1、1微生物痕量基因残留测定 微滴数字 PCR 法国家标准编 制 说 明（征求意见稿）一、任务来源本国家标准的制定任务列入国家标准化管理委员会国家标准委关于下达 2018 年第二批国家标准制修订计划的通知（国标委综合201841 号），项目编号“20181041-T-424”。该标准由中国标准化研究院提出并归口，由清华大学等单位承担该标准的制定任务。二、标准制定目的和意义数字 PCR（dPCR）作为第三代 PCR 的技术代表，由 Vogelstein 等提出。dPCR 是把一个样本的反应体系均匀分配到大量反应单元中，每个反应单元中不包含或包含一个到多个目的核酸序列，独立地进行 PCR 扩增，检测每
2、个反应单元的荧光信号，最终根据泊松分布以及荧光信号阳性的反应单元数量占所有反应单元的比例，来计算目的核酸序列的拷贝数，dPCR 反应中荧光信号的产生过程基本与 qPCR 相同。目前，该技术已经在稀有突变检测、CNV 分析和复杂样本基因表达检测等方面有着广泛的应用。本标准拟将 dPCR 技术应用到常见污染菌和致病菌的检测体系构建中，为生产企业的过程控制提供必要的技术保障，也为 dPCR 技术在其它污染菌和致病菌的检测上的推广奠定基础。三、标准制定原则和依据（一）标准编制原则本标准以现有国内外相关标准规范为基础，与现行国家标准和行业标准相衔接，主要对微生物痕量基因残留测定有关微滴数字 PCR 法的
3、标准方法和流程进行规范，旨在对不同工业微生物菌株的质量评价具有实用性和统一性。（二）标准制订主要依据21、标准编写遵循 GB1.1-2009标准化工作导则 第 1 部分：标准的结构和编写规则的有关要求。2、标准编写内容参考的相关标准，包括：GB/T 14926.43-2001 实验动物 细菌学检测 染色法、培养基和试剂GB/T 6682-2008 分析实验室用水规格和试验方法GB/T27403 实验室质量检测规范食品分子生物学检测GB/T 10092-2009 数据的统计处理和解释.测试结果的多重比较ISO 2602-1980 测试结果的统计解释 均值的估计和置信区间3、法律、法规及文件中华人
4、民共和国标准化法中华人民共和国标准化法实施条例国家标准化体系建设发展规划（20162020 年） 深化标准化工作改革方案四、主要工作过程1、组成标准起草小组标准制定任务下达后，2018 年 6 月，组成了标准起草工作组，明确了任务要求，安排了工作进度，成立了标准起草工作小组，会议研究讨论了工作小组的工作目标、任务分解、可量化的考核指标，以及通过召开调研会、行业需求征集会、专家论证会和行业用户推广会等，旨在制定微生物痕量基因残留测定的微滴数字 PCR 法，且可以有效推行的国家标准。2、开展相关调研情况为了更好地制定标准，进行了方法调研、可行性调研，以及用户需求调研等活动，从行业需求层面、科学理论
5、层面、方法学角度，以及实际可操作性等方面，对该标准进行了多角度论证。3、标准起草完善过程依据 GB/T 1.12000标准化工作导则 第 1 部分：标准的结构和编写规则 、GB/T 1.22002标准化工作导则 第 2 部分：标准中规范性技术要素内容的确定方法等标准编制要求，对微生物痕量基因残留测定 微滴数字 PCR 法标准开展了研制工作，2018 年起草工作小组完成了微生物痕量基因残留测定 微滴数字 PCR 法国家标准（草3案） 。并针对草案中的具体条件进行优化和扩展， 2018 年 12 月征求了专家意见，起草组按照专家意见对标准内容进行了修改完善，形成了标准征求意见稿。五、主要技术内容数
6、字 PCR 是将原始的扩增体系进行分割，对每个分割体系进行扩增和检测，之后进行数据分析，最终根据泊松分布原理以及阳性微滴的比例，分析软件可直接给出待检靶分子的拷贝数浓度。全新的数字化终点检测方式和分子计数的定量手段，赋予了数字 PCR卓越的性能，即无需标准曲线和参照，对影响 PCR 效率的抑制物不敏感，大大提高了检测灵敏度、精确度、准确度和重复性，并实现了真正意义上的绝对定量。目前应用比较多的数字 PCR 是微滴式数字 PCR 和芯片式数字 PCR。芯片式数字 PCR 是应用的微流控芯片实现反映的分割，但芯片式数字 PCR 由于价格昂贵目前应用还比较少。微滴式数字 PCR 是形成的油包水的微小
