1、ICS 07.080A 20/39中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准GB/T XXXXXXXXX微生物快速测定方法Rapid determination of microorganismsXXXX - XX - XX 发布 XXXX - XX - XX 实施国家市场监督管理总局中国国家标准化管理委员会 发 布GB/T XXXXXXXXXI前 言本标准按照 GB/T 1.12009 给出的规则起草。本标准由中国标准化研究院提出并归口。本标准起草单位： 本标准主要起草人：GB/T XXXXXXXXX5微生物快速测定方法1 范围本标准规定了微生物快速测定分子马达法和红外免疫层析法的原理、试剂
2、或材料、仪器设备、测定步骤、结果分析。本标准中分子马达法适用于单增李斯特菌、副溶血弧菌、霍乱弧菌、沙门氏菌、阪崎肠杆菌、志贺氏菌、甲型肝炎病毒的快速测定，红外免疫层析法适用于进出口食品中单增李斯特菌、副溶血弧菌、霍乱弧菌、沙门氏菌、轮状病毒、诺如病毒、甲型肝炎病毒的快速测定。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法GB 19489 实验室生物安全通用要求SN 0330 出口食品中微生物学检验通则SN/T 2424
3、 进出口食品中副溶血性弧菌快速及鉴定检测方法 实时荧光PCR方法。第一法 分子马达法3 原理利用荧光探针DHPE标记的载色体Chromatophore上的F0F1-ATPase分子马达生物传感器。生物传感器的设计基于其催化ATP合成过程中伴随着H+的跨膜转运。研究发现在ATP合酶亚基上连接不同分子量的负载时，可以不同程度影响其质子转运。根据这一原理，以荧光探针DHPE标记的chromatophore为材料建立一个超灵敏的生物传感器并用它检测病原微生物。首先在chromatophore膜外标上对pH敏感的荧光探针DHPE用于表征ATP合成引起的质子转运，然后在ATP合酶的亚基连接上亚基抗体-生物
4、素-链霉亲和素-生物素-核酸探针；将待测样品和阴性对照分别与生物传感器结合的同时启动ATP合成，2030分钟后比较其荧光强度的差别，可以对样品中的食源性病原菌进行检测。4 试剂或材料除非另有规定，仅使用分析纯试剂。4.1 水：GB/T6682 二级。4.2 分子马达生物传感器检测试剂盒：见附录 A。GB/T XXXXXXXXX54.3 细菌 DNA 提取试剂盒（商业）。4.4 缓冲蛋白胨水（BPW）。4.5 四硫磺酸钠煌绿（TTB）增菌液。4.6 亚硒酸盐胱氨酸（SC）增菌液。4.7 亚硫酸铋（BS）琼脂。4.8 HE 琼脂。4.9 木糖赖氨酸脱氧胆盐（XLD）琼脂。4.10 胰蛋白胨大豆（T
5、SA）琼脂。4.11 甘氨酸缓冲液。4.12 PEG 8000 沉降液。4.13 甲肝减毒活疫苗：作为阳性对照添加于已知的食品中制成阳性质控样品。5 仪器设备5.1 恒温培养箱：361。5.2 微量加样器：单道 20 mL，50 mL ，100 mL，1000 mL；多道 50250 mL）。5.3 电子天平，感量 0.01 g。5.4 荧光光谱仪。5.5 化学发光检测仪。6 测定步骤6.1 取样贝类样品：用灭菌蒸馏水将贝壳表面的污泥清洗十净，打开贝壳后，倒掉腔内的液体,使用灭菌消毒的剪刀和镊子取贝的消化道组织，均质。虾类：用清水将虾外表彻底洗净，剥去虾头、皮和腿，用重蒸水淋洗内部去除泥沙及其
6、他外来物，均质。鱼类：用清水将鱼外表彻底洗净，剥去内脏、头、鳃和皮，同重蒸水淋洗内部去除泥沙及其他外来物，均质。禽肉类：新鲜禽肉用清水淋洗表面，再用重蒸水淋洗，均质。加工品：蒸煮后冷冻或鲜冻品，在室温下，使冷冻的样品呈半冷冻状态，使用6.2.16.2.4的方法取试样，均质。6.2 样品增菌及细菌分离GB/T XXXXXXXXX5样品制备、增菌培养及细菌分离参照GB 4789.3进行。最后从BS、HE或XLD平板上挑取可疑菌落转接到TSA琼脂上，36C1C培养24 h，用于DNA的提取。6.3 样品保存上述6.2中经均质处理的样品如不能及时检测，可取100 g已均质试样置于4冷藏保存（尽可能及时
