1、分子标记辅助选育多抗番茄品系摘要 本论文介绍了分子标记育种的研究近况本，实验利用复合杂交技术将含抗叶霉病（Cf-5）、枯萎病（I-1）、根结线虫（Mi-1）、番茄烟草花叶病毒（Tm-2）、番茄黄化曲叶病毒（Ty-2）、成熟抑制基因（rin）的亲本杂交，利用分子标记辅助选择和接种鉴定相结合的方法在杂交后代分离群体中选出具有四个抗性基因的植株，培育具有多抗性的亲本体系，为培育多抗性番茄优良品种做好基础工作。关键词 番茄；分子标记；抗病性；聚合育种番茄(Lycopersicon.esculentum Mill)是世界上重要的蔬菜作物之一，也是保护地内经济效益较高的蔬菜，它适应范围广，分布于世界各地，
2、被列为全世界产量最高的 30种农作物之一。品种多，产量高，具有丰富的营养，富含多种维生素以及多种矿质元素。此外，番茄中含有的番茄红素及胡萝卜素具有抗氧化功能，食用番茄可以预防衰老及癌症等，不仅作为果蔬食用，还可以作为重要的加工原料，有重要的经济价值。但是由于连年重茬种植，病害严重，病害种类已多达 40 多种(杜永臣，1999) ，成为限制其产量和品质的一个重要因素，且造成大面积减产。因此如何提高番茄产量、改进品质、提高抗病性己成为番茄育种的重要课题。1 番茄主要病害及延熟突变研究概况番茄由于营养丰富，香味浓郁，适应性强，较易于栽培，产量高，用途广，因而在世界各地被广泛种植，成为各国的主要蔬菜作
3、物之一。但在生产的过程中，由于病虫害的危害，而造成大面积的减产，严重影响经济效益。1.1番茄抗叶霉病育种研究进展国外很早就有关于抗叶霉病育种研究报道。在加拿大、美国、荷兰、英国等温室番茄生产发展较早的国家，从 20 世纪 30 年代起就开始了番茄抗叶霉病育种的研究。据加拿大的 Langford 报道，在 20 世纪 30 年代初期，几乎所有的温室番茄品种都经过了对叶霉病抗性筛选。1942 年美国的 Cuba 氏发表了第一个抗叶霉病品种 Bay state。欧美国家早期培育的品种有 Stirling Castle、Leaf Mould Resister、V473、V121 、STEP390、Va
4、gabond 等。我国的番茄抗叶霉病育种起步较晚。自 80 年代，随着我国保护地番茄生产的迅速发展，叶霉病的发生日趋严重，引起了我国番茄育种工作者的重视(柴敏，张环等，1995)。1984 年展开抗叶霉病育种研究，到1988 年由北京农林科学院培育出了我国第一个抗叶霉病品种双抗 2 号(含 Cf4 基因)。杜永臣等利用从欧洲、日本等地引进的优良资源材料，经多代复合杂交育成适合保护地栽培的抗叶霉病品种，如中杂 11 号、中杂 9 号等。1.2番茄抗枯萎病育种研究进展番茄抗枯萎病育种研究开始比较早，在 1905 年美国就已经育成 “迈球(Marghbe) ”、“番里加(prichard)”等抗枯萎
5、病品种，它们是多基因支配，具有水平抗性 (王全华，李景富，1996) 。1929 年，在秘鲁采集到的番茄属野生型亚种 L. pinpinellifolium 的另一系统 P.I79522(Missori Accessioniho)上发现了单个显性抗病基因，后来定名为 I 基因，并用它育成世界上第一个垂直抗病性的抗枯萎病品种“全美洲”(pamAmerica)(Porte，1941) 。Stall 和 Walter(1965)从番茄属一野生型亚种(F. Pim pinellifolium)和普通番茄(L. esculeritum)的种间杂交种 P.1126915 中发现了抗病个体，将该基因定名为I
6、-2，利用这个基因最早育成的抗病品种是 Walter 和 Flor-Dade(李发玲等，2010) 。抗病基因 I-3 是来自秘鲁番茄的一个系统 P.1126944，美国研究者用它与栽培番茄杂交育成了稳定的品系 IRB301-30、IRB301-31(王全华，1996)。1.3番茄抗病毒病育种研究进展从 20 世纪 60 年代以来，国外积极开展了番茄抗病毒病育种研究，培育了一批优良的抗性品种。有效控制了病毒病的危害(山川邦夫，1983)。1975 年，我国从美国引入了玛娜佩尔(Manapep)番茄，该番茄对 TMV 病毒可以产生过敏性抗性，并且常表现为广泛性的水平抗性。1979 年西安市农科院
7、郁和平等人，利用玛娜佩尔 (Manapep)和优良的品种杂交，成功育成了性状良好的“矮黄 TM-2nv”番茄品种(张汉卿等，1985)。Ohrnori 等(1996)利用 220 个随机引物对近等基因系进行筛选，找到了 1 个与Tm-1 基因紧密连锁的 RAPD 标记，Motoyoshi(1996)利用近等基因系得到 13 个与 Tm-2 连锁的 RAPD 标记，标记 OPEl6 和 OPN31 与 Tm-2 连锁最为紧密。其中有 6 个标记与其的遗传距离在 0.7cM 之内，并成功的将其中的 4 个标记转化为 SCAR 标记。Pillen等(1996)在 Tm-2a基因周围约 4.3cM 的
