1、第三章 细胞的破碎与分离,本章的主要内容,常见的细胞壁结构,细胞破碎技术,包涵体的纯化方法,概述,不同类型的细胞分泌目标产物的类型： 动物细胞多分泌到细胞外培养液 植物细胞多为胞内产物 微生物（细菌/酵母/真菌）胞内、胞外， 对于胞内产物需要收集菌体或细胞进行破碎。,概述,大多数情况下，抗生素，胞外酶，一些多糖，及氨基酸等目标产物存在于发酵液中。 有些目标产物存在于生物体中。 尤其是由基因工程菌产生的大多数蛋白质是在细胞内沉积。 脂类物质和一些抗生素包含在生物体中。,大多数情况下，抗生素，胞外酶，一些多糖，及氨基酸等目标产物存在于发酵液中。 有些目标产物存在于生物体中。 尤其是由基因工程菌产生
2、的大多数蛋白质是在细胞内沉积。 脂类物质和一些抗生素包含在生物体中。,概述,细胞破碎就是采用一定的方法，在一定程度上破坏细胞壁和细胞膜，使细胞内容物包括目的产物成分释放出来的技术，是分离纯化细胞内合成的非分泌型生化物质（产品）的基础。,定义,微生物细胞和植物细胞外层均为细胞壁，细胞壁里面是细胞膜，动物细胞没有细胞壁，仅有细胞膜。 通常细胞壁较坚韧，细胞膜脆弱，易受渗透压冲击而破碎，因此细胞破碎的阻力主要来自于细胞壁。 不同细胞壁的结构和组成不完全相同，故细胞壁的机械强度不同，细胞破碎的难易程度也就不同。,细胞壁结构对破碎的影响,细菌细胞壁结构,几乎所有细菌的细胞壁都是由肽聚糖组成，它是难溶性的
3、聚糖链； 相邻聚糖链上的短肽又交叉相联，构成了细胞壁的三维网状结构，包围在细胞周围； 使细胞具有一定的形状和强度。,细菌细胞壁结构,破碎细菌的主要阻力是来自于肽聚糖的网状结构，其网结构的致密程度和强度取决于聚糖链上所存在的肽键的数量和其交联的程度。 革兰氏阴性菌的细胞壁结构与革兰氏阳性菌有很大不同。 革兰氏阴性菌典型的生物是大肠杆菌，通过这种细胞生产了很多细胞重组的产物。,酵母细胞壁的结构示意图,最里层是由葡聚糖的细纤维组成，它构成了细胞壁的刚性骨架，使细胞具有一定的形状， 上面的是一层糖蛋白， 最外层是甘露聚糖，由1,6-磷酸二酯键连接成网状。在该层的内部，有甘露聚糖-酶的复合物。 破碎酵母
4、细胞壁的阻力主要决定于壁结构交联的紧密程度和它的厚度。,真菌的细胞壁,真菌的细胞壁较厚，主要由多糖组成，其次还含有较少量的蛋白质和脂类。 不同的真菌，细胞壁的组成有很大的不同，其中大多数真菌的多糖壁是由几丁质和葡聚糖构成，少数含纤维素。 与酵母和细菌的细胞壁一样，真菌细胞壁的强度和聚合物的网状结构有关，不仅如此，它还含有几丁质或纤维素的纤维状结构，所以强度有所提高。,细胞壁的组成和结构,细胞破碎技术,细胞破碎技术,细胞破碎技术,细胞破碎方法及其原理,机械破碎,捣碎法 研磨法 匀浆法 超声法,物理破碎,温度差破碎法 压力差破碎法,化学破碎,有机溶剂： 表面活性剂： 酸碱,酶促破碎,自溶法 外加酶
5、制剂法,通过机械运动产生的剪切力，使组织、细胞破碎。,通过各种物理因素的作用，使组织、细胞的外层结构破坏，而使细胞破碎。,通过各种化学试剂对细胞膜的作用，而使细胞破碎,通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，使细胞外层结构受到破坏，而达到细胞破碎,一 机械法,机械破碎法又可分为： 高压匀浆破碎法（homogenization） 高速珠研磨破碎法（bead grinding） 超声波破碎法（ultrasonication）,进入珠磨机的细胞悬浮液与极细的玻璃小珠、石英砂、氧化铝等研磨剂（直径小于1mm）一起快速搅拌或研磨，研磨剂、珠子与细胞之间的互相剪切、碰撞，使细胞破碎，释放出内含物。在珠液