7、检验）。6.4 测定见附录B。7 结果及判定见附录F。第二法 红外免疫层析法8 原理近红外免疫层析技术是将近红外荧光与免疫层析法相结合的一种新型侧向流技术。本标准采用近红外荧光染料dylight800标记的双抗体夹心免疫层析试纸条检测食源性致病菌或病毒。当含有食源性致病菌或病毒的样品滴加到样品垫上时，溶液将结合垫上固定的分子解离，靶标致病菌或靶标病毒与解离出来的荧光标记致病菌或病毒单抗形成复合物。抗原抗体复合物随溶液向试纸条前端迁移，当抗原抗体复合物迁移至检测线时，被固定于检测线上的致病菌或病毒多克隆抗体捕获。而游离的单抗分子/抗原抗体复合物则随溶液继续迁移，到达质控线时被交联于质控线上的参照
8、物抗体所捕获。检测时采用专用便携式低噪声激发式荧光扫描仪分别扫描质控线和检测线，以检测线荧光强度检测值对应的目标物的浓度可以判断样品呈阳性还是阴性，并且可以定量检测，能够对目标检测物浓度进行定量分析。9 试剂或材料9.1 荧光染料 dylight8009.2 缓冲蛋白胨水9.3 羊抗鸡免疫球蛋白 IgY9.4 磷酸缓冲盐溶液 PBS9.5 牛血清白蛋白 BSA9.6 免疫球蛋白 IgG10 仪器与设备GB/T XXXXXXXXX510.1 超声破碎仪。10.2 便捷式高灵敏度近红外点荧光扫描仪。10.3 近红外免疫层析法检测试纸条：见附录 D。11 测定步骤11.1 取样样品采集数量和采集方法
9、按 SN 0330 进行。11.2 样品制备11.2.1 食源性致病菌取食品样品 25g,用 225mL 含 5% BSA，0.1%Tween 20 的 PBS 缓冲液稀释样品，取上清液作为检样，吸取 1ml 上清液至 EP 管中，超声破菌，3 探头，工作 5s，休息 15s，屏幕显示能量为 40%，共计 30次循环。11.2.2 食源性病毒贝类、海螺丝、蛏子等前处理方法分别按照 GB/T 22287、SN/T 2520、SN/T 1635 进行11.3 测定11.4 见附录 E。11.5 测定见附录E。12 结果及判定见附录F。GB/T XXXXXXXXX5A A附 录 A（资料性附录）试剂
10、和培养基A.1 分子马达生物传感器试剂盒组成表 A.1 分子马达生物传感器试剂盒组成编号 组分名称 数量 储存条件1 Chro-tlh、Chro-tdh、Chro- trh、Chro- toxR 20 L 202 合成 buffer（0.1 mM Tricine，10% 甘油，5 mM NaH2PO4，5 mM MgCl 2，pH 9.0）10 mL 室温3 ADP（1.6mol/L） 1 mL 204 1PBS（137mM NaCL，2.7 mM KCL，10 mM Na2HPO4，2 mM KH 2PO4，pH 7.0。 ）25 mL 室温5 荧光素酶/荧光素 100 U 206 荧光素酶
11、/荧光素重组缓冲液 12 mL 207 无菌水 5 mL 室温A.2 缓冲蛋白胨水（BPW）A.2.1 成分蛋白胨 17.0 g氯化钠 3.0 g磷酸氢二钠（含12个结晶水） 9.0 g磷酸氢二钾 2.5 g蒸馏水 1000 mLpH 7.20.2A.2.2 制法将各成分加入蒸馏水中，搅混均匀，静置约10 min，煮沸溶解，调节pH，121 高压灭菌15 min。A.3 四硫磺酸钠煌绿（TTB）增菌液7A.3.1 基础液蛋白胨 10.0 g氯化钠 碳酸钙 蒸馏水 pH7.00.2 3.0 g45.0 g1 000 mL除碳酸钙外，将各成分加入蒸馏水中，煮沸溶解，再加入碳酸钙，调节pH，121
12、高压灭菌20 min。硫代硫酸钠溶液硫代硫酸钠（含5个结晶水） 50 g蒸馏水 加至100 mL高压灭菌121，20 min。A.3.2 碘溶液碘片 20.0 g碘化钾 25.0 g蒸馏水 加至100 mL将碘化钾充分溶解于少量的蒸馏水中，再投入碘片，振摇玻瓶至碘片全部溶解为止，然后加蒸馏水至规定的总量，贮存于棕色瓶内，塞紧瓶盖备用。A.3.3 0.5%煌绿水溶液煌绿 0.5 g 蒸馏水 100 mL溶解后，存放暗处，不少于1 d，使其自然灭菌。A.3.4 牛胆盐溶液牛胆盐 10.0 g蒸馏水 100 mL加热煮沸至完全溶解，高压灭菌121，20 min。A.3.5 制法基础液 900 mL硫