8、区域内构建高分辨率的遗传图谱。利用 2112个回交群体，得到 13 个 RFLP 标记和 RAPD 标记，而且 Tm-2a基因两侧最近的标记只相距 0.05cM。 RFLP 标记 R12 与 Tin-2a呈共分离现象。1.4番茄抗根结线虫育种研究进展番茄抗根结线虫病育种研究始于 19 世纪 30 年代，以美国为中心育成了许多抗根结线虫病的品种。20 世纪 40 年代初由 Frazier and Pennett 在夏威夷农业试验场开始抗线虫番茄选育，选育出了 HES4969，HES4846 等品系。到 1974 年已育成对个抗根结线虫病的番茄品种。我国番茄抗根结线虫病育种工作开展较晚，目前没有培
9、育抗线虫病的专用品种。据报道，我国已经筛选出里一批番茄抗根结线虫病的材料，其中对南方根结线虫免疫材料 2 份，高抗材料 4 个，强抗材料 4 个，中抗材料 2 个，并正在加以利用(于秋菊等，1999)。华中农业大学也筛选了一批抗性材料，刘维信等 (2000)报道筛选出 3 份对番茄根结线虫免疫的材料(李红双，2006)。1.5番茄成熟突变体的发现至今发现的成熟突变体有不成熟基因 nor(non-ripening)、成熟抑制基因rin(ripening inhibitor)、永不成熟基因 Nr(never-ripe)、 晚成熟基因 alc(Alcobaca)。nor 基因为单个隐性基因，是由安大
10、略园艺研究所的 Kerr 在 ItalianWinter 番茄中获得(Tigchelaar et al.，1973)，它位于第 10 条染色体上，与位于第 10S-19 的果实均匀着色突变体 u(zniform ripening)紧密连锁（大约 3.5 个遗传单位）。晚成熟基因 alc(Alcobaca)，是一个非正常成熟突变体(Kopeliovitch et al.，1981) ，其不但具有较好的耐贮性，而且成熟果实品质也与正常品种成熟番茄相近，特别是其果色最终能够转变成红色，这对鲜食番茄育种有较高的利用价值(陆春贵等，1994)。alc 首先被 Leal 所描述，发现该基因为单个隐性基因，
11、位于第 10 染色体短臂上(Lobo et al.， 1984) ，与果实均匀着色突变体 u 相距 20 个遗传单位，与纯黄突变体hy(homogeneous yellow)相距 14 个遗传单位，与 nor 相距 17 个遗传单位(Mutschler et al.， 1988)（姚建刚， 2010）。2.分子设计育种研究现状对大多数作物的育种来讲，往往有大量的亲本材料供研究者利用，同时可供选择的杂交组合、选择方法也有成千上万。然而限于试验规模, 传统育种方法往往是要通过相当长的时间，在大量杂交组合中,经过数代乃至十数代的不断筛选，花费大量的时间与精力，才能得到一个稳定的理想基因型或株系，这样
12、就严重影响了育种效率(万建民，2006)。分子设计是国内外农业育种家们结合生物科学技术提出的一种最新的育种技术方法，通过对控制所有重要农艺性状的基因及其变化的研究，选取优良基因进行组合设计与模拟评估，获得具有多种优异表现的最佳基因组合，再借助传统的杂交、DNA分子标记筛选技术，巧妙地将来自不同品种的基因聚合到一个品种中，使其具有最佳的基因组合，从而形成新品种。和传统育种技术相比，分子设计育种更为精确、效率更高( 高科，2007) 。目前，国内已经开始意识到分子设计育种将会成为未来作物育种的发展方向，但大多尚停留在概念上，还没有真正开展分子设计育种的理论建模和软件开发工作(刘勋，2009)。基于
13、我国农业发展的现状，万建民认为我国分子设计育种研究的重点应该集中于三个方面，分别是重要农艺性状基因/QTL 高效发掘；建立核心种质和骨干亲本的遗传信息链接；建立主要育种性状的 GP 模型。育种是人类对野生生物或现有品种进行改造，创造自然界所未有的新品种的过程，其实质是人为干预下的物种进化。几千年来，人类不断的对品种进行改良和培育，发展到现在，育种方法多种多样。分子生物学的发展使人们把这种新的理念和技术引入育种学，扩宽了育种的方法，形成了独特的现在育种学理念和思路。作物分子设计育种将在多层次水平上研究植物体所有成分的网络互作行为和在生长发育过程中对环境反应的动力学行为；继而使用各种“组学”数据，
14、在计算机平台上对植物体的生长、发育和对外界反应行为进行预测；然后根据具体育种目标，构建品种设计的蓝图;最终结合育种实践培育出符合设计要求的农作物新品种。设计育种的核心是建立以分子设计为目标的育种理论和技术体系，通过各种技术的集成与整合，对生物体从基因(分子)到整体( 系统) 不同层次进行设计和操作，在实验室对育种程序中的各种因素进行模拟、筛选和优化，提出最佳的亲本选配和后代选择策略，实现从传统的“经验育种”到定向、高效的“精确育种”的转化，以大幅度提高育种效率。与常规育种方法相比，作物分子设计育种首先在计算机上模拟实施，考虑的因素更多、更周全，因而所选用的亲本组合、选择途径等更有效，更能满足育
