1、实验二 酶活力测定方法的研究生物 122 吕越 1203070208一 研究背景及目的酶是具有生物催化功能的高分子物质。在生物体内，酶发挥着非常广泛的功能，而酶的活性则是影响各种酶功能的一个重要的指标。对于此次研究对象小麦来说，种子萌发过程中淀粉酶的活性更是与糖化力、麦种的优劣有着极其密切的关系 1。本次试验旨在完成禾谷类种子-小麦萌发过程中淀粉酶活力的测定并分析测定结果的合理可信与否。二 原理淀粉酶是水解淀粉的糖苷键的一类酶的总称。禾谷类种子的萌发时可快速将支链淀粉转变成葡萄糖，由此我们推断禾谷类种子中存在不止一种淀粉酶。通过阅读资料 2，整理出如下表格：催化机理 合成时期 钝化条件-淀粉酶
2、 内切酶，可以水解淀粉内部任何部位的 -1,4-糖苷键种子萌发过程pH3.6 以下-淀粉酶 外切酶，从淀粉的非还原末端依次水解一个个麦芽二糖，但不能越过已经存在的 -1,6-糖苷键继续切割种子形成时 高温在萌发的种子中，这两种淀粉酶同时存在。想要测定其中一种酶的活性，就要设法钝化另一种酶。 该实验的总体思路为精确控制酶促反应的条件，保持其处于最适条件，测定酶促反应的初速度来表示酶的活力。通过 3,5二硝基水杨酸比色法确定催化产麦芽糖的含量。三 仪器与试剂1.仪器：低速离心机（飞鸽牌，TDL-40B，上海安亭科学仪器厂）722 分光光度计（上海分析仪器总厂）；40水浴锅（DK-S24，上海精宏实
3、验设备有限公司）；70水浴锅（电热恒温水浴锅，天津市中环科技开发公司）；架盘药物天平（HCTP12A1，北京医用天平厂制）；微量可调手动移液器(大龙牌)；具塞试管（15ml）;研钵；50ml 容量瓶；100ml 容量瓶。2.试剂：pH 5.6 的柠檬酸缓冲液；3,5-二硝基水杨酸溶液;麦芽糖标准液（1mg/ml）；0.4M NaOH；试剂甲；试剂乙；牛血清蛋白标准液（250g/ml）3.材料：萌发的小麦种子（苗长约 1cm）四 实验步骤1. 样品制备称取 2 克萌发的小麦种子（芽长一厘米左右），置于研钵中加少量石英砂、蒸馏水，研磨成匀浆，少量多次转移到 50ml 容量瓶中至 40ml 左右，浸
4、提 15-20 分钟，用蒸馏水定容到刻度，混匀后 3500 转/分离心 20 分钟，取出上清液备用。2. 蛋白含量测定2.1 标准曲线的测定管号 F1 F2 F3 F4 F5 F6250g/mL BSA (mL) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0dH2O (mL) 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0试剂甲 上方试剂加入后同时加入，各 5mL，混匀，室温至少反应 10 分钟试剂乙 同时加入各 0.5mL，立即混匀，室温反应 30 分钟开始测量，2 小时内结束测量用分光光度计在 650nm 波长下进行比色，记录消光值，2.2 蛋白质样品的测定管号 Y1 Y2-1 至 Y2-3 Y
5、3-1 至 Y3-3 Y4-1 至 Y4-3 Y5-1 至 Y5-3 Y6-1 至 Y6-3待测液 (L) 0 50 100 200 400 800dH2O (L) 1000 950 900 800 600 200试剂甲 上方试剂加入后同时加入，各 5mL，混匀，室温至少反应 10 分钟试剂乙 同时加入各 0.5mL，立即混匀，室温反应 30 分钟开始测量，2 小时内结束测量用分光光度计在 650nm 波长下进行比色，记录消光值。根据标准曲线，进行结果计算。3. 酶活测定3.1 -淀粉酶活性的测定：-1 -2 -3 -4 试管编号测定管 对照管酶提取液 各 1ml，在 70水浴中准确加热 15