13、代硫酸钠溶液 100 mL碘溶液 20.0 mL煌绿水溶液 2.0 mL牛胆盐溶液 50.0 mL临用前，按上列顺序，以无菌操作依次加入基础液中，每加入一种成分，均应摇匀后再加入另一种成分。A.4 亚硒酸盐胱氨酸（SC）增菌液A.4.1 成分7蛋白胨 5.0 g乳糖 4.0 g磷酸二氢钠 10.0 g亚硒酸氢钠 4.0gL-胱氨酸 0.01 g蒸馏水 1000 mLpH7.00.2A.4.2 制法除亚硒酸氢钠和L-胱氨酸外，将各成分加入蒸馏水中，煮沸溶解，冷至55以下，以无菌操作加入亚硒酸氢钠和1 g/L L-胱氨酸溶液 10 mL（称取0.1 g L-胱氨酸，加1 mol/L氢氧化钠溶液15
14、 mL，使溶解，再加无菌蒸馏水至100 mL即成，如为DL-胱氨酸，用量应加倍）。摇匀，调节pH。亚硫酸铋（BS）琼脂A.4.3 成分蛋白胨 10.0 g牛肉膏 5.0 g葡萄糖 5.0 g硫酸亚铁 0.3 g磷酸氢二钠 4.0 g煌绿 0.025 g 或 5.0 g/L 水溶液 5.0 mL柠檬酸铋铵 2.0 g亚硫酸钠 6.0 g琼脂 18.0-20 g蒸馏水 1000 mLpH 7.50.2A.4.4 制法将前三种成分加入300 mL蒸馏水（制作基础液），硫酸亚铁和磷酸氢二钠分别加入20 mL和30 mL蒸馏水中，柠檬酸铋铵和亚硫酸钠分别加入另一20 mL和30 mL蒸馏水中，琼脂加入6
15、00 mL蒸馏水中。然后分别搅拌均匀，煮沸溶解。冷至80左右时，先将硫酸亚铁和磷酸氢二钠混匀，倒入基础液中，混匀。将柠檬酸铋铵和亚硫酸钠混匀，倒入基础液中，再混匀。调节pH，随即倾入琼脂液中，混合均匀，冷至50-55。加入煌绿溶液，充分混匀后立即倾注平皿。A.5 HE 琼脂（Hektoen Enteric Agar）A.5.1 成分蛋白胨 12.0 g牛肉膏 3.0 g蔗糖 12.0 g7乳糖 12.0g水杨素 2.0 g琼脂 18.0-20.0 g蒸馏水 1000 mL0.4%溴麝香草酚蓝溶液 16.0 mLAndrade 指示剂 20.0 mL甲液 20.0 mL乙液 20.0 mLpH
16、7.50.2 1000 mLA.5.2 制法将前面七种成分溶解于400 mL蒸馏水内作为基础液；将琼脂加入于600 mL蒸馏水内。然后分别搅拌均匀，煮沸溶解。加入甲液和乙液于基础液内，调节pH。再加入指示剂，并与琼脂液合并，待冷至55-55 倾注平皿。注：1.本培养基不需要高压灭菌，在制备过程中不宜过分加热，避免降低其选择性。2.甲液的配制硫代硫酸钠 34.0 g柠檬酸铁铵 4.0 g蒸馏水 100 mL3.乙液的配制去氧胆酸钠 10.0 g蒸馏水 100 mL4.Andrade 指示剂酸性复红 0.5 g1 mol/L氢氧化钠溶液 16.0 mL蒸馏水 100 mL将复红溶解于蒸馏水中，加入
17、氢氧化钠溶液。数小时后如复红褪色不全，再加入氢氧化钠溶液1-2 mL。A.6 木糖赖氨酸脱氧胆盐（XLD）琼脂A.6.1 成分酵母膏 3.0 gL-赖氨酸 5.0 g木糖 3.75 g乳糖 7.5 g蔗糖 7.5 g去氧胆酸钠 2.5 g柠檬酸铁铵 0.8 g硫代硫酸钠 6.8 g氯化钠 5.0 g琼脂 15.0 g7酚红 0.08 g蒸馏水 1000mLpH 7.40.2A.6.2 制法除酚红和琼脂外，将其他成分加入400 mL蒸馏水中，煮沸溶解，调节 pH。另将琼脂加入600 mL蒸馏水中，煮沸溶解。将上述两溶液混合均匀后，再加入指示剂，待冷至50-55倾注平皿。注：本培养基不需要高压灭菌
18、，在制备过程中不宜过分加热，避免降低其选择性，贮于室温暗处。本培养基宜于当天制备，第二天使用。A.7 胰蛋白胨大都（TSA）琼脂A.7.1 成分胰蛋白胨 15.0 g大豆蛋白胨 5.0 g琼脂 3.5 g蒸馏水 1000 mLA.7.2 制法将上述各成分混合，加热并轻轻搅拌至溶解，121 高压灭菌15 min ，调节pH 7.30.2。7B B附 录 B（资料性附录）操作步骤B.1 甲肝病毒检测B.1.1 病毒的采集称取10 g试样(精确至0.1 g)，样品中加人70 mL甘氨酸缓冲液(样品质量与缓冲液体积之比为1:7)，纽织匀浆器中充分破碎混匀2 min。取出匀浆液30 mL，置37 孵育3