6、分离器的协助下，珠子被滞留在破碎室内，浆液流出从而实现连续操作。破碎中产生的热量一般采用夹套冷却的方式带走。,1.珠磨法（Bead mill）,原理：,Netzsch LM-20型珠磨机,园盘以两种位置交错地安装在轴上， 一种处于径向，一种与轴倾斜， 径向盘使磨料沿径向运动，倾斜盘则产生轴向运动。 由于交错的运动，提高了破碎效率。,A-具有冷却夹套的圆筒形磨室 B-具有冷却装置的搅拌轴和圆盘 C-环形震动侠缝分离器 D-变速马达 1和2料液进出口 3和4 搅拌冷却剂进出口 5和6磨室冷却剂进出口,珠磨机破碎作用方程,破碎作用是相对于时间的一级反应速度过程，符合下列公式：ln1/(1-x)=Kt
7、 x 破碎率；K一 一级反应速度常数；t一 时间。 K与搅拌转速、细胞悬浮液浓度和循环速度、玻璃小珠装量和珠体直径，以及温度等相关。,珠磨法的破碎率一般控制在80%以下：降低能耗、减少大分子目的产物的失活、减少由于高破碎率产生的细胞小碎片不易分离而给后续操作带来的困难。,该式中t在间歇操作时为破碎操作时间，连续操作时为细胞悬浮液在破碎室内的平均停留时间，即 t=V/Q V为破碎室的有效体积（即为悬浮液的体积），Q为料液流量。,胶体磨,德国进口珠磨机,甘蔗叶片和茎总RNA的提取及mRNA的分离纯化,1%琼脂糖凝胶电泳检测，显示28S、18S和5S rRNA特征条带清晰，说明得到的总RNA完整性好
8、，没有可见的降解，也无明显的基因组DNA污染。,甘蔗叶片和茎mRNA呈弥撒分布，长度都分布在0.53 kb范围内，完全符合建库要求。,图2-3 mRNA电泳检测结果 Fig.2-3 Agarose gel analysis of mRNA M: 1kb marker; 1: 叶片mRNA; 2: 茎mRNA M: 1kb marker; 1: leaf,s mRNA; 2: stem,s mRNA,甘蔗叶片和茎总RNA的提取及mRNA的分离纯化,双链cDNA（dscDNA）的合成及检测,甘蔗叶片和茎dscDNA都分布在0.53 kb之间。说明所获得的dscDNA是完整的。甘蔗叶片和茎dscDN
9、A图片差异较大，是用于电泳检测的dscDNA用量差异造成。,2.高压匀浆法（High-pressure homogenization）,利用高压使细胞悬浮液通过针形阀，由于突然减压和高速冲击撞击环使细胞破碎，细胞悬浮液自高压室针形阀喷出时，每秒速度高达几百米，高速喷出的浆液又射到静止的撞击环上，被迫改变方向从出口管流出。细胞在这一系列高速运动过程中经历了剪切、碰撞及由高压到常压的变化，从而造成细胞破碎。,原理：,大规模细胞破碎的常用方法，在微生物细胞和植物细胞的大规模处理中常采用,高压匀浆器的排出阀,影响高压匀浆器细胞破碎因素,被破碎的细胞分率符合如下公式：ln1/(1-R)=KNP 式中 R
10、 破碎率，为N次循环后，蛋白质的释放量Rn与最大释放量Rm之比；K 与温度有关的速度常数；P 操作压力，MPa； 与微生物种类有关的常数。,易造成堵塞的团状或丝状真菌 较小的革兰氏阳性菌 含有包含体的基因工程菌,不宜采用高压匀浆法的细胞类型。,影响匀浆破碎的主要因素： 压力、温度、通过匀浆器阀的次数,大、中、小型高压匀浆器,超声波破碎法（Ultrasonication)利用超声波振荡器发射的15-25kHz的超声波探头处理细胞悬浮液。 超声波振荡器以可分为槽式和探头直接插入介质两种型式，一般破碎效果后者比前者好。 超声波的细胞破碎效率与细胞种类、浓度和超声波的声频、声能有关。,3.超声破碎法（
