1、ICS 07.080A 21中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准GB/T XXXXXXXXXDNA 甲基化的测定 焦磷酸测序法Determination of DNA methylation-Pyrosequencing （征求意见稿）XXXX - XX - XX 发布 XXXX - XX - XX 实施GB/T XXXXXXXXXI前言本标准按照 GB/T 1.12009 给出的规则起草。本标准由中国标准化研究院提出并归口。本标准起草单位：本标准主要起草人：GB/T XXXXXXXXX1DNA 甲基化的测定 焦磷酸测序法1 范围本标准规定了焦磷酸测序法测定DNA甲基化的术语和定义、原理
2、、试剂或材料、仪器设备、测定步骤和结果分析。本标准适用动植物组织或体外培养细胞DNA甲基化的检测。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法。3 术语、定义和缩略语下列术语、定义和缩略语适用于本文件。3.1 术语和定义3.1.1DNA甲基化 DNA methylation 在DNA甲基转移酶的催化下，以S-腺苷甲硫氨酸为甲基供体，将甲基转移至碱基特定结构上的过程。3.2 缩略语3.2.1 PCR：聚合酶链式反应（p
3、olymerase chain reaction）。3.2.2 DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid）。3.2.3 RNA：核糖核酸（ribonucleic acid）。3.2.4 dNTP：脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleotide triphosphate）。3.2.5 ATP：三磷酸腺苷（adenylate triphosphate）。3.2.6 APS：5- 磷酰硫酸（adenosine- 5-phosphosulfate）。3.2.7 PPi：焦磷酸（ pyrophosphate）。3.2.8 dATPS：硫代型脱氧腺苷三磷酸（ deox
4、yadenosine alpha-thio triphosphate）。3.2.9 dTTP：脱氧胸苷三磷酸（deoxythymidine triphosphate）。3.2.10 dCTP：脱氧胞苷三磷酸（deoxycytidine triphosphate）。3.2.11 dGTP： 脱氧鸟苷酸三磷酸（ deoxyguanosine triphosphate）。3.2.12 PBS：磷酸盐缓冲液（phosphate balanced solution）。GB/T XXXXXXXXX24 原理DNA经重硫酸盐硫化处理后，DNA双链中的未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，通过随后的PCR，将尿嘧啶转
5、化为胸腺嘧啶，但重硫酸盐不能使已发生甲基化的DNA的胞嘧啶发生上述转化，因此转化后的DNA中凡是甲基化的胞嘧啶都会保持原样，而未甲基化的胞嘧啶都会变成胸腺嘧啶。然后利用焦磷酸测序的方法对重硫酸盐处理后的DNA的PCR产物中相应甲基化位点处的胞嘧啶和胸腺嘧啶的比例进行定量。焦磷酸测序是通过测序引物和PCR扩增单链DNA模板杂交，启动DNA复制，逐一加入四种dNTPs(dATPS、dTTP、dCTP、 dGTP)，如与模板配对，此dNTP与引物的末端形成共价键，释放焦磷酸基团；ATP硫酸化酶在底物APS存在的情况下催化焦磷酸形成ATP，ATP驱动荧光素酶介导的荧光素向氧化荧光素转化，氧化荧光素发出
