1、LC-MS/MS 同時分析食品中九種人工甘味劑- ESI-MS/MS 參數條件之建立許宸 *台灣大學農業化學系四年級一、實驗目的隨著生活品質提昇，為了享受美食、增加口感及講究健康苗條，人工甘味劑已被廣泛使用於各類食品中作為砂糖替代品，因其具有甜度高、熱量低及價格便宜之優點，且適當的人工甘味劑混合使用，常有特殊加成效果。但是這些人工甘味劑對人體的安全性仍備受爭議。醋磺內酯鉀的甜度為蔗糖的 160 倍，沒有熱量，對熱安定，一般使用無殘留味，但在高濃度添加使用時會有輕微的餘味；與其它人工甘味劑共同使用時，有相乘效果；糖精難溶於水可溶於乙醇，糖精鈉則易溶於水，對熱安定，食用時具有一點持續性的苦味，進入
2、人體後在腸道被吸收，但不被人體所利用，直接由尿液排出體外；賽克美甜度為蔗糖的 30 倍，因可能是癌症促進劑，因此在美國、日本及香港是禁用，但 WHO 及歐盟國家都認為是安全食品添加物，仍准許使用，為避免糖精、賽克美使用過量，對人體造成不良作用，因此衛生署訂有使用範圍及限量標準，另外甘精因對肝臟及消化道有致癌性，目前已被禁止使用。甜菊糖自南美洲發跡，目前在美國廣受歡迎，因為甜菊糖和不同的人工甘味劑混合使用可產生不同的甜味。 目前國家法律規範食品中添加人工甘味劑乃是依照正面表列原則，並且在不同的食品中添加人工甘味劑的限量並不相同。因此，能夠高零敏度的同時分析食品中的人工甘味劑高靈敏度， 早期以薄層
3、層析法鑑別飲料中糖精、賽克美。近年來多以高效液相層析法同時檢測數種人工甘味劑，然而此種方法只適合檢測某些甜味劑。分析食品中人工甘味劑大多是使用高效液相層析儀分離，也可以使用離子層析法或毛細管電泳法將食品中人工甘味劑分離；紫外線吸收檢測器或 ESI-MS等儀器都被用來檢測人工甘味劑。雖然利用上述方法可將人工甘味劑分離及檢測，但是不同的人工甘味劑其物理、化學及光譜特性皆不相同，導致難以同時檢測多種人工甘味劑，此外人工甘味劑都是屬於高強度的甜味劑，在食品中相當微量，因此有必要開發一種靈敏度高的分析方法。本研究之目的在於建立以液相層析串聯質譜儀法(HPLC/ESI-MS/MS)同時分析食品中九種人工甘
4、味劑。本實驗利用 ESI-MS/MS 直接進樣法，建立九種人工甘味劑之母離子、子離子和 MS 相關之參數，以利之後進行研究之用。二、實驗原理1. 質譜儀的構造與原理 質譜法是一個測帶電離子（ion）的方法，圖一為基本的硬體組成元件，當分析樣品進入質譜儀後，首先在離子源使分析物進行游離化（ionization）以轉換為氣相的帶電離子，進入質量分析器後，在電場、磁場等物理力量的作用下，偵測器可測得不同離子的質荷比(mass-to-charge ratio ，m/z ） ，便可從電荷推算出分析物的質量。 2. 游離源-電噴灑游離法（electrospray ionization ， ESI）分析物溶
5、液經由施加高電壓的毛細管流出時，高壓電產生的電場會造成溶液中的正負離子分離；以施加正電場的的毛細管為例，正電荷離子會因為排斥的原理往毛細管出口移動，負離子則遠離液體表面，最後在毛細管尖端累積大量的正電荷離子，而形成類似圓錐的帶電液滴，我們稱之為泰勒錐（Taylor cone） ，此時若加於毛細管的電壓夠大，這些極微小的帶電液滴便會從泰勒錐前端噴灑出來，在帶電液滴受電場進入質譜儀之前，溶劑會在飛行的過程中快速揮發，使得體積快速變小，但是原本液滴中的正電荷數目並不會改變，因此帶電液滴表面的電荷密度會升高，當在液滴表面的電荷間形成的庫倫斥力大於表面張力時，帶電液滴會分裂成更小的液滴，在不斷重複這個過
6、程之後，分析物便會形成帶多價電荷的離子，再進入質量分析器測量其 m/z 值。3. 質量分析器-四極棒質量分析器（quadrupole analyzer）分析物產生氣相離子後，離子即進入質量分析器進行 m/z 的測量。四極棒質量分析器由四根電極所組成，如圖三。兩兩相對於 X 軸及 Y 軸的電極則分別通入相位一樣的正、負直流電，並同時通入交流電壓（無線電頻率） ，在固定的直流電以及交流電壓下，只有一定範圍質荷比的離子可以通過而到達偵測器，其餘的離子則會碰撞到電極棒，失去電荷後被真空系統排出；在一定直流電與交流電壓比值下，不斷加大直流電壓與交流電壓，可掃描不同的質荷比，即可得到完整質譜圖。4. 串聯
7、式質譜法（tandem mass spectrometry ，MS/MS）質譜儀除了質量的測量外，另一種質譜法是利用分析物的碎片段進行質量測量，稱為串聯式質譜法。顧名思義，串聯式質譜儀是由兩個以上的質譜分析器在空間上或時間上聯結在一起，所組成的質譜儀器，當分析物經過離子源游離後，第一段質量分析器可以從混合物中選擇欲研究的離子作為母離子（parent ion） ，經過分離後進入一個碰撞室，以外力（碰撞氣體、光子、電子等）使該母離子進行誘導碰撞解離（CID） ，並產生碎片離子，最後由第二段質量分析器進行碎片離子的質量分析。圖一、質譜儀的硬體組成元件圖二、電噴灑游離法圖三、四極棒質量分析器圖四、串聯
8、式質譜法示意圖三、實驗材料與方法1. 實驗儀器高效液相層析串聯質譜儀(LC-MS/MS) 是 DIONEX Ultimate-3000液相層析系統連結 Applied Biosystems API-3200 質譜儀，離子源採電灑法偵測正副離子，並以 Analyst Software 操控及數據處理。2. 人工甘味劑標準品Acesulfame K，Sucralose，Saccharin，Cyclamate，Aspartame， DulcinGlcyrrhizic acid，Stevioside，Rebaudioside A，Neotame 皆購自德國Sigma-Aldrich 公司，純度為 99