19、0 min.。于4 ,15000 g，离心20 min。收集上清液，加人等体积三氯甲烷，涡旋混匀1 min，室温放置5 min，1700 g，4，离心30 min。从上层液相取出 15 rnL上清液，加人等体积的PEG8000溶液(PEG终浓度为8%) ，于4 过夜沉降病毒。10000 g，4 ，离心5 min。弃上清，保留沉淀进行 RNA 提取。B.1.2 病毒RNA提取向沉淀中加入 6 mol/L 的异硫硫氰酸胍溶液 1 mL 尽量使沉淀充分溶解，涡旋混匀，使用 Qiagen的 QIAamp Viral RNA Mini Kit 或其他等效产品进行 RNA 提取。按照厂家的试剂盒使用说明进
20、行操作。B.1.3 RNA的保存制备好的 RNA 应尽快进行检测。若暂时不能进行检测，应与-80保存备用。B.1.4 分子马达生物传感器对食品中甲肝病毒RNA进行检测B.1.4.1 取1.5mL EP管，加入待测样本10 L。6.2将EP管放入95水浴5 min，立即转移至50水浴1 min。B.1.4.2 取2 L chro HAV，用合成buffer稀释到一定的倍数。取稀释后的 chro HAV 10L加入上述EP管中。B.1.4.3 向EP管中加入30 L启动buffer，振荡使反应体系混匀，然后立即短暂离心以除去管盖内壁上的水珠。B.1.4.4 将上述反应体系放入37恒温摇床中温育30
21、 min。将EP管从摇床中取出，分别加入450 L PBS缓冲液，振荡使体系混匀。B.1.4.5 将最终反应体系加入到96孔板中，每个体系重复三孔，每孔加样50 L，然后对每个加样孔分别加入30 L已配置好的荧光素酶溶液，用枪反复吹打几次使体系混匀。B.1.4.6 设定仪器于450 nm处，将96孔板上机检测，测定荧光度值（OD值） 。B.1.5 空白对照及本底对照试验B.1.5.1 空白对照：在EP管中加入10 L无菌水作为空白对照，其他均完全按照6.1进行。B.1.5.2 本底对照：在EP管中加入10 L无菌水作为本底对照，将EP管放入95水浴5 min，立即转移至50水浴1 min。再加
22、入10 L合成buffer作为本底对照，短暂振荡使反应体系混匀。其他均完全按照B.1进行。7B.2 单增李斯特菌、副溶血弧菌、霍乱弧菌、沙门氏菌、阪崎肠杆菌、志贺氏菌检测B.2.1 B.2.1 细菌DNA提取将培养获得的可疑细菌用 DNA 提取试剂盒（商业）进行提取，详细操作步骤见试剂盒说明书。最后获得的离心管中的液体就是菌体的 DNA 提取液，用作分子马达传感器的目标检测物。制备好的 DNA 样品应尽快进行检测。若暂时不能进行检测，应置于冰箱中20C 保存，使用时置于室温自然解冻，然后用振荡器振荡混匀。B.2.2 检测B.2.2.1 取4个1.5 mL EP管，各加入待测样本 10 L。将E
23、P管放入沸水浴中加热3 min，然后立即转移到冰上至完全冷却。B.2.2.2 分别取2 L Chro-tlh、Chro- tdh、Chro- trh、Chro- toxR，用合成buffer稀释到一定的倍数。取稀释后的分型装置分别加入上述EP管。B.2.2.3 阴性对照用10 L无菌水代替DNA提取液进行。另取1个EP管加入10 L无菌水，沸水浴中加热3 min，然后立即转移到冰上至完全冷却，再加入10 L合成buffer作为本底对照，短暂振荡使反应体系混匀。B.2.2.4 向上述EP管中分别加入30 L启动buffer（由ADP和上述合成buffer配置，体积比 1：3） ，振荡使反应体系混
24、匀，然后立即短暂离心以除去管盖内壁上的水珠。将上述反应体系放入37恒温摇床中温育30 min，然后将EP管从摇床中取出，分别加入450L PBS缓冲液，振荡使体系混匀。B.2.2.5 取一块干净的96孔板，将各管中的最终反应体系加入其中，每个体系加3孔，每孔加样50 L，然后对每个加样孔分别加入30 L已配置好的荧光素酶溶液（将荧光素酶/荧光素重组缓冲液加入装有荧光素酶/荧光素的棕色玻璃瓶中，盖上瓶塞，反复颠倒几次混匀，不可振荡。使用前应将混合液在室温放置1 h） ，用枪反复吹打几次使体系混匀。B.2.2.6 将 96 孔板上机检测，读取各孔荧光值，然后用样本数值减去本底数值即为样本的实际荧光