11、Ultrasonication）,超声波破碎的机理一般认为在超声波作用下液体发生空化作用（cavitation), 液体中局部空穴的形成、增大和闭合产生极大的冲击波和剪切力，引起的粘滞性旋涡在细胞上造成了剪切力，使细胞内液体发生流动，从而使细胞破碎。 操作过程产生大量的热，因此操作需在冰水或外部冷却的容器中进行。,超声波破碎的适用范围,超声波破碎是很强烈的破碎方法，适用于多数微生物的破碎。 一般杆菌比球菌易破碎，G-细菌比G+细菌易破碎，对酵母菌的效果较差。 但超声波产生的化学自由基团能使某些敏感性活性物质失活。 超声波破碎的有效能量利用率极低 由于对冷却的要求相当苛刻，所以不易放大，但在实验
12、室小规模细胞破碎中常用。,机械法的缺点,（1）需要高的能量并且产生高温和高的剪切力，容易使不稳定产品变性失活； （2）就破碎的有机体或释放的产物而论，它们是非专一的，并且产生碎片微粒尺寸的大范围细分布，大量细颗粒给分离带来了困难。,二 非机械破碎方法,非机械法又可分为： 酶溶破碎法（enzyme lysis） 化学破碎法（chemical treatment） 渗透压冲击破碎法（osmotic shock） 冻融破碎法（freezing and thawing）,1.酶溶法（Enzymatic Lysis）,（1）外加酶法,常用的溶酶,溶菌酶 -1，3-葡聚糖酶 -1，6-葡聚糖酶 蛋白酶 甘
13、露糖酶 糖苷酶 肽键内切酶 壳多糖酶等,酶解是利用溶解细胞壁的酶处理菌体细胞，使细胞壁受到破坏后，再利用渗透压冲击等方法破坏细胞膜。,酶解法的特点是专一性强，因此在选择酶系统时，必须根据细胞的结构和化学组成来选择。 溶菌酶（lysozyme)能专一性地分解细胞壁上肽聚糖分子的-1,4糖苷键，因此主要用于细菌类细胞壁的裂解。革兰氏阳性菌悬浮液中加入溶菌酶，很快就产生溶壁现象。但对于革兰氏阴性菌，单独采用溶菌酶无效果，必须与螯合剂EDTA一起使用。 放线菌的细胞壁结构类似于革兰氏阳性菌，以肽聚糖为主要成分，所以也能采用溶菌酶， 酵母和真菌由于细胞壁的组分主要是纤维素、葡聚糖、几丁质等，常用蜗牛酶、
14、纤维素酶、多糖酶等。 植物细胞壁的主要成分是纤维素，常采用纤维素酶和半纤维素酶裂解。,（1）外加酶法,有时采用几种酶的混合物会产生更好的效果，加入时需确定相应的次序。对酵母细胞采用酶法破碎时，先加入蛋白酶作用蛋白质-甘露聚糖结构，使二者溶解，再加入葡聚糖酶作用裸露的葡聚糖层，最后只剩下原生质体，这时若缓冲液的渗透压变化，则细胞膜破裂，释出胞内产物。,（1）外加酶法,优点： 产品释放的选择性高；抽提的速率和收率高；产品的破坏最少；条件温和，对PH值和温度等外界条件要求低；不残留细胞碎片。,缺点： 溶酶价格高，溶酶法通用性差，产物抑制的存在。,酶溶法的优缺点,（2）自溶法（Autolysis）,自