6、min（使 -淀粉酶钝化），取出后立即在冰浴中冷却pH 5.6 的柠檬酸缓冲液各 1ml，然后再 40恒温水浴中准确保温 15min0.4M NaOH 溶液 各 4ml将试管至于 40恒温箱水浴 15min淀粉溶液 各 2ml，混匀，立即置于 40水浴中准确计时 5min0.4M NaOH 溶液 加入 4ml各取 1ml 反应以后的溶液，放入 15ml 具塞刻度试管中3,5-二硝基水杨酸各 1ml，摇匀，在沸水浴中准确保温 5min，取出冷却蒸馏水 将每支试管中的溶液稀释到 15ml，混匀3.2 -淀粉酶及 -淀粉酶总活性的测定：取酶液 5ml，放入 100ml 容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度。
7、Z-1 Z-2 Z-3 Z-4 试管编号测定管 对照管酶提取液、pH 5.6 的柠檬酸缓冲液每个试管，两种液体各 1ml，在 40恒温水浴中准确保温 15min0.4M NaOH 溶液 各 4ml淀粉溶液 各 2ml，混匀，立即置于 40水浴中准确计时 5min0.4M NaOH 溶液 加入 4ml各取 1ml 反应以后的溶液，放入 15ml 具塞刻度试管中3,5-二硝基水杨酸各 1ml，摇匀，在沸水浴中准确保温 5min，取出冷却蒸馏水 将每支试管中的溶液稀释到 15ml，混匀试剂试剂3.3 麦芽糖的测定：a. 标准曲线的制作：管号 B-1 B-2 B-3 B-4 B-5 B-6 B-71m
8、g/ml 麦芽糖标准液(ml)0 0.1 0.3 0.5 0.7 0.9 1.0dH2O(ml) 1.0 0.9 0.7 0.5 0.3 0.1 03,5-二硝基水杨酸（ml）各 1ml，混匀，沸水浴 5min，冷却，用蒸馏水稀释至 15ml，混匀（使还原糖与之反应生成红棕色产物，用于测定吸光度）取出冷却后，蒸馏水稀释到 15ml。用分光光度计在 520nm 波长下进行比色，记录消光值，根据标准曲线，进行结果计算。b. 样品的测定：对照管 测定管管号-1 -2 -3 -4 Z-1 Z-2 Z-3 Z-4处理后溶液（ml）各 1ml3,5-二硝基水杨酸（ml）各 1ml，混匀，沸水浴 5min，
9、冷却，用蒸馏水稀释至 15ml，混匀（使还原糖与之反应生成红棕色产物，用于测定吸光度）取出冷却，用蒸馏水稀释至 15 毫升，混匀，用分光光度计在 520nm 波长下进行比色，记录消光值，根据标准曲线，进行结果计算。注意：标准曲线的制作和样品的测定应同时进行，即各管应同时放入和取出沸水浴。五 数据整理与结果计算1. 蛋白含量测定1.1 标准曲线的制作BSA 浓度(g/mL) 0 50 100 150 200 250OD650 0.000 0.139 0.269 0.396 0.487 0.5860 50 100 150 200 250 3000.000_0.200_0.400_0.600_0.8
10、00_OD650Linear (OD650)Folin-酚法测定蛋白质含量标准曲线BSA浓度(g/mL)OD650直线方程为 y = 0.0025x1.2 样品蛋白质含量测定管号 Y1 Y2-1 至 Y2-3 Y3-1 至 Y3-3 Y4-1 至 Y4-3Y5-1至 Y5-3Y6-1至 Y6-3待测液 (L)0 50 100 200 400 800dH2O (L) 1000 950 900 800 600 200试剂甲 上方试剂加入后同时加入，各 5mL，混匀，室温至少反应 10 分钟试剂乙 同时加入各 0.5mL，立即混匀，室温反应 30 分钟开始测量，2 小时内结束测量0.134 0.14
