1、实验五 叶绿体的分离、离体叶绿体的还原活性一、实验目的制备具有活性的离体叶绿体和测定希尔反应活力是研究叶绿体结构功能和光合作用机理的重要技术条件。本实验通过学习分离制备叶绿体的技术方法，加深对希尔反应的理解及对光反应的认识。二、实验原理光合作用机制是一个比较复杂的问题，可分为光反应和暗反应，大致分为三大步骤：（1）原初反应（光能的吸收、传递和转换过程）；（2）电子传递和光合磷酸化（电能转变为活跃的化学能）；（3）碳同化（活跃的化学能转变为稳定的化学能）。光反应中，由水至 NADP+的电子传递是由两个反应中心 PS和 PS经过两种连续光化学反应驱动的，PS的一个重要功能是利用光能使水裂解放氧。2
2、H2O 光子 O2 + 4H+ + 4e-英国生物化学家Hill（1937）首先将离体叶绿体加入有适当氢受体（如草酸高铁钾盐，2,6-二氯酚靛酚，NAD +和NADP +）的水溶液中，照光后即有O 2放出，这就是水的光解，即希尔反应。叶绿体的分离采用离心分级分离，即利用叶绿体的直径和沉降系数与其他细胞器不同的特点，先用低速离心除去细胞碎片，后用高速离心沉降叶绿体。希尔反应活力的测定是将叶绿体加入氢受体，并照光，水被光解放氧，溶液颜色发生变化，通过比色测定。三、实验材料新鲜菠菜叶片。四、设备与试剂分光光度计，离心机，照光装置（2 只500W 钨灯作为光源），试管，移液管，烧杯，纱布，研钵等。0.
3、35MNaCl溶液、0.01MTris溶液五、实验步骤1、离体叶绿体的制备：称鲜菠菜叶 5g，加 10 ml0.35M NaCl、1ml Tris 缓冲液、石英砂，研磨。匀浆用脱脂棉过滤。1000 转/分离心 5 分钟，取上清液， 3000 转/ 分离心 5 分钟。去除上清液，保留沉淀。在沉淀中加入 5ml 0.35M NaCl，搅匀，得到叶绿体悬浮液。2、希尔反应活力的测定按照下面表格，取三支试管，分别进行不同的操作。将三支试管中的溶液倒入对应的比色杯中，以 3 号试管调零，620nm 处比色。然后将比色杯置于光源 60cm 处照光。每隔 1 分钟快速读下光密度的变化，连续进行 56 次读数
4、。表 1管号 0.1mlTris 缓冲液叶绿体 煮沸 2.6-二氯吲哚叮酚1 9.3ml 0.2ml 0.5ml2 9.3ml 0.2ml 5min 0.5ml3 9.8ml 0.2ml 六、实验结果表 2管号 光值 1 光值 2 光值 3 光值 4 光值 5123将所测光值记录到上表，画出曲线图，并分析原因。七、注意事项1、 2.6-二氯吲哚叮酚 必须在煮沸加热后滴加。2、溶液加入比色杯就开始计时。3、每次测光时都应调零和百分比。4、试管加热时管口不要对准他人。八、思考题1. 试管中蓝色褪去的原因是什么? 与光照有什么关系?2煮沸对叶绿体有何影响？3请对结果作出解释。 附录1：离心机的构造及
5、使用离心机是利用离心力对混合液（含有固形物）进行分离和沉淀的一种专用仪器。实验室常用电动低速离心机、高速离心机和低速、高速冷冻离心机，以及超速分析、制备两用冷冻离心机等多种型号。其中以低速（包括大容量）离心机和高速冷冻离心机应用最为广泛，是生化实验室用来分离制备生物大分子必不可少的重要工具。在实验过程中，欲使沉淀与母液分开，常使用过滤和离心两种方法。 在下述情况下，使用离心方法效果较好。 沉淀有粘性或母液粘稠。 沉淀颗粒小，容易透过滤纸。 沉淀量过多而疏松。 沉淀量很少，需要定量测定。或母液量很少，分离时应减少损失。 沉淀和母液必须迅速分开。 一般胶体溶液。电动低速离心机的基本结构和性能 低速
6、离心机结构较简单，可分小型台式和落地式两类，配有驱动电机、调速器、定时器等装置，操作方便。低速离心机其转速一般不超过4000rpm，台式高速离心机最大转速可达18000rpm。 离心机的一般使用规程 1、离心前，先将离心的物质转移入合适的离心管中，其量以距离管口12cm为宜，以免在离心时甩出。将离心管放入外套管中，在外套管与离心管间注入缓冲水，使离心管不易破损。 2、取一对外套管（内已有离心管）放在台秤上平衡。如不平衡，可调整缓冲用水或离心物质的量。将平衡好的套管放在离心机十字转头的对称位置上。把不用的套管取出，并盖好离心机盖。 3、接通电源，开启开关。 4、待离心机自行停止转动手，打开机盖，