15、种的需要，可以极大地提高育种效率。值得指出的是，分子设计育种在未来实施过程中将是一个结合分子生物学、生物信息学、计算机学、作物遗传学、育种学、栽培学、植物保护、生物统计学、土壤学、生态学等多学科的系统工程。3 材料和方法 3.1 材料 实验材料为 11594,11543,11-134，分别含有一到两个抗性基因的纯和自交系。苗期接种鉴定所用的烟草花叶病毒由东北农业大学李景富教授提供；枯萎病病菌、番茄黄化曲叶病病毒、根结线虫和叶霉病病菌由华中农业大学番茄研究室分离保存。3.2DNA 提取与分子标记检测番茄 DNA 的提取参照 CTAB 法（Roger & Bendich，1988），用于检测 Tm
16、-2、I-1、 Mi-1 和 Cf-5 基因标记为本实验室设计。 PCR 扩增的方法参见孙亚林（ 2008）的方法。反应体系为 20 L，包括 ddH2O 15.9 L，10 PCR Buffer 2.0 L，dNTPs 0.5 L， Primer1 0.5 L，Primer2 0.5 L，Taq DNA 聚合酶 0.1 L，模板 DNA0.5 L。 PCR 热循环程序：94 变性 5 min；然后 94 1 min；58 1 min；72 80 s，进行 32 个循环；最后 72 延伸 8 min。PCR 产物用 1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，用凝胶图像分析系统 GDS2 7600（UVP）照
17、相保存。3.3 苗期接种鉴定TMV 病毒接种鉴定：苗期摩擦法接种参考许向阳等（2002a）的方法。当植株 2 3 片真叶时，选取大小一致的植株接种，每株接种 2 片小叶，3 周后记录发病情况，设 3 次重复，每次重复 30 株（对照品种：A53）。TMV 群体抗性分类标准（许向阳 等，2002a）：病情指数 = 0 为免疫；0 病情指数2 为高抗（HR）；2病情指数15 为抗病（R）；15病情指数30 为耐病（MR）；病情指数30 为感（S）。枯萎病菌接种鉴定：番茄枯萎病灌根法接种参考许向阳等（2002a）的方法。当植株 2 3 片真叶时，选取大小一致的幼苗，每株灌根菌液 10 mL，菌液孢子
18、浓度为 107 个 mL-1， 3 周后记录发病情况。设 3 次重复，每次重复 30 株（对照：番茄品种 A53）。I-2 群体抗病性划分标准（许向阳 等，2002a）：病情指数 = 0 为免疫；0病情指数10 为高抗（HR ）；10 病情指数30 为抗病（R ）；病情指数30 为感病（S）。根结线虫接种鉴定：参照前人的方法（许向阳 等，2002b；张绍松 等，2008），在接种前 5 d，用营养液（贝曼漏斗法）无土培养繁殖南方根结线虫至二龄幼虫。根结线虫的接种采用灌根法。当植株 2 3 片真叶时，选取大小一致的幼苗，每株接种 5 000 条。设 3 次重复，每次重复 30 株（对照：番茄品种
19、 A53）。2 个月后将植株连根拔起，用自来水洗净后使用 0.05%的罂红对根结线虫卵块进行染色，以根上是否存在卵块（蓝色）和卵块的数量作抗性评价。根结线虫抗性分级标准（许向阳 等，2002b）：0病情指数（卵块数）25 为抗病（R）；病情指数（卵块数）25 为感病（S）。叶霉病接种鉴定：采用喷雾法接种番茄叶霉病菌（许向阳 等，2002a）。当植株 2 3 片真叶时，选取大小一致幼苗，在植株真叶背面喷雾接种，菌液孢子浓度为 106 个 mL-1， 3 周后调查发病情况。设 3 次重复，每次重复 30 株（对照：番茄品种 A53）。叶霉病群体抗病分级标准（许向阳 等，2002a）：病情指数 =
20、0 为免疫；0病情指数5 为高抗；5病情指数15 为抗病（R ）；15病情指数30 为耐病（MR）；病情指数30 为感病（S）。4 技术路线杂交群体构建F2 代分离群体构建DNA 提取PCR 鉴定 cf-5、I-1 、Mi-1、Tm-2、ty-2、rin 特异引物筛选确定单株 F3 分离群体构建 F4 F5 F6 四抗性自交系5 预期结果利用分子标记辅助选择和接种鉴定相结合的方法在杂交后代分离群体中选出具有四个抗性基因的植株且田间性状表现优良的单株。参考文献1 杜永臣番茄育种研究主要进展园艺学报J ，1999，26(3)：161 1692 安玉兴，徐汉虹. 2001. 植物寄生线虫防治的新策略
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