11、1 0.132 0.269 0.274 0.260 0.517 0.512 0.469OD650 0.000 0.136 0.268 0.499此浓度下光度计示数已经超过范围，没有继续测的必要其中第二组数据合理准确，所以选用第二组的数据计算。代入数据求得稀释后的浓度为 107.2g/mL，第二组稀释 10 倍，所以稀释前的浓度为 1.072mg/mL。2. 淀粉酶活力测定1) 麦芽糖标准曲线的制作麦芽糖浓度(g/mL) 0 100 300 500 700 900 1000OD520 0.000 0.048 0.202 0.343 0.494 0.642 0.707 0 200 400 600
12、800 1000 12000.000_0.500_1.000_OD5203,5-二硝基水杨酸测定麦芽糖含量标准曲线麦芽糖浓度(g/mL)OD5202) -淀粉酶活性的测定-1 -2 -3 -4试管编号对照管 测定管OD520 0.365 0.366 0.470 0.463麦芽糖浓度（mg/ml）0.52142 0.52286 0.67143 0.66143平均麦芽糖浓度（mg/ml）0.52214 0.666433) -及 -淀粉酶总活性的测定Z-1 Z-2 Z-3 Z-4试管编号对照管 测定管OD520 0.041 0.045 0.310 0.312麦芽糖浓度（mg/ml）0.05857 0
13、.06429 0.44286 0.44571平均麦芽糖浓度（mg/ml）0.06143 0.44429由于这组是稀释二十倍之后的结果，所以实际的麦芽糖浓度为 1.2286,8.8858.本次试验计算淀粉酶活力以及比活的公式是：-淀粉酶活性（毫克麦芽糖克-1 鲜重分钟-1）（U）（ A-A） 样品稀释总体积样 品重 （ ） 55 8（-）淀粉酶总活性（毫克麦芽糖克-1 鲜重分钟-1） （U）（ B-） 样 品稀 释总 体 积样 品重 （ ） 5 8：淀粉酶测定管中的麦芽糖浓度；： 淀粉酶对照管中的麦芽糖浓度； ：及 淀粉酶总活性测定管中的麦芽糖浓度；： 及 淀粉酶总活性对照管中的麦芽糖浓度 酶的
14、比活=淀粉 酶 的活性蛋白 质 的 总 含量蛋白质总含量为 50/2=26.8mg/g1.072-淀粉酶活性（毫克麦芽糖克 -1鲜重分钟 -1） 5.7716（-）淀粉酶总活性（毫克麦芽糖克 -1鲜重分钟 -1） 306.288-淀粉酶比活（克 -1鲜重分钟 -1） 0.2154（-）淀粉酶总比活（克 -1鲜重分钟 -1） 11.428六 思考题及质疑:1、完成这次小小的蛋白含量测定实验从设计到实施完成的自我经验历程及感悟的总结。这是我人生中的第一个和同学一起自主设计，自己动手完成而不经实验参考书的指导和老师给的资料的参考完成的实验。说实话，刚开始要对着自己和同学写出来的表格作参考加试剂的时候
15、有一点不自信，总觉得我们设计的东西会不会有纰漏啊什么的。可是到后来发现我们测出了符合精度要求的数据，老师说我们的数据不错的时候，心里还是很开心的。在未来的日子里总是要不停面对一个人处理问题的情况，这次实验教会我要自信、要细致、才能更好的完成未来的生活带来的挑战。2、从你们组酶活测定的实验结果判断本次实验设计的酶活测定样品稀释倍数是否合理？为什么？稀释倍数合理。因为酶催化产生的麦芽糖含量通过稀释，正好能够在朗伯比尔定律要求的范围内。稀释过高过低都不利于我们的数据准确性。3、查询资料可知众多测定淀粉酶活力的实验设计中一般均是采取钝化- 淀粉酶的活力而测- 淀粉酶和测总酶活力的策略，为何不采取钝化-