7、液滴，该方法成本较低，应用较为普遍。验证实验一验证材料： Lactobacillus plantarum 提取的基因组； Saccharomyces cerevisiae提取的基因组。方法验证 1：S.ce 的引物和 L.pl 的引物特异性验证验证过程：在 PCR 仪中用 S.ce 的引物分别扩增 S.ce 和 C.al 的基因组，用 L.pl 的引物分别扩增 L.pl 和 E.fa 的基因组。对其产物进行琼脂糖凝胶电泳验证。验证结果：如图 1 所示，S.ce 的引物扩增 S.ce 的基因组，获得 105 bp 的产物；S.ce的引物扩增 C.al 的基因组，无扩增产物；L.pl 的引物扩增
8、L.pl 的基因组，获得 71 bp 的产物；L.pl 的引物扩增 E.fa 的基因组，无扩增产物。验证 S.ce 的引物和 L.pl 的引物特异性良好。4图 1 S.ce 的引物和 L.pl 的引物特异性验证方法验证 2：S.ce 的探针优化验证过程：设计了 3 条不同的 S.ce 的探针，称为 SC-1，SC-2，SC-3。在实时荧光定量 PCR（qPCR）中分别使用 3 种不同的探针进行扩增。并通过数字 PCR 测得 SC-1 和SC-2 的阳性率进行对比。验证结果：qPCR 结果如图 2 所示，SC-2 的信号更强，但 SC-1 的高本底荧光使得阴性液滴信号更强，便于分析。数字 PCR
9、 结果如表 1 所示，SC-1 的阳性率对比 SC-2 没有降低。因此采用 SC-1 进行后续实验。图 2 S.ce 的探针优化表 1 数字 PCR 中 SC-1 和 SC-2 的阳性率样品 阳性液滴数 阴性液滴数 阳性率 拷贝数Sce-5x-SC-1 1410 18000 0.0783 1.63*103Sce-5x-SC-2 1261 18000 0.0701 1.45*103方法验证 3：L.pl 核酸 qPCR 和 dPCR 检测线性5验证过程：在 qPCR 仪中对不同浓度的 L.pl 待测核酸样品进行扩增，获得相应的 Ct值数据；在 dPCR 仪中对不同浓度的 L.pl 待测核酸样品进
10、行扩增，获得相应的拷贝数数据。验证结果：qPCR 的结果如表 2 所示；dPCR 的结果如表 3 所示；对数据进行整理分析，以对应浓度的 Ct 值为横坐标，拷贝数以 10 为底的对数为纵坐标绘图，结果如图 3 所示。可以看出 dPCR 结果与 qPCR 结果展现出极高的线性关系，R 20.99，dPCR 的检测限可达到 2.22 拷贝/微升。表 2 不同浓度的 L.pl 核酸的 qPCR 检测结果浓度/L26ng 2.6ng 260pg 26pg 2.6pg 260fg 26fg 2.6fg拷贝数copies/L7.41*106 7.41*105 7.41*104 7.41*103 7.41*
11、102 74.1 7.41 0.741Ct 值 15.5 18.5 22.5 26.5 29.7 33.5 无法确定 无法确定表 3 不同浓度的 L.pl 核酸的 dPCR 检测结果浓度ng/L260pg 26pg 2.6pg 260fg 26fg 2.6fg拷贝数copies/L7.41*104 7.41*103 7.41*102 74.1 7.41 0.741dPCR 结果 copies/L4.55*104 4.55*102 46.7 19.9 4.44 2.226图 3 不同浓度的 L.pl 核酸的 dPCR 结果和 qPCR 结果的线性关系方法验证 4：S.ce 核酸 qPCR 和 d