9、.0 %以上，其化學結構式如圖五。圖五、九種人工甘味劑化學式3. 實驗方法(1) 人工甘味劑標準品進樣方法人工甘味劑標準品以甲醇溶解稀釋到 1 ppm，採用直接注入法將樣品注入質譜儀系統中，利用針筒式幫浦以 5 L/min 之流速將樣品注射進入質譜系統中以進行分析，如圖六。圖六、針筒式幫浦將樣品注入質譜儀進行分析(2) Q1 Scan 決定母離子的質荷比調控破碎電壓(Decluster potential，DP)，確定母離子並且調整 DP大小，直到母離子之訊號質最強為止，記錄母離子之 m/z 準確到小數點後一位。參數設定：Parameter Range，30MW + 30 Da ，t = 12
10、secCenter Width，MW 5 Da，t = 0.5sec(3) Product Ion Scan - 確定子離子的質荷比調控碰撞電壓(Collision voltage ，CE)，將母離子撞碎，子離子應選擇訊號強且質荷比盡量接近母離子為主。參數設定：Parameter Range，50MW + 10 Da ，t=12sec(4) Multiple Reaction Monitoring，MRM根據之前選出的母、子離子，建立 MRM 離子對。分別調整每對MRM 離子對之碰撞電壓 (Collision voltage，CE)，直到子離子之訊號質最強為止，記錄子離子之 m/z 準確到小數
11、點後一位。(5) 儀器參數的優化進行完上述步驟，可調整 COMPOUND 項下面的參數，如DP，CE ，EP，CXP 及 CAD 等，進行儀器參數之優化，使分析物感度訊號增加。四、實驗結果與討論1. 實驗數據artificialsweetnersDeclusterpotential (V)母離子 Q1 (m/z)Collisionvoltage(eV)子離子Q3 (m/z)CXPAcesulfame K -33 -20 82 3-33162-40 78 3Sucralose -37 395 -20 359 3-36 397 -21 361 3Saccharin -50 -24.5 66 3-5
12、0182-27 62 3Cyclamate -55 -41 80 3-55178-41 95 3Aspartame -35 -17 261 3-35 -17 275 3-35293-17 217 3180 22 22 323529520 20 3Dulcin -10 -10 178.8 3-10239-18 194.8 3Glcyrrhizic acid -91 -51 351 -25-91821-70 113 -25Stevioside -120 -54 479 -18-120641-60 317 -18Rebaudioside A -145 -50 641 -25-145803-75 47
13、9 -25Neotame 58 35 172 35837927 319 32. 離子源之選擇本實驗參考文獻後，採取電噴灑游離法（electrospray ionization，ESI）進行 MS 條件之建立。3. 母離子之選擇透過 Q1 SCAN 調整破碎電壓(Decluster potential，DP)，確定母離子。母離子，應明顯比周圍的雜訊離子高，通過改變 DP，觀察離子的增減，初步判斷分子離子，如果看不到則可能是濃度太低或離子化方式不合適，或選擇的溶劑體系不合適。母離子選 M+H 或 M-H 最好，有時會有 M+NH4，M+Na等干擾出現。4. 子離子之選擇根據確定的母離子進行 Pro
14、duct Ion Scan，確保所有碎片離子都來自待測化合物，而不是溶液中的雜質。調控碰撞電壓(Collision voltage ，CE) 並且找出較強的碎片離子資訊。子離子要找兩對以上，以便進行分析時定性及定量。進行 Product Ion Scan 時，注意小數點後的位數，選擇子離子應多選幾個離子對，如果之後出現基質干擾時可更換離子對。5. MRM 條件之優化MRM 輸入質量數字要準確，靈敏度才會高，且須調整每一對離子對之碰撞電壓(Collision voltage ，CE)，調整到訊號最強，才完成 MRM 條件之優化。4. 儀器參數之優化建立完成 MRM 後，通過優化儀器參數，使得母、
15、子離子訊號達到一定強度水準，使 MRM 靈敏度最高。可先讓儀器自動優化參數，然後再手動優化，只檢測一對離子時根據 TIC 的強度來確定儀器參數，一次優化多對離子時，要根據每對離子的 XIC 強度來分別確定儀器參數。本實驗藉由調整 CXP使質譜儀訊號優化。五、參考文獻1. 許振霖。2011。液相層析串聯式質譜儀原理及應用。工業技術研究院生醫與醫材研究所，化學藥物工程室。2. 陳惠章、鄭守訓。2009。食品中醋磺內酯鉀、糖精、甘精及環己基(代)磺醯胺酸檢驗方法之探討及市售品調查。藥物食品檢驗局調查研究年報. 27:252-263 2009。3. 陳玉如。2005。質譜技術與蛋白質體學。中央研究院化學研究所，基因體研究中心。
