色 即用型试剂 快速(一步)完成敏感性较差 昂贵使用对象: 要求快速出结果的免疫组化实验对象,二步法EnVision,原理: 在葡聚糖大分子上标记二抗及酶, 将传统的二抗和三抗(酶)连接在一起,形成一个复合物EnVision. 两步孵育完成免疫组化.,二步法EnVision,原理图,一抗与抗原结合,EnVision二抗
4、复合物与一抗结合,二步法EnVision,主要实验流程,阻断内过氧化酶(S2001),TBS冲洗(S1968),一抗孵育(Mo . Rb.),EnVision(Mo.K4001 Rb.K4003),TBS冲洗(S1968),显色剂DAB或AEC(K3467或K0697),苏木精复染(S3309),TBS冲洗(S1968),二步法EnVision,特点: 二抗及酶通过葡聚糖连成一个大分子试剂(避开了传统的生物素与链亲和素结合), 不受内源性生物素干扰. 即用,方便,快速(两步). 敏感性强. 背景低. 是目前最理想的免疫组化显色系统使用对象 可向所有做免疫组化的用户推荐.,EnVision二步法
5、双染,原理: 与EnVision二步法原理相同, 只是为达到在同一组织上标记两种抗原. 必需用两种动物来源的一抗(常用抗小鼠和兔),分别配相应的EnVision(二抗) , 再用两种颜色的显色剂显色.,EnVision二步法双染,原理图,鼠一抗接抗原1,鼠EnV/HRP接抗鼠一抗,DAB(显色剂1),双染阻断剂,兔一抗接抗原2,兔EnV/AP接抗兔一抗,Fast Red(显色剂2),EnVision二步法双染,主要实验流程,阻断内过氧化酶(S2001),TBS冲洗(S1968),一抗(1 Mo.)孵育,TBS冲洗(S1968),EnVision/HRP( 1 Mo.),TBS冲洗(S1968)
6、,显色剂 1 DAB(K3467),蒸馏水冲洗,双染阻断剂(Kit含),一抗(2 Rb.)孵育,TBS冲洗(S1968),EnVision/AP( 2 Rb.),TBS冲洗(S1968),显色剂 2Fast Read(K0597),蒸馏水冲洗,苏木精复染(S3309),EnVision二步法双染,特点: 即用,方便,快速,省时. 敏感性强. 背景低. 在同一组织切片上, 用两种不同标记物标记两种不同的抗原.使用对象 需在同一张切片上标记两种抗原者主要是形态学科研人员,三步法 LSAB (Labeled Streptavidin-biotin),原理:应用生物素标记二抗与过氧化物酶或碱性磷酸酶标
7、记链亲和素(Streptavidin)的亲和作用, 连接一抗及抗原, 形成大分子.再通过相应酶的底物(显色剂)作用使之显色.,三步法 LSAB (Labeled Streptavidin-biotin),原理图:,一抗与抗原结合,二抗/Bio与一抗结合,STPA/HRP(AP)与二抗/Bio结合,三步法 LSAB (Labeled Streptavidin-biotin),主要实验流程,阻断内过氧(S2001),TBS冲洗(S1968),一抗孵育(Mo . Rb.),TBS冲洗(S1968),TBS冲洗(S1968),二抗/生物素 (Mo.E354 Rb.E353),TBS冲洗(S1968),
8、显色剂DAB或AEC(K3467或K0697) Fast Read(K0597或K0699),苏木精复染(S3309),链亲和素/HRP或AP,蒸馏水冲洗,三步法 LSAB (Labeled Streptavidin-biotin),特点: 便宜 有现成的兔, 鼠, 羊通用试剂盒会有内源性生物素造成的非特异性背景使用对象 可向所有做免疫组化的用户推荐.,催化放大系统CSA (Catalyzed Signal Amplication System),原理在经典三步法免疫组化放大基础上,通过生物素化酪胺的催化,将又一次加入的酶标记链亲和素(Streptavidin-enzyme)与二抗中生物素亲和
9、,使已放大的分子再一次放大.,催化放大系统CSA (Catalyzed Signal Amplication System),原理图,一抗与抗原结合,二抗/Bio与一抗结合,STAV/Bio与 二抗/Bio结合,放大液催化,加入STAV/HRP 与Bio再结合,催化放大系统CSA (Catalyzed Signal Amplication System),主要实验流程:,阻断内过氧(S2001),水洗,TBS冲洗(S1968),二抗孵育(Rb a-Mo/Bio),TBS冲洗(S1968),放大液(Kit含),链亲和素/生物素 Strep./Bio (Kit含),TBS冲洗(S1968),显色剂
10、DAB或AEC(Kit含),苏木精复染(S3309),链亲和素/过氧化物酶 Strep./HRP(Kit含),蒸馏水冲洗,蛋白阻断剂(Kit含),一抗孵育(Mo),TBS冲洗(S1968),TBS冲洗(S1968),TBS冲洗(S1968),催化放大系统CSA (Catalyzed Signal Amplication System),特点: 敏感性极强实验步骤较多 较贵使用对象: 需做免疫组化实验者, 特别适用于某些石蜡片不易出结果的一抗.,动物研究试剂盒 ARK (Animal Research Kit),原理在一抗与组织抗原反应之前: 小鼠一抗F(c)与生物素化抗小鼠F(ab)片断结合,
11、再加入小鼠免疫球蛋白, 中和未被结合的生物素化抗小鼠F(ab). 用该复合物再与小鼠组织中特异抗原反应, 可降低非特异性背景.,动物研究试剂盒 ARK (Animal Research Kit),原理图,小鼠一抗,抗小鼠Ig F(ab)/Bio,免疫复合物/Bio和游离 抗小鼠Ig F(ab)/Bio,免疫复合物/Bio和游离 抗小鼠Ig F(ab)/Bio,小鼠Ig,免疫复合物/Bio和被中 和的抗小鼠Ig F(ab)/Bio,与组织抗原结合按LSAB法继续免疫组化染色,动物研究试剂盒 ARK (Animal Research Kit),主要实验步骤,一抗与组织抗原反应之前需做试剂的预处理:
12、,小鼠一抗 + 抗小鼠Ig的F(ab)/Bio,复合物 1,复合物 1 + 小鼠Ig,复合物 2 (已优化的一抗),用复合物2作为一抗同LSAB三步法免疫组化染色,动物研究试剂盒 ARK (Animal Research Kit),特点小鼠一抗在小鼠组织切片上做免疫组化可降低背景.使用对象需用小鼠一抗做小鼠组织的免疫组化实验者.,几种显色系统复杂与敏感性比较,目前最实用的显色系统,EnVision SystemEnVision+ /Mo (K4000 K4001 GK400105) EnVision+/Rb (K4002 K4003 GK400305) EnVision Mo/Rb HRP (k1390 K1392 GK139305) EnVision Mo/Rb AP (K1396 k4016),