25、值。7C C附 录 C（资料性附录）结果计算及表述C.1 甲肝病毒检测C.1.1 计算百分比荧光差值样品的百分比荧光差值等于样品的吸光度值平均值减去空白对照及本底对照的吸光度值除以样品的吸光度值与本底荧光值之差，再乘以100%（见式（1） ） 。百分荧光差值（%）=（C.1）%102OHB式中：B样品荧光度值；B0空白荧光度值；B1本底荧光度值。C.1.2 结果表述C.1.2.1 样品百分荧光差值大于10%，则为阳性。C.1.2.2 样品百分荧光差值小于等于10%，则为阴性。C.1.3 结果判定方法在食品中甲肝病毒RNA最低检出浓度为0.01 ng/mL。C.2 单增李斯特菌、副溶血弧菌、霍乱
26、弧菌、沙门氏菌、阪崎肠杆菌、志贺氏菌检测将样本荧光值绝对值与H 2O的阴性对照荧光值绝对值进行单因素方差分析，若差异显著（p0.05）表示检出该基因。7D D附 录 D（规范性附录）近红外免疫层析法检测试纸条制备D.1 近红外免疫层析法检测单增李斯特氏菌试剂条D.1.1 近红外免疫层析法检测单增李斯特氏菌试纸条的结构图 D.1 低噪声激发式荧光标记的单增李斯特菌免疫层析试纸条的侧面示意图注：样品垫；2：结合垫（含有近红外荧光染料标记抗体的玻璃纤维素膜）； 3：抗体承载膜（硝酸纤维素膜） 4：检测线； 5：质控线 ；6 ：吸水垫；7：反应支撑介质如图D.1，试纸条包括，底板7以及沿底板7的长度方
27、向上依次粘附在底板上的样品垫1、结合垫2、抗体承载膜3和吸水垫6，且样品垫1、结合垫2、抗体承载膜3和吸水垫6之间，依次与且仅与相邻部位相接触且部分重叠；抗体承载膜3上粘附于底板7的中间部位，其上设置有相间隔的检测线4的质控线5，检测线4靠近结合垫2，质控线5靠近吸水垫6。质控线4与检测线5平行设置，检测线和质控线间距0.5cm。结合垫2上喷涂有低噪声激发式荧光染料标记的可与单增李斯特菌特异性结合的单克隆抗体-鼠抗单增李斯特菌单克隆抗体；检测线4由可与所述单增李斯特菌特异性结合的多克隆抗体鼠抗单增李斯特菌多克隆抗体涂层形成；质控线5由与单增李斯特菌以及所述可与单增李斯特菌特异性结合的多克隆抗体
28、均无关的羊抗鼠IgG多克隆抗体涂层形成。低噪声激发式荧光染料为发射波长为777nm，发射光波长为790nm的NHS活化的低噪声激发式荧光染料DyLight800作为荧光分子。D.1.2 近红外免疫层析法检测单增李斯特氏菌试纸条的制备D.1.2.1 将dylight800原液用PBS缓冲液稀释10倍，取1.4L与20g单增李斯特菌单克隆抗体轻柔混合均匀后于室温避光反应2小时。反应结束后，将标记产物放入透析袋中，用PBS 4透析过夜，去除游离的荧光染料。标记好的抗体溶液中添加终浓度为1.5%BSA和0.15%Tween20,叠氮化钠0.15，4保存。使用前标记产物以层析缓冲液稀释20000倍；D.
29、1.2.2 选取玻璃纤维素膜为结合垫2，在结合垫2上喷涂以层析缓冲液稀释10000倍后的所述标记产物，然后室温风干，备用；D.1.2.3 选取纤维素膜为样品垫1，使用含5%BSA，0.1%Tween 20的PBS缓冲液喷涂在样品垫1上，室温风干后，备用；D.1.2.4 选取硝酸纤维素膜为抗体承载膜3，分别取单增李斯特菌多克隆抗体和羊抗鼠IgG多克隆抗体用划线机在抗体承载膜3上划检测线4和质控线5，室温风干，备用。7D.1.3 近红外免疫层析法检测单增李斯特氏菌试纸条的组装将上述步骤D.1获得的样品垫1、所述结合垫2、抗体承载膜3和吸水垫6沿底板7的长度方向上依次粘附，具体为在底板7中间先铺设抗
30、体承载膜3，然后在抗体承载膜3的与质控线5相临近的一端铺吸水垫6，使吸水垫6与抗体承载膜3部分重叠，然后在抗体承载膜3的与检测线4相临近的一端铺结合垫2，使抗体承载膜3与结合垫2的一端部分重叠，随后在结合垫2的另一端再部分重叠的铺设样品垫1，最后切割成0.5cm宽，即得试纸条。D.1.4 实验步骤D.1.4.1 样品采集样品采集数量和采集方法按SN 0330进行。D.1.4.2 样品制备取食品样品25g,用225mL含5%BSA，0.1%Tween 20的PBS缓冲液稀释样品，取上清液作为检样，吸取1ml上清液至EP管中，超声破菌，3探头，工作5s，休息15s，屏幕显示能量为40%，共计30次
