1、ICS 07.080A 21中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准GB/T XXXXXXXXX基因表达的测定 蛋白印迹法Determination of gene expression-Western blot（征求意见稿）XXXX - XX - XX 发布 XXXX - XX - XX 实施GB/T XXXXXXXXX1前言本标准按照 GB/T 1.12009 给出的规则起草。本标准由中国标准化研究院提出并归口。本标准起草单位：本标准主要起草人：GB/T XXXXXXXXX2GB/T XXXXXXXXX3基因表达的测定 蛋白印迹法1 范围本标准规定了蛋白印迹（Western blot）法
2、检测目的基因表达的原理、试剂或材料、仪器设备、测定步骤和结果分析。本标准适用动植物组织或体外培养细胞目的基因表达的检测。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法3 术语、定义和缩略语下列术语、定义和缩略语适用于本文件。3.1 术语和定义3.1.1 基因表达 gene expression将储存在 DNA 分子中的遗传信息经过转录和翻译，转变成具有生物活性的蛋白质分子的过程。3.2 缩略语3.2.1 Tris：三羟
3、甲基氨基甲烷。3.2.2 SDS：十二烷基磺酸钠（sodium dodecyl sulfate）。3.2.3 SDS-PAGE：十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis）。3.2.4 ECL：电化学发光（electrogenerated chemiluminescence）。3.2.5 BSA：牛血清白蛋白（bull serum albumin）。4 原理SDS-PAGE分离的蛋白质转移到转印膜上后，先用抗目的蛋白质的第一抗体（一抗）与转印膜上的蛋白质反应，然后利用带标记的抗一抗的第二
4、抗体（二抗）与一抗反应，最根据二抗标记物的特性，检测出微量蛋白质的方法，即蛋白印迹法（Western blot）。GB/T XXXXXXXXX45 试剂或材料除非另有规定，仅使用分析纯试剂。5.1 水：GB/T6682二级。5.2 RIPA裂解液（适用于动物组织或细胞）：见附录A中A.1。5.3 植物提取液将10 mL TCA和70 L -巯基乙醇加入到70 mL丙酮中，并定容至100 mL。5.4 植物裂解液（适用于植物组织或细胞）：见附录A中A.2。5.5 1.5 mol/L Tris-HCl，pH 8.8将18.15 g Tris-base加入80 mL水溶解，用1 mol/L HCl调
5、pH至8.8，然后用水定容至100 mL。5.6 1 mol/L Tris-HCl，pH 6.8称取12.1g Tris-base加入80 mL水溶解，用1 mol/L HCl调pH至6.8，然后用水定容至100 mL。5.7 30%（m/v）丙烯酰胺贮存液称取29 g丙烯酰胺单体和1 g N, N-甲叉双丙烯酰胺，加水溶解并定容至100 mL，过滤，置于棕色瓶，4 C避光保存，2个月内使用。5.8 10%（m/v）SDS称取10 g SDS，加水溶解并定容至100 mL，室温保存。5.9 10%（m/v）过硫酸铵称取1 g过硫酸铵，加水溶解并定容至10 mL。5.10 考马斯亮蓝溶液称100
6、 mg考马斯亮兰 G250，溶于 50 mL 95%的乙醇后，再加入120 mL 85%的磷酸，用水稀释至1 L，滤纸过滤，4保存。5.11 BSA溶液称量干燥的BSA 10 mg，用生理盐水配制成1.0 mg/mL的标准蛋白质溶液。5.12 5SDS上样缓冲液取 5 mL 1 mol/L Tris-HCl（pH 6.8）缓冲液、2 g SDS、1.2 mL -巯基乙醇、8 mL甘油、0.02 g溴酚蓝加入水中溶解，加水定容至40 mL。5.13 5SDS-PAGE电泳缓冲液贮存液称取23.5 g 甘氨酸和3.775 g Tris-base，加水溶解，定容至250 mL。使用时按如下比例稀释至