7、取出离心样品。 5、将外套管、橡胶垫冲洗干净，倒置干燥备用。注意事项 1、低速离心机要放在平坦和结实的地面或实验台上，不允许倾斜。2、一年检查一次电动机的电刷及轴承磨损情况，必要时更换电刷或轴承。3、关闭电源后，要等候离心机自动停止。不允许用手或其他物件迫使离心机停转。4、离心机应接地线，以确保安全。 5、离心机启动后，如有不正常的噪音及振动时，可能离心管破碎或相对位置上的两管重量不平衡，应立即关机处理。 附录 2：721 型分光光度计的原理及使用方法1.吸收光谱原理 物质中分子内部的运动可分为电子的运动、分子内原子的振动和分子自身的转动，因此具有电子能级、振动能级和转动能级。 当分子被光照射
8、时，将吸收能量引起能级跃迁，即从基态能级跃迁到激发态能级。而三种能级跃迁所需能量是不同的，需用不同波长的电磁波去激发。电子能级跃迁所需的能量较大，一般在 1eV20eV ，吸收光谱主要处于紫外及可见光区，这种光谱称为紫外及可见光谱。如果用红外线( 能量为 1eV0.025eV) 照射分子，此能量不足以引起电子能级的跃迁，而只能引发振动能级和转动能级的跃迁，得到的光谱为红外光谱。若以能量更低的远红外线(0.025eV0.003eV)照射分子，只能引起转动能级的跃迁，这种光谱称为远红外光谱。由于物质结构不同对上述各能级跃迁所需能量都不一样，因此对光的吸收也就不一样，各种物质都有各自的吸收光带，因而
9、就可以对不同物质进行鉴定分析，这是光度法进行定性分析的基础。 根据朗伯比耳定律:当入射光波长、溶质、溶剂以及溶液的温度一定时，溶液的光密度和溶液层厚度及溶液的浓度成正比，若液层的厚度一定，则溶液的光密度只与溶液的浓度有关， 式中，c 为溶液浓度，E 为某一单色波长下的光密度(又称吸光度 )，I 0 为入射光强度，I 为 透射光强度，T 为透光率， 为摩尔消光系数，l 为液层厚度。 在待测物质的厚度 l 一定时，吸光度与被测物质的浓度成正比，这就是光度法定量分析的依据。2.分光光度计的构造原理 将一束复合光通过分光系统，将其分成一系列波长的单色光，任意选取某一波长的光，根据被测物质对光的吸收强弱
10、进行物质的测定分析，这种方法称为分光光度法，分光光度法所使用的仪器称为分光光度计。 分光光度计种类和型号较多，实验室常用的有 72 型、721 型、752 型等。各种型号的分光光度计的基本结构都相同，由如下五部分组成: 光源(钨灯、卤钨灯、氢弧灯、氘灯、汞灯、氙灯、激光光源) ； 单色器(滤光片、棱镜、光栅、全息栅 )； 样品吸收池； 检测系统(光电池、光电管、光电信增管 )；信号指示系统(检流计、微安表、数字电压表、示波器、微处理机显像管) 。 光源单色器样品吸收池检测系统信号指示系统 2.分光光度计的使用方法在仪器尚未接通电源时，电表指针必须于“0” 刻线上，若不是这种情况，则可以用电表上
11、的校正螺丝进行调节。 将仪器电源开通，打开比色皿暗箱盖，选择需用的波长，然后将比色皿暗箱盖合上，比色皿座处于蒸馏水校正位置，使光电管受光，旋转调“100%”电位器，使电表指针到满度附近，仪器预热 20 分钟。 放大器灵敏度有五档，是逐步增加的， “1”最低。其选择原则是保证能使空白档良好调到“100%”的情况下，尽可能采用灵敏度较低档，这样仪器将有更高的稳定性。所以使用时一般置“1”，灵敏度不够时再逐渐升高，但改变灵敏度后需按“4” 重新校正“0”和“100%”，仪器即可进行测定工作。 预热后，连续几次调整“0” 和“100%”，仪器即可进行测定工作。 如果大幅度改变测试波长时，在调整“0” 和“100%”后稍等片刻，当指针稳定后，重新调整“0”和“100%”即可工作。