15、溶作用是酶解的另一种方法，利用生物体自身产生的酶来溶胞，而不需外加其他的酶。 在微生物代谢过程中，大多数都能产生一种能水解细胞壁上聚合物的酶，以便生长过程继续下去。 自溶作用：改变其生长环境（温度、缓冲液），可以诱发产生过剩的这种酶或激发产生其它的自溶酶，以达到自溶目的。 缺点是：易引起所需蛋白质的变性，自溶后细胞悬浮液粘度增大，过滤速度下降。,某些化学试剂，如有机溶剂、变性剂、表面活性剂、抗生素、金属螯合剂等，可以改变细胞壁或膜的通透性（渗透性），从而使胞内物质有选择地渗透出来。,2.化学渗透法（Chemical permeation）,该法取决于化学试剂的类型以及细胞壁膜的结构与组成。,（
16、1）酸、碱处理法,酸处理可以使蛋白质水解成氨基酸，通常采用6mol/L HCl。 碱能溶解细胞壁上脂类物质或使某些组分从细胞内渗漏出来。 成本低，反应激烈，不具选择性。,采用酸碱调节溶液的PH值，改变细胞所处的环境，从而改变两性产物蛋白质的电荷性质，使蛋白质之间或蛋白质与其他物质之间的作用力降低而易于溶解到液相中去，便于后面的提取。,（2）表面活性剂,无论表面活性剂是阴离子、阳离子还是非离子型，都是两性的，既能和水作用也能和脂作用，能与细胞壁上的脂蛋白结合，形成微泡，使膜的通透性增加或溶解,细胞破碎常用的表面活性剂： 十二烷基硫酸钠（SDS，阴离子型）； 非离子型如Triton X-100和吐
17、温（Tween）等 对疏水性物质具有很强的亲和力，能结合并溶解磷脂，破坏内膜的磷脂双分子层，使某些胞内物质释放出来。,能被细胞壁脂质层吸收后，使胞壁膜溶胀，细胞破裂，胞内物质被释放出来。乙醇、异丙醇、甲苯、苯、氯仿、二甲苯及高级醇等。,（3）有机溶剂,与水中氢键作用，削弱溶质分子间的疏水作用，从而使疏水性化合物溶于水溶液。盐酸胍和脲是常用的变性剂。,通用性差； 时间长，效率低，一般胞内物质释放率不超过50% ； 有些化学试剂有毒 。 化学试剂的加入常会给随后产物的纯化带来困难，并影响 最终产物纯度。,化学渗透法优缺点：,缺点：,优点： 对产物释放有一定的选择性，可使一些较小分子量的溶质如多肽和
18、小分子的酶蛋白透过，而核酸等大分子量的物质仍滞留在胞内； 细胞外形完整，碎片少，浆液粘度低，易于固液分离和进一步提取。,2.物理法（Physical permeation）,渗透压冲击法 冻结-融化法 干燥法,1）渗透压冲击法,渗透压冲击是较温和的一种破碎方法 将细胞放在高渗透压的溶液中（如一定浓度的甘油或蔗糖溶液），由于渗透压的作用，细胞内水分便向外渗出，细胞发生收缩，当达到平衡后，将介质快速稀释，或将细胞转入水或缓冲液中，由于渗透压的突然变化，胞外的水迅速渗入胞内，引起细胞快速膨胀而破裂。 仅适用于细胞壁较脆弱的细胞或细胞壁预先用酶处理或在培养过程中加入某些抑制剂（如抗生素等），使细胞壁有
19、缺陷，强度减弱。,2）冻结-融化法,将细胞放在低温下突然冷冻而在室温下缓慢融化，反复多次而达到破壁作用。 一方面使细胞膜的疏水键结构破裂，另一方面胞内水结晶，使细胞内外溶液浓度变化，引起细胞膨胀而破裂。 适用于细胞壁较脆弱的菌体，破碎率较低，需反复多次。,3）干燥法,使细胞结合水分丧失，从而改变细胞的渗透性。当采用丙酮、丁醇或缓冲液等对干燥细胞进行处理时，胞内物质就容易被抽提出来。气流干燥主要适用于酵母菌，一般在25-30的气流中吹干； 真空干燥多用于细菌。 冷冻干燥适用于不稳定的生化物质,选择破碎方法的依据,细胞处理量； 细胞壁强度和结构(高聚物交联程度、种类和壁厚度)； 目标产物对破碎条件