7、使用浓度：取133 mL 5SDS-PAGE电泳缓冲液，7 mL 10 % SDS溶液，水定容至700 mL。5.14 转膜缓冲液贮存液称取5.82 g Tris-base，2.93 g甘氨酸，0.375 g SDS，加水溶解，定容至800mL，再加200mL甲醇混匀，4 C保存。5.15 2 mol/L NaCl溶液将117 g NaCl加入水溶解，定容至1000 mL。5.16 1 mol/L Tris-HCl，pH 7.5将12.1 g Tris-base加入水溶解，用1 mol/L HCl调pH至7.5，然后用水定容至100 mL，然后高压灭菌后常温保存。5.17 TBS溶液量取 75
8、 mL 2 mol/L NaCl溶液和10 mL 1 mol/L Tris-HCl（pH 7.5）缓冲液，加水定容至1 L。5.18 TBST溶液量取 75 mL 2 mol/L NaCl溶液、10 mL 1 mol/L Tris-HCl（pH 7.5）缓冲液和1 mL Tween-20，加水定容至1 L。GB/T XXXXXXXXX56 仪器设备6.1 电泳仪。6.2 转膜仪。6.3 垂直电泳槽。6.4 天平：感量 0.001 g。6.5 脱色摇床。6.6 冷冻离心机：最大离心力 12000 rpm 以上。6.7 化学发光仪/红外荧光成像系统。6.8 振荡器。6.9 真空干燥器。7 测定步骤
9、7.1 总蛋白的提取7.1.1 动物总蛋白的提取将20 mg体外培养的细胞或研碎的组织转移至1.5 mL的Eppendorf 管中，加150250 L预冷的RIPA细胞裂解液（含蛋白酶抑制剂），振荡器震荡15 s，冰浴5 min，重复震荡-冰浴30 min后，4 C，12000 rpm离心10 min，上清液即为细胞总蛋白。7.1.2 植物总蛋白的提取在液氮中研磨植物材料/细胞，加入样品体积3倍的提取液在-20的条件下过夜，4 ，8000 rpm离心20 min，弃上清；加入等体积的冰浴丙酮（含 0.07 %的-巯基乙醇），摇匀，4 ，8000 rpm离心20 min，然后真空干燥沉淀，备用；
10、上样前加入裂解液，室温放置30 min，使蛋白充分溶解，15 ，8000 rpm离心1 h或更长时间，以没有沉淀为标准。7.2 蛋白定量7.2.1 标准曲线准确吸取适量 1.0 mg/mL 的 BSA 标准蛋白质溶液，加水逐级稀释，配制成质量浓度为 0 mg/mL、0.1 mg/mL、0.2 mg/mL、0.4 mg/mL、0.06 mg/mL 、0.8 mg/mL 、1.0 mg/mL 的系列标准工作溶液。准确移取标准工作溶液 0.1 mL 于试管中，加入考马斯亮兰 G250 溶液 5.0 mL，振荡混匀，静置 2 min。分光光度计测定标准工作溶液在 595 nm 处光吸收值 A595。用
11、标准工作溶液蛋白质量（mg）为横坐标，用吸光度值 A595 为纵坐标，绘制标准曲线。7.2.2 样品检测GB/T XXXXXXXXX6准确移取样品溶液0.1 mL于试管中，加入考马斯亮蓝G250溶液5.0 mL，振荡混匀，室温放置2 min。分光光度计上测定样品在595 nm处的光吸收值A595 。超出标准工作溶液质量浓度上限的样品应稀释后测定。根据测定的样品A595值，在标准曲线上查出样品的蛋白质含量。7.3 SDS-PAGE7.3.1 变性测完蛋白浓度后，计算含100 g总蛋白的溶液体积即为上样量。取出上样样品于Eppendorf管中，加入5 SDS上样缓冲液至终浓度为1，将样品于沸水中煮
12、35 min使蛋白质变性。7.3.2 制胶根据蛋白质相对分子质量大小选择相应的SDS-聚丙烯酰胺凝胶浓度，见附录A中A.3和A.4。7.3.3 上样取8.3.1的蛋白样品上样，相邻齿道加上预染蛋白质分子量标准。7.3.4 电泳凝胶上所加电压为8 V/cm，当染料进入分离胶后，把电压提高到15 V/cm，继续电泳直到溴酚蓝达到分离胶底部，然后关闭电源。7.4 转膜7.4.1 聚丙烯酰胺凝胶的准备将进行完SDS-PAGE后的凝胶浸泡于转膜缓冲液中15 min60 min。7.5.2 半干法转移蛋白质将转印膜和两张与转印膜相同尺寸的滤纸于转膜缓冲液中浸泡5 min。由下至上安装转移装置：阳极板-滤纸
