1、合肥师范学院新开实验项目试做报告单位名称： 生命科学系 试做日期： 2015 年 1月 7 日新开实验项目名称用 ELISA试剂盒快速测定食物中链霉素学 时 数 4面 向 专 业 2012级 食品质量与安全 试作教师签 名 张方艳一、实验目的、要求理解链霉素 ELISA试剂盒在蜂蜜、牛乳动物肌肉和肝脏中链霉素检测的现实意义；学会使用链霉素 ELISA试剂盒。二、实验原理本方法是应用抗原抗体反应原理，采用竞争抑制法构建的一种 ELISA试剂。在预包被有在抗链霉素抗体的微孔反应孔内，依次加入链霉素酶标记物、链霉素标准液或样品溶液，然后孵育一定时间，则游离链霉素与链霉素酶标记物竞争链霉素抗体结合位点
2、（竞争性酶免疫分析） 。没有结合的链霉素酶标记物在洗涤步骤中被除去。将酶基质（过氧化脲）和发色剂（TMB）/四甲基联苯胺）加入到微孔中并且孵育一定时间。结合的链霉素酶标记物将无色的发色剂转化为蓝色的产物。未显色孔为阳性，显色孔为阴性。检测过程中设置阴性对照、阳性对照或空白对照。可通过目测对比颜色变化进行定性判读，也可加入终止液后使颜色由蓝色转变为黄色，读取在450nrn 处的 OD值（选择参比波长 600nm） ；或直接在 630nm处读取 OD值。OD值与样品中的链霉素浓度成反比。 三、实验所用主要仪器、试剂及材料主要仪器：恒温箱、单道微量移液器，塑料吸嘴，洗瓶，酶标仪，洗板机试剂：链霉素
3、ELISA试剂盒（过氧化脲，发色剂（TMB）/四甲基联苯胺）材料：牛乳、蜂蜜、猪肝脏四、操作步骤：1、将所需试剂从冷藏环境中取出，置于室温（2025）平衡 30min以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀。2、取出需要数量的微孔板，将不用的微孔放入自封袋，保存于 28。3、洗涤工作液在使用前也需回温。4、编号：将样品和标准品对应微孔按序编号，每个样品和标准品做 2孔平行，并记录标准孔和样品孔所在的位置。5 加标准品/样品：加标准品/样品 50ml/孔到对应的微孔中，然后加入链霉素抗试剂 50ml/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置 25避光环境中反应 30min。6、洗板：小心揭开盖板膜，将孔内
4、液体甩干，用洗涤工作液 300ml/孔，充分洗涤5次，每次间隔 30s，用吸水纸拍干（拍干后未被清除的气泡可用未使用过的枪头戳破） 。7、加酶标物：加入链霉素酶标物 100ml/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25避光环境中反应 30min，取出重复洗板步骤 6。8、显色：加入底物液 A液 50ml/孔，再加底物液 B液 50ml/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置 25避光环境中反应 1520min。9、测定：加入终止液 50ml/孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于 450nm处（建议用双波长 450/630nm检测，请在 5min内读完数据） ，测定每孔 OD值。(若无酶标仪，则不加终止液用
5、目测法可进行判定)。五、实验结果记录与判定：未显色孔为阳性，显色孔为阴性六、思考题1、ELISA 试剂盒在蜂蜜、牛乳及猪肝脏中中链霉素检测时。是如何保证灵敏度和特异性的？试做实验小结预实验选用的实验材料是猪肝脏，实验结果有无色没有转变为蓝色，说明所选材料中不存在链霉素。开出注意事项1、室温低于 20或试剂及样品没有回到室温（2025）会导致所有标准的 OD值偏低。2、在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会出现标准曲线不成线性，重复性不好的现象。所以洗板拍干后应立即进行下一步操作。3、每加一种试剂前需将其摇匀。4、反应终止液为 2M硫酸，避免接触皮肤。5、不要使用过了有效日期的试剂盒；也不要使
6、用过了有效期的试剂盒中的任何试剂，掺杂使用过了有效期的试剂盒会引起灵敏度的降低；不要交换使用不同批号试剂盒中的试剂。6、储存条件保存试剂盒于 28，不要冷冻，将不用的酶标板微孔板放进自封袋重新密封。标准物质和无色的发色剂对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下。7、试剂变质的迹象发色试剂有任何颜色表明发色剂变质，应当弃之。0 标准的吸光度（450/630nm）值小于 0.5（A450nm0.5）时，表示试剂可能变质。8、在加入底物液 A液和底物液 B液后，一般显色时间为 1520 min 即可。若颜色较浅，可延长反应时间到 30min（或更长） ，但不得超过 40min。反之，则减短反应时间。9、
7、链霉素快速检测试剂盒最佳反应温度为 25，温度过高或过低将导致检测吸光度值和灵敏度发生变化。院（系、部）验收组审查意见 院（系、部）负责人签字：1、一些不法商贩为了防止辣椒久置变色、失去光泽，而采用一种人工合成的红色物质，使辣椒具有鲜亮的色泽。请问这种这种物质是什么？快速检测该类物质的原理是什么？2、下列 不是水溶性非食用色素得快速检测方法。 （ ）A、盐酸萘乙二胺 B、脱脂棉染色法C、羊毛染色法 D、罗丹明 B法3、亚硝酸盐的快速检测方法是 。 （ ）A、盐酸萘乙二胺 B、脱脂棉染色法C、羊毛染色法 D、罗丹明 B法2008 年中国出现毒奶粉事件。事件起因是很多食用三鹿集团生产的奶粉的婴儿被发现患有肾结石，随后在其奶粉中被发现化工原料三聚氰胺。该事件造成 39,965 个婴儿不同程度的病症，该事件亦重创中国制造商品信誉，多个国家禁止了中国乳制品进口。请问三鹿集团向奶粉中加入三聚氰胺的目的何在？针对三聚氰胺的快速检测法方法有哪些？分别基于什么原理？
