1、参考文献：特异启动子控制的 GhGA20ox1 基因对棉花纤维发育的影响纤维数目的测定方法：从开花后 0-2d 的幼龄中小心取出胚珠，每铃取 3-5 颗，每个单株取 3 个铃，每个株系取三个单株。剥离的胚珠在电镜样品固定液，2.5的戊二醛种室温固定过夜。用 0.lmof 几磷酸盐缓冲液清洗 2 一 3 次，每次 15-30 分钟。用 1%饿酸固定液固定 lhr，然后用双蒸水漂洗 4 次，每次 15 一 30min。再用 2%单宁酸缓冲液固定过夜，单宁酸能与饿酸结合增加电子反差，增加更多的饿酸分子与样品分子的结合。用双蒸水将固定过夜的样品漂洗 4 次，每次 15 一 30min。再用1%饿酸固定
2、液固定 lhr，双蒸水漂洗 4 次，每次 15 一 30min。依次在50%、 70%、 80%、100% 的乙醇中进行逐级脱水，每级停留 lh;左右，在 100%乙醇中重复一次。采用叔丁醇乙睛干燥法干燥:75% 叔丁醇中处理 20min;100%叔丁醇中处理 10min;叔丁醇:乙睛(2:l) 中处理 10min;叔丁醇:乙睛(1:l) 中处理 10min;100%乙睛中处理 10min。离子溅射镀膜，然后在 HITACHIS-3000N 型扫描电镜上观察照相。纤维长度的测定：分别选取开花后 2d、3d、5d、10d、12d、16d、20d、25d 的棉铃，每个株系随机选择 5 个单株，每株
3、取 3 个铃，每个铃取 5 粒种子，放置在三角瓶中加水煮沸 5min，然后将种子取出，sd 以后的放置在自制的带有刻度的培养皿中，用梳子和针梳理附着在种子上的纤维，进行长度测量，计算平均值作为对应时期的纤维长度。Zd 和 3d 的采用前面纤维计数的方法，在血球计数板上测其长度，求平均值。参考文献：E6 和 FBP7 启动子特异启动的 iaal 基因对棉花纤维发育的影响纤维数目测定：开花当天纤维数目：扫描电镜观察选择开花当天(oDPA)的胚珠进行扫描电镜的常规制样，参考洪涛主编 (1980)的生物医学超微结构与电子显微镜技术方法以对胚珠表面的纤维原始体产生情况比较观察。具体方法如下:从开花当天
4、(0DPA)的幼铃中小心取出胚珠，每铃取 6 粒，每个单株取 3个铃。剥离的胚珠在电镜样品固定液，2.5%的戊二醛中室温固定过夜。然后用0.lmol/L 磷酸盐缓冲液(Ph7.4)4清洗 2 一 3 次，每次 15min。再用 1%饿酸固定液 4固定 111，然后双蒸水漂洗 4 次，每次 15min。再用 2%单宁酸缓冲液4固定过夜，单宁酸能与饿酸结合增加电子反差，增加更多的饿酸分子与样品分子的结合。双蒸水将固定过夜的样品漂洗 4 次，每次 15min。再用 1%饿酸固定液 4固定 1h，双蒸水漂洗 4 次，每次 15min。依次在30%、 50%、 60%、70%、 80%、90%、100%
5、的乙醇中进行逐级脱水，每级停留15min 左右，在 100%乙醇中重复一次。采用叔丁醇一乙睛干燥法干燥:75%叔丁醇中处理 20min;100%叔丁醇中处理 10min;叔丁醇: 乙睛(2:1) 中处理 10min;叔丁醇:乙睛(1:1)中处理 10min;100%乙睛中处理 10min。离子溅射镀膜，然后在HITACHIS 一 3000N 型扫描电镜上观察照相。成熟纤维数目的测定取干燥的冀棉 14 籽棉 20 粒用于纤维计数。经手工剥绒后，将纤维置于称量室中放置多日，以平衡湿度和温度。采 xs105DualRange(METTLER)天平准确称取 20 粒籽棉的纤维重量。并从中随机分出 3 束约 1.00mg-1.50mg 纤维，精确称重。将每束纤维扎好后，于蒸馏水中沸煮 10min，自然冷却到室温后转入 45%冰醋酸溶液中浸泡。取出纤维束，吸取部分水分，用锋利的剪刀从纤维束中段剪取 1-2mm 小段。在洁净的载波片上将截段均匀分散于 20uL/滴的 6 滴 45%冰醋酸溶液中，用镊子轻敲纤维束，让纤维均匀分散于醋酸溶液。快速利用体视镜在仅有侧光源的情况下，以 l X l X 0.63 的放大倍数拍照。每束纤维取 3 个截段重复拍照 3 次，计数成熟纤维数目，以三次重复的平均数换算获得每粒种子着生纤维数目