31、循环。D.1.4.3 定性检测吸取100L经超声处理的检样滴加到样品垫1（图D.1 ）上，待吸收干后再滴加50L层析液，另取所述缓冲液作为阴性对照，用低噪声激发式荧光标记的单增李斯特菌免疫层析试纸条进行免疫层析，室温放置15min后，用便携式低噪声激发式荧光扫描仪读数。D.1.4.4 定量检测13 取 105 CFU/mL 的单增李斯特菌纯菌，用含 5%BSA，0.1%Tween 20，PBS 稀释液将所述纯菌进行倍数系列稀释，制成 0.5105 CFU/mL、110 4CFU/mL、0.510 4CFU/mL、110 3 CFU/mL、0.510 3CFU/mL、110 2 CFU/mL、1
32、0 CFU/mL 的样品；依照 5.2 中方法进行超声破菌处理。吸取 100L 以上样本滴加到样品垫上，待样品吸收后再滴加 50L 层析液。室温静置 10 分钟，将上述试纸条放入便携式近红外荧光扫描仪中读数。上述系列稀释的单增李斯特氏菌标准品分别进行检测，扫描获得检测线和质控线的荧光值，同时出现检测区域荧光峰和质控区域荧光峰方表明反应正常。每个稀释度样本平行测量两次，取平均值作为测量值，以该值相应的样品浓度作标准工作曲线。D.1.5 结果及判定D.1.5.1 定性检测结果及判定用便携式低噪声激发式荧光扫描仪分别测定检测线 4 和质控线 5（图 D.1）区域的荧光强度，若所述质控线 5 区域出现
33、荧光发射峰，则表明该试纸条有效，反之则无效；若所述检测线 4 区域同时出现荧光发射峰则为阳性结果（图 D.2），反之则为阴性。7图 D.2 单增李斯特氏菌检测阳性结果图D.1.5.2 定量检测结果被测样品按D.1.4.4操作进行定量检测，根据标准工作曲线计算出被检样中单增李斯特氏菌的浓度。D.2 副溶血弧菌免疫层析试纸条试纸条由样品垫、结合垫、抗体承载膜、吸水垫及反应支持基质组成，按次序依次搭接，而后以切割机切成试纸条。结合垫：选取玻璃纤维素膜，喷涂上述稀释好的标记抗体，室温风干。样品垫：选取纤维素膜带，将封闭液（5%BSA，0.1%Tween20，PBS)喷洒在膜带上，室温风干后备用。抗体承
34、载膜：选取硝酸纤维素膜，将副溶血弧菌捕获多克隆抗体和羊抗鼠IgG多克隆抗体用划线机在膜上划检测线和质控线，间距0.5cm，室温风干。试纸条由样品垫、结合垫、抗体承载膜、吸水垫及反应支持基质组成。样品垫为玻璃纤维素膜；结合垫是喷涂了近红外荧光染料标记的O1 群小川型霍乱弧菌单克隆抗体的玻璃纤维素膜；抗体承载膜为硝酸纤维素膜；检测线上包被了O1 群小川型霍乱弧菌多克隆抗体；质控线上包被了羊抗鼠IgG 多克隆抗体；吸水垫为吸水纸；反应支撑介质为PVC膜。其结构见图D.1。D.2.1 O1群小川型霍乱弧菌菌悬液取1.010 6 CFU/mL的O1群小川型霍乱弧菌标准菌株，用含 5%BSA，0.1%Tw
35、een 20的PBS 稀释液将纯菌进行倍数系列稀释，制成不同浓度的O1 群小川型霍乱弧菌菌悬液。D.3 霍乱弧菌免疫层析试纸条试纸条由样品垫、结合垫、抗体承载膜、吸水垫及反应支持基质组成。样品垫为玻璃纤维素膜；结合垫是喷涂了近红外荧光染料标记的O1 群小川型霍乱弧菌单克隆抗体的玻璃纤维素膜；抗体承载膜为硝酸纤维素膜；检测线上包被了O1 群小川型霍乱弧菌多克隆抗体；质控线上包被了羊抗鼠IgG 多克隆抗体；吸水垫为吸水纸；反应支撑介质为PVC膜。其结构见图D.1。基于低噪声激发式荧光标记的O17群小川型霍乱弧菌免疫层析试纸条，低噪声激发式荧光染料为发射波长为650-1100nm。优选的，基于低噪声
36、激发式荧光标记的染料为发射波长为777nm，发射光波长为790nm的荧光分子。D.4 沙门氏菌免疫层析试纸条D.4.1 沙门氏菌免疫层析试纸条结构如图D.1结合垫2上喷涂有低噪声激发式荧光染料标记的可与沙门氏菌特异性结合的单克隆抗体鼠抗沙门氏菌单克隆抗体；检测线4由可与沙门氏菌特异性结合的多克隆抗体鼠抗沙门氏菌多克隆抗体鼠抗沙门氏菌多克隆抗体涂层形成；质控线5由与沙门氏菌以及可与沙门氏菌特异性结合的多克隆抗体均无关的羊抗鼠IgG多克隆抗体涂层形成。由此，低噪声激发式荧光标记的沙门氏菌免疫层析试纸条制备完成。D.4.2 沙门氏菌免疫层析试纸条制备D.4.2.1 取以pH为7.4的PBS缓冲液稀释