6、与ATP量成正比的可见光信号；光信号由光电倍增器收集并由软件转化为峰，每个光信号的峰高与反应中掺入的核苷酸数目成正比。三磷酸腺苷双磷酸酶是一种核苷酸降解酶，可持续降解未结合的核苷酸和ATP，降解完成后，会添加另一种核苷酸。然后进下入一轮反应，如此循环即可测得相应位点各dNTP比例。5 试剂或材料除非另有规定，仅使用分析纯试剂。5.1 水：GB/T6682二级5.2 动物基因组 DNA 抽提试剂盒：含硅胶膜柱、2 mL 收集管、裂解液 1、裂解液 2、洗涤液 1、洗涤液2、洗脱液、蛋白酶 K、RNA 酶（100 mg/mL）。5.3 植物基因组 DNA 抽提试剂盒：含硅胶膜柱、2 mL 收集管、
7、均一化过滤柱、裂解液 1、裂解液 2、洗涤液 1、洗涤液 2、洗脱液、RNA 酶（100 mg/mL）。5.4 焦磷酸测序用引物.5.5 10PCR 缓冲液5.6 Taq DNA 聚合酶5.7 dNTP5.8 DNA 重硫酸盐快速转化试剂盒：含重硫酸盐溶液、DNA 保护液、无 RNA 酶水、硅胶膜柱、收集管、结合液 1、结合液 2、洗涤液、脱硫缓冲液、洗脱缓冲液、载体 RNA。5.9 焦磷酸测序试剂盒：含酶预混液、底物预混液(dATPS, dTTP, dCTP, dGTP)、退火缓冲液、结合缓冲液、变性缓冲液。5.10 70%（v/v）乙醇取 70 mL 无水乙醇加水稀释定容至 100 mL。
8、5.11 2 %（m/v）琼脂糖凝胶称取 2.000 g 琼脂糖置于烧瓶中，加 100 mL 电泳缓冲液，加热使琼脂糖充分溶解，然后加入 7 L 的溴化乙啶贮存液，混匀，将其缓慢的倒入放有梳子的制胶槽中，室温放置待琼脂糖凝固后拔下梳子，取出凝胶，4 保存备用。GB/T XXXXXXXXX35.12 6X 电泳加样缓冲液称取 0.250 g 溴酚蓝、40.000 g 蔗糖置于 100 mL 烧杯中，加蒸馏水至完全溶解后定容至 100 mL。5.13 电泳缓冲液称取 242.000 g Tris 溶于 800 mL 蒸馏水中，加 57.1 mL 冰乙酸和 100 mL 0.5 mol/L EDTA
9、（pH8.0），再加蒸馏水定容至 1000 mL，室温保存。稀释 50 倍使用。5.14 溴化乙锭贮存液称取 1.000 g 溴化乙锭加水稀释定容至 100 mL，磁力搅拌数小时，确保完全溶解，然后将溶液保存于棕色瓶中，室温保存。5.15 DNA 分子量标准（1002000 bp）6 仪器设备6.1 天平：感量 0.001g6.2 离心管：1.5 mL6.3 PCR 仪6.4 水平电泳槽6.5 电泳仪6.6 冷冻离心机：最大离心力 12000 g 以上6.7 紫外分析仪6.8 焦磷酸测序仪7 测定步骤7.1 DNA 提取按照动物或植物基因组DNA抽提试剂盒说明进行提取。7.2 DNA 重硫酸盐
10、转化按照DNA重硫酸盐快速转化试剂盒说明进行操作。7.3 甲基化 PCR 扩增目的片段7.3.1 PCR 反应体系在1020 ng重硫酸盐转化后的DNA溶液中加入10PCR缓冲液 5 L、5 U/L Taq DNA聚合酶0.25 L、20 pmol/L焦磷酸测序引物对中的上下游引物各0.5 L，用水补足体积至50 L，在PCR仪上扩增。GB/T XXXXXXXXX47.3.2 PCR 扩增产物电泳检测在电泳槽中加入电泳缓冲液，使液面刚刚没过含有溴化乙锭的琼脂糖凝胶；将36 L PCR扩增产物分别和适量电泳加样缓冲液混合，点样；以DNA分子量标准品做对照；9 V/cm 恒压电泳，直至溴酚蓝指示剂迁移至凝胶中部；紫外检测仪下观察电泳结果并记录；扩增到目标片段的PCR产物用于测序。7.4 焦磷酸测序用焦磷酸测序仪及焦磷酸测序试剂盒结合进行以下操作。在焦磷酸测序仪配套软件中生成运行程序，加载运行前试剂耗材和程序，将上样圆盘放入机器，按程序在相应的孔位加入10 L含生物素标记的PCR产物和3 L磁珠，运行焦磷酸测序仪程序，导出结果。8 结果分析使用焦磷酸测序仪将运行后的数据拷到电脑中，打开软件并载入运行后的文件，选择CpG模式，对每个样本的焦磷酸测序结果进行分析，结果中所测位点处显示的百分比数即为该位点甲基化的比例。分析软件会直接给出所测位点的甲基化比率，根据需要导出报告。_