16、 淀粉酶活力去测- 淀粉酶活力呢？这种设计思路说明什麽？钝化- 淀粉酶只需将试剂放入水浴锅加热，不会加入试剂影响溶剂的成分。而钝化- 淀粉酶则需加入试剂，溶液的 pH 与体积有关，当需要对溶液进行稀释时，不易控制。4、- 淀粉酶活性测定时 70水浴为何要严格保温 15 分钟？保温后为什么要立即于冰浴中骤冷？而经如此处理，为什么在随后的 40温浴和酶促反应中就能保证-淀粉酶不会再参与催化反应？严格保温 15 分钟是为了使 -淀粉酶钝化，而保持 -淀粉酶的活性正常。若时间过短，则可能导致 -淀粉酶钝化不彻底，若时间过长则可能影响 -淀粉酶的活性。骤冷是为了防止 -淀粉酶在短时间内复性，以保证在接下
17、来的实验过程中，起到催化作用的只有- 淀粉酶。5、酶的最适反应温度（一般都是生理温度）和最适保存温度（一般 0以下）为什么不一样？而这两个状态都是需要维护酶的空间结构。最适反应温度是酶活性最强的温度，此时酶的构型最灵活，但同时热运动也最剧烈，分子最不稳定。这并不适于保存酶，为了保持酶的结构稳定，一般的处理方式是低温，使其活性降低而不至于结构改变，同时降低其热运动频率，从而能够在回复温度后保持活性。6、为什么 3，5-二硝基水杨酸与还原糖的反应要先沸水浴然后再稀释测定？一般情况下，对于化学反应来说，反应物浓度越大，反应越完全。较高浓度下，需要发生反应的分子之间距离较小，接触机会大，反应彻底。而比
18、色法要求的溶液颜色不能过深，所以就先在高浓度下使反应发生，然后再稀释至比色法所允许的浓度范围来测定麦芽糖的含量，使结果更为准确。7、有人认为本实验中可以用对照管调分光光度计的 100%T 从而获知测定管的 OD值，你的观点呢？为什麽？你认为本实验中设计的对照管与比色法测定物质含量实验中设计的空白管有何异同？我认为不能用对照管调分光光度计的 100%T 从而获知测定管的 OD 值。因为对照管中含有麦芽糖，如果以对照管为空白，测量的体系就与标准曲线不同，这样标准曲线就失去了参考的意义。对照管和空白管的设定都是为了排除其他物质的干扰，但是对照管需要排除非测定时间段内所产生的作用产物，而空白管则是为了
19、排除非测定物质在特定波长下的光吸收。所以两管目的不同、组成不同、作用不同，不能互换。8、在设计酶活测定的实验时，要求酶促反应初速度对底物浓度的小量变化不敏感，具体数理要求为：在底物浓度有 10%的变化幅度范围内，而所测初速度的变化幅度小于 1%。则S/KM 应该大于多少才能保证这一点？（设定为米氏酶）9、转氨酶在细胞内的作用及生理意义？细胞内有众多的转氨酶，但相关研究及医学临床应用中却几乎都是只检测谷丙转氨酶（GPT）和谷草转氨酶（GOT）的活力，而极少测定其它转氨酶活力，你推测可能的原因会是什么？为什么？转氨酶是催化氨基酸与酮酸之间氨基转移的一类酶,参与氨基酸的分解和合成。而其中谷丙转氨酶（
20、GPT）和谷草转氨酶（GOT）是最重要的两种。GPT 催化谷氨酸与丙酮酸之间的转氨作用，丙酮酸是糖酵解的最终产物，可转化成多种物质继续供能；GOT是催化谷氨酸与草酰乙酸之间的转氨作用，草酰乙酸是 TCA 循环中重要的一环，还是糖异生的中间产物。它们在能量代谢中起重要作用，也是人体最活跃的转氨酶。所以测定这两种转氨酶的活性基本上就可以反应人体转氨酶的活性。七 实验小结这一次实验依旧很高效有序。我和我的队友选择在吃饭前完成蛋白质溶液的配置，利用吃饭时间让试剂反应显色，这样就节省了反应的时间。所以我们这次又快又好的完成了任务，心情十分愉悦。不过在此要承认一个错误就是老师放我们先去吃饭再回来打扫卫生可是我吃过饭居然就忘记了，直到上晚上的课了才想起来，实在是罪过，还好我勤劳的好队友帮我完成了任务，我下次实验一定把值日补回来 _ 。 八 参考文献1.金玉红, 张开利, 张兴春, 等. 制麦过程中小麦淀粉含量及淀粉酶活力变化研究J. 酿酒, 2005, 32(1): 65-67.2.中国农业大学生物学院 生物化学实验指导 实验二、酶活力测定方法的研究 p16-19