37、10倍的所述低噪声激发式荧光染料，染料与沙门氏菌单克隆抗体以1:2质量比混合均匀，室温条件下避光反应2 h，随后将所得的标记产物放入含有PBS 缓冲液的透析袋中，4 透析4 h，向所述标记好的标记产物中添加终浓度为1.5% BSA、0.15% Tween20和0.15叠氮化钠，4 保存，备用；在玻璃纤维素膜结合垫上喷涂以层析缓冲液稀释1000倍后的上述步骤中的所述标记产物，然后室温风干，备用；D.4.2.2 使用含5% BSA，0.1% Tween 20的PBS（pH7.4）缓冲液喷涂在所述纤维素膜样品垫，室温风干后，备用；D.4.2.3 分别取所述沙门氏菌多克隆抗体和所述与沙门氏菌以及可与沙
38、门氏菌特异性结合的多克隆抗体均无关的抗体用划线机在硝酸纤维素抗体承载膜上划所述检测线和所述质控线，室温风干，备用；D.5 诺如病毒免疫层析试纸条D.5.1 制作结合垫选取玻璃纤维素膜为结合垫，在其上喷涂上述稀释的标记抗体，室温风干。D.5.2 制作样品垫选取纤维素膜带，将封闭液（5% BSA，0.1% Tween 20，PBS）喷涂在膜带上，室温风干后备用。D.5.3 抗体承载膜选取硝酸纤维素膜，将兔抗诺如病毒多克隆抗体（划膜抗体）1.5mg/mL和羊抗鸡IgY多克隆抗体用划线机在膜上划检测线和质控线，二者间距0.5cm，室温风干。D.5.4 组装免疫层析试纸条将样品垫、结合垫、抗体承载膜、吸
39、水垫及反应支持基质按图D.1所示方式依次搭接，而后以切割机切成试纸条。D.6 轮状病毒免疫层析试纸条7D.6.1 制作结合垫选取玻璃纤维素膜为结合垫，在其上喷涂上述稀释的标记抗体，室温风干。D.6.2 制作样品垫选取纤维素膜带，将封闭液（5%BSA，0.1%Tween 20，PBS）喷涂在膜带上，室温风干后备用。D.6.3 抗体承载膜选取硝酸纤维素膜，将羊抗甲肝病毒多克隆抗体（划膜抗体）1.5mg/mL和羊抗鸡IgY多克隆抗体用划线机在膜上划检测线和质控线，二者间距0.5cm，室温风干。D.6.4 组装免疫层析试纸条将样品垫、结合垫、抗体承载膜、吸水垫及反应支持基质按图D.1所示方式依次搭接，
40、而后以切割机切成试纸条。D.7 甲型肝炎病毒的快速检测D.7.1 制作结合垫选取玻璃纤维素膜为结合垫，在其上喷涂上述稀释的标记抗体，室温风干。D.7.2 制作样品垫选取纤维素膜带，将封闭液（5%BSA，0.1%Tween 20，PBS）喷涂在膜带上，室温风干后备用。D.7.3 抗体承载膜选取硝酸纤维素膜，将羊抗甲肝病毒多克隆抗体（划膜抗体）1.5mg/mL和羊抗鸡IgY多克隆抗体用划线机在膜上划检测线和质控线，二者间距0.5cm，室温风干。D.7.4 组装免疫层析试纸条将样品垫、结合垫、抗体承载膜、吸水垫及反应支持基质按图D.1所示方式依次搭接，而后以切割机切成试纸条。7E E附 录 E（规范
41、性附录）试验方法E.1 近红外免疫层析法检测单增李斯特氏菌E.1.1 样品采集样品采集数量和采集方法按SN 0330进行。E.1.2 样品制备取食品样品25g,用225mL含5%BSA，0.1%Tween 20的PBS缓冲液稀释样品，取上清液作为检样，吸取1ml上清液至EP管中，超声破菌，3探头，工作5s，休息15s，屏幕显示能量为40%，共计30次循环。E.1.3 定性检测吸取100L经超声处理的检样滴加到样品垫1（图D.1 ）上，待吸收干后再滴加50L层析液，另取所述缓冲液作为阴性对照，用低噪声激发式荧光标记的单增李斯特菌免疫层析试纸条进行免疫层析，室温放置15min后，用便携式低噪声激发
42、式荧光扫描仪读数。E.1.4 定量检测14 取 105 CFU/mL 的单增李斯特菌纯菌，用含 5%BSA，0.1%Tween 20，PBS 稀释液将所述纯菌进行倍数系列稀释，制成 0.5105 CFU/mL、110 4CFU/mL、0.510 4CFU/mL、110 3 CFU/mL、0.510 3CFU/mL、110 2 CFU/mL、10 CFU/mL 的样品；依照 5.2 中方法进行超声破菌处理。吸取 100L 以上样本滴加到样品垫上，待样品吸收后再滴加 50L 层析液。室温静置 10 分钟，将上述试纸条放入便携式近红外荧光扫描仪中读数。上述系列稀释的单增李斯特氏菌标准品分别进行检测，