13、-转印膜-凝胶-滤纸-阴极板，根据凝胶面积按0.65 mA/cm 2 接通电流，转移1.5 h2 h。7.5 封闭用封闭液于平板摇床上摇动封闭1 h。7.6 一抗结合按0.1 mL/cm 2的量加入适当比例稀释的第一抗体，在室温下持续摇动1 h以上或4 C缓慢摇动过夜。弃去一抗工作液，用TBST洗涤转印膜5 min，更换TBST后再洗涤20 min，再次更换TBST后洗涤5 min，最后用TBS洗涤滤膜5 min。7.7 二抗结合加入二抗工作液室温下持续摇动13 h。弃去二抗工作液，以TBST漂洗转印膜三次，每次10 min，最后用TBS漂洗滤膜5 min。7.8 成像7.8.1 辣根过氧化物
14、酶标记二抗的成像GB/T XXXXXXXXX7取ECL化学发光液A、B等量混匀，加在转印膜上，避光显色1 min5 min，化学发光仪成像。7.8.2 荧光标记二抗的成像利用荧光成像系统的相应光源激发后，接收发射光成像。8 结果分析成像图片本底干净，能看到印迹膜均匀的轻微背景轮廓，目的条带清晰且不过曝，即可判为目的蛋白表达。GB/T XXXXXXXXX8A A附 录 A试剂配制A.1 RIPA裂解液A.1.1 成分A.1.1.1 NaClA.1.1.2 TrisA.1.1.3 EDTAA.1.1.4 Triton X-100A.1.1.5 DeoxycholateA.1.1.6 SDSA.1.
15、1.7 水A.1.1.8 AprotininA.1.1.9 LeupeptinA.1.1.10 PMSFA.1.1.11 钒酸钠A.1.1.12 氟化钠A.1.2 制法 A.1.2.1 溶液A：将Tris-base 0.158 g、NaCl 0.18 g、0.1 g Deoxycholate、0.02 g SDS 和0.2 mL Triton X-100加入10 mL水溶解，用1 mol/L HCl调pH至7.4。A.1.2.2 溶液B：0.93g EDTA2Na溶于4 mL水中，再加入NaOH直至完全溶解，并定容至5 mL，终浓度为0.5 mol/L。A.1.2.3 溶液C：取40 uL 溶
16、液B加入溶液A中并定容至20 mL，4 保存。A.1.2.4 溶液D：取1mg Aprotinin溶于1 mL水中，-20 保存A.1.2.5 溶液E：取1mg Leupeptin溶于1 mL水中，-20 保存A.1.2.6 溶液F：取34.84 mg PMSF溶于1 mL水中，4 保存A.1.2.7 溶液G：取36.78 mg钒酸钠溶于1 mL水中，4 保存A.1.2.8 溶液H：取8.4 g氟化钠溶于1 mL水中，4 保存GB/T XXXXXXXXX9A.1.2.9 溶液I：取20 L溶液D，20 L溶液E，100 L溶液F，100 L溶液G，100 L溶液G加入到溶液C中，即为最终溶液。
17、A.2 植物裂解液A.2.1 成分A.2.1.1 CHAPSA.2.1.2 尿素 A.2.1.3 DTTA.2.1.4 水A.2.2 制法A.2.2.1 溶液A：将2.7 g尿素0.2 g CHAPS溶于3 mL灭菌的水中。A.2.2.2 溶液 B：3.09 g DTT 溶于 20 mL 水中。A.2.2.3 取 325 L 溶液 B 加入溶液 A 中，并定容至 5 mL。A.3 SDS-PAGE分离胶根据所需浓度不同，按照表A.1配置。表A.1 SDS-PAGE分离胶配制溶液成分（mL）凝胶浓度 1.5 mol/L Tris-HCl（pH 8.8）30% 丙烯酰胺溶液 10% SDS 溶液
18、10% 过硫酸铵溶液 TEMED 水6 % 2.5 2.0 0.1 0.1 0.008 5.38 % 2.5 2.7 0.1 0.1 0.006 4.610 % 2.5 3.3 0.1 0.1 0.004 4.012 % 2.5 4.0 0.1 0.1 0.004 3.315 % 2.5 5.0 0.1 0.1 0.004 2.3A.4 SDS-PAGE 浓缩胶按照表A.2配制SDS-PAGE浓缩胶。表A.25%SDS-PAGE分离胶配制溶液成分（mL）凝胶浓度 1 mol/L Tris-HCl（pH 6.8）30% 丙烯酰胺溶液 10% SDS 溶液 10% 过硫酸铵溶液 TEMED 水5 % 0.63 0.83 0.05 0.05 0.005 3.4GB/T XXXXXXXXX10_