12、PCR 检测验证过程：对不同浓度的 S.ce 核酸分别进行 qPCR 和 dPCR 验证。验证结果：对 qPCR 和 dPCR 结果数据进行整理分析，如表 4 所示。dPCR 可以达到12.8 拷贝/微升。表 4 S.ce 核酸 qPCR 和 dPCR 检测结果浓度/L 57.1 ng 11.42 ng 5.71 ng 570 pg 0单菌落菌液Ct 值 - - 26 29 无法确定 32.6dPCR 结果copies/L1.3*1042.76*1031.63*10357.5 12.8 0 -验证试验二验证材料：目标基因 1；目标基因 2；目标基因 3。方法验证 1：目标基因 1 的 ddPC
13、R 法检测的温度优化验证过程：对目标基因 1 的普通 PCR 反应程序中的退火温度进行优化，设置退火温度为 55，梯度差异为 5，扩增反应结束后，将 96 孔板转移到微滴检测仪中进行检测。验证结果：如图 4 所示，从 5056.8的扩增反应效率差距不大，54时微滴数量较多，且微滴比较密集，特异性较好，所以目标基因 1 的 ddPCR 反应的最佳退火温度为54。7方法验证 2：目标基因 2 的 ddPCR 法检测的温度优化结果验证过程：设置目标基因 2 的 PCR 反应程序的退火温度为 55，梯度差异为 5，扩增反应结束后，将 96 孔板转移到微滴检测仪中进行检测。验证结果：如图 5 所示，50
14、.2 时微滴数量和质量都较好，所以目标基因 2 的ddPCR 反应的最佳退火温度为 50.2 。1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11图 4 目标基因 1 的 ddPCR 法检测的温度优化结果Fig.4 The optimization temperature result of Salmonella by ddPCR1:50.0; 2:50.2; 3:50.7; 4:51.6; 5:52.7; 6:54.0; 7:55.4; 8:56.8; 9:58.1; 10:59.2; 11:60.0;8方法验证 3：目标基因 3 的 ddPCR 法检测的温度优化结果验证过程：设置目标基因 3
15、的 PCR 反应程序的退火温度为 56，梯度差异为 4。验证结果：如图 6 所示，温度为 52.6时，微滴数量较多且相对集中，所以，最终选取 52.6为目标基因 3 的 ddPCR 反应的最佳退火温度。1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11图 5 目标基因 2 的 ddPCR 法检测的温度优化结果Fig.5 The optimization temperature result ofStaphyloccocusaureusby ddPCR1:50.0; 2:50.2; 3:50.7; 4:51.6; 5:52.7; 6:54.0; 7:55.4; 8:56.8; 9:58.1; 10:
16、59.2; 11:60.0;9图 3 阪崎克罗诺杆菌 ddPCR 法检测的温度优化结果Fig3 The optimization temperature result of Cronobacter sakazakii by ddPCR1:52.1; 2:52.2; 3:52.6; 4:53.3; 5:54.2; 6:55.2; 7:56.4; 8:57.5; 9:58.5; 10:59.4; 11:60.0六、与有关的现行法律、法规和强制性国家标准的关系本标准符合国家现行法律、法规、规章和强制性国家标准的要求。本标准的实施不涉及对现行标准的废止情况。七、与有关的现行法律、法规和强制性国家标准的关系本标准符合国家现行法律、法规、规章和强制性国家标准的要求。本标准的实施不涉及对现行标准的废止情况。八、标准属性的建议本标准为推荐性国家标准。九、贯彻国家标准的要求和措施建议标准发布实施后，建议由标准编制单位组织有关生产、检验、设计等单位进行宣传贯彻。十、其他应予说明的事项无其他事项说明。