43、扫描获得检测线和质控线的荧光值，同时出现检测区域荧光峰和质控区域荧光峰方表明反应正常。每个稀释度样本平行测量两次，取平均值作为测量值，以该值相应的样品浓度作标准工作曲线。E.2 近红外免疫层析法检测副溶血弧菌E.2.1 样品采集15 样品采集数量和采集方法按 SN 0330 进行。E.2.2 样品制备样品制备方法按SN/T 2424-2010 进行。E.2.3 细菌培养7将-80 保存的副溶血弧菌划线接种于 SS 琼脂培养基平板上，37 培养 18 h 后挑取典型单菌落接种于液体 LB 培养基上，37 培养 18 h。E.2.4 近红外荧光染料标记副溶血弧菌单抗将 dylight800 原液用
44、 PBS 缓冲液稀释 10 倍，取 1.4 L 与 20 g 副溶血弧菌单克隆抗体（上海慧耘生物科技有限公司）轻柔混合均匀后于室温避光反应 2h。反应结束后，将标记产物放入透析袋中，用 PBS 4透析过夜，去除游离的荧光染料。标记好的抗体溶液中添加终浓度为 1%BSA 和 0.1%Tween 20，叠氮化钠 0.1 ，4保存。使用前标记产物以层析缓冲液稀释 10000 倍。E.2.5 定性检测取副溶血弧菌稀释液，吸取 1ml 样本至 7 mlPBS 缓冲液中，超声破菌，工作 15 s，休息 15 s，40%能量，共计 30 次循环。吸取 100 L 经超声处理的样本滴加到样品垫上，待吸收干后再
45、滴加 50 L 层析液。室温放置 15 min 后，用便携式近红外荧光扫描仪读数。若检测线区域和质控区域同时出现荧光峰为阳性结果。E.2.6 定量检测取10 7 CFU/mL的副溶血弧菌纯菌（ATCC），用PBS（pH7.4）稀释液将所述纯菌进行倍数系列稀释，制成2.410 5 CFU/mL、 1.2105CFU/mL 、2.410 4CFU/mL、1.210 4 CFU/mL、2.410 3 CFU/mL、1.210 3 CFU/mL、 2.4102 CFU/mL、1.210 2 CFU/mL菌液进行检测限检测。依照上述方法进行超声破菌处理。吸取100L经超声处理的样本滴加到样品垫上，待吸收
46、干后再滴加50 L层析液。室温静置10分钟，将试纸条放入便携式近红外荧光扫描仪读数。上述系列稀释的副溶血弧菌标准品分别进行检测，扫描获得检测线和质控线的荧光值，同时出现检测区域荧光峰和质控区域荧光峰方表明反应正常。每个稀释度样本平行测量两次，取平均值作为测量值，以该值对应的样品浓度作标准工作曲线。E.3 近红外免疫层析法检测霍乱弧菌E.3.1 样品采集样品采集数量和采集方法按SN 0330进行。E.3.2 样品制备样品制备方法按SN/T 1022进行。E.3.3 普通样品从混合样品中取出代表性样品，将可食部分充分混匀。用四分法分出不小于500g作为试样，装入灭菌容器内，加封标识。E.3.4 带
47、壳贝类应先在清洁的流水中洗净外壳，用70%的乙醇消毒，然后以无菌操作切断闭壳肌，打开贝壳。取出含内脏的全部贝肉和贝液。每个检测样品至少应包括6个贝壳个体。E.3.5 样品保存7样品采集后应立即在7 10 保存，24 h内检验。如果样品需要冷冻，与 -18 保存，24 h内检验。为了最大限度地保证弧菌的存活率，应避免样品与冰直接接触。E.3.6 定性检测分别移取100 L经经超声破菌处理的被测样品、阳性对照和阴性对照，分别滴加到同一批次的免疫层析快速检测试纸条样品垫上，待吸收干后再滴加50 L层析液。室温放置15 min后，用便携式近红外荧光扫描仪读数。E.3.7 定量检测取O1群小川型霍乱弧菌
48、菌悬液（附录 A.1），其浓度分别为 1.0106 CFU/mL、0.510 6 CFU/mL、1.010 5 CFU/mL、0.510 5 CFU/mL、1.010 4 CFU/mL、0.510 4 CFU/mL、1.010 3 CFU/mL、1.010 2 CFU/mL。超声破菌处理。移取100 L上述样本滴加到样品垫上，待样品吸收后再滴加50L层析液。室温静置10 min，将上述试纸条放入便携式近红外荧光扫描仪中读数。上述系列稀释的霍乱弧菌标准品分别进行检测，扫描获得检测线和质控线的荧光值。每个稀释度样本平行测量两次，取平均值作为测量值，以测量值为横坐标X ，对应的样品中菌落浓度对数为纵坐标Y 绘制标准工作曲线。E.4 近红外免疫层析法检测沙门氏菌E.4.1 取样取样按照按SN 0330中的规定进行。E.4.2 样品制备取样品 25 g，剪碎，用