20、的敏感性； 破碎程度； 目标产物的选择性释放,选择性释放目标产物的一般原则,仅破坏或破碎存在目标产物的位置周围 当目标产物存在于细胞膜附近时，可采用较混和的方法，如酶溶法、渗透压冲击法和冻结融化法等。当目标产物存在于细胞质内时，则需采用强烈的机械破碎法 当目标产物处于与细胞膜或细胞壁结合的状态时，调节溶液PH值，离子强度或添加与目标产物具有亲和性的试剂如：螯合剂、表面活性剂等，使目标产物容易溶解释放。 (2)机械破碎法和化学法并用可使操作条件更加温和，在相同的目标产物释放率条件下，降低细胞的破碎程度。,破碎率的测定与破碎技术的研究方向,1. 破碎率的测定,直接测定法目的产物测定法导电率测定法,
21、采用染色法把破碎的细胞与未破碎的细胞区别开来。 如破碎的革兰氏阳性菌可染成革兰氏阴性菌的颜色； 采用革兰氏染色法染色酵母破碎液，完整的细胞呈紫色，而受损害的细胞呈亮红色。,将破碎后的细胞悬浮液离心，测定上清液中目的产物含量或活性，并与100%破碎率的标准值比较，计算其破碎率。,细胞破碎后，大量带电荷的内含物被释放到水相，使导电率上升。,2.破碎技术的研究方向,多种破碎方法相结合 与上游过程相结合 与下游工程相结合,基因工程表达产物后处理的特殊性,基因工程菌培养液不同表达形式的前处理 胞外分泌型表达：离心,收集液相浓缩纯化。 胞内表达： 胞内可溶性表达：离心,收集菌体细胞破碎离心，收集上清纯化
22、胞内周质表达：离心,收集菌体低浓度溶菌酶或渗透压冲击等溶解目标物离心,收集上清液纯化。 不溶性包涵体：离心,收集菌体细胞破碎离心,收集沉淀包涵体洗涤目标蛋白变性溶解复性纯化。,外源蛋白在大肠杆菌中的积累,包含体的形成,包涵体：一种蛋白质不溶性聚集体，包括目标蛋白、菌体蛋白等。目标蛋白一级结构是正确的，但立体结构是错误的，所以没有生物活性。 包涵体的形成：大肠杆菌中目标产物的表达水平过高，超过正常代谢水平，过多表达产物聚集在细胞内，形成不溶性的包涵体。 高表达产生的积聚物在细胞内部形成不溶物原因？ 蛋白过量积聚，超过溶解度，导致沉淀； 蛋白生成太快，分子间疏水基团相互作用而聚集沉淀； 蛋白生成太
23、快，分子内部二硫键的错误连接导致沉淀； 表达蛋白过多，与其结合/诱导组分不足，不能形成溶解状态 蛋白质自身不稳定。,基因工程包涵体的纯化方法,收集菌体细胞,细胞破碎,包涵体的洗涤,目标蛋白的变性溶解,目标蛋白的复性,包含体的出现不仅增加了生物分离设计的难度，也为蛋白质折叠机理研究提出了新的课题。 欲获得天然活性态的目标产物，必需分离包含体后，溶解包含体并使其中的目标蛋白恢复应有的天然活性。,包涵体获得 几种常见的工艺路线(一),机械破碎 (高压匀浆、高速珠磨）,离心提取包含体,加变性剂溶解,除变性剂复性,特点:是利用了包含体与细胞碎片的密度差，用离心法将包含体与细胞碎片和可溶性蛋白质分开，获得
24、了干净的包含体，再对包含体溶解复性。 优点：摆脱了大量的杂蛋白、核酸、热原、内毒素等杂质，使后面的分离纯化简单了。从这个角度上讲，包含体的形成对分离纯化亦有好处。 缺点:要经过几次离心才能除去大部分的细胞碎片，加工时间较长。,路线1 的特点,包涵体获得 几种常见的工艺路线（二）,机械破碎,膜分离获得包涵体,加变性剂溶解包含体,除变性剂复性,路线（二）应用了膜分离技术，用微孔膜除去可溶性蛋白质。 优点是封闭式操作，不污染环境也不受环境污染，能量消耗也比离心法少。 缺点：细胞碎片和包含体一起被膜挡住，难以分开；而且膜的堵塞和浓差极化常常导致可溶性蛋白质的滞留。,路线2 的特点,包涵体获得 几种常见
25、的工艺路线（三）,化学破碎 （加变性剂）,离心除细胞碎片,除变性剂复性,用化学法破碎，所采用的试剂既可以破碎又可以溶解包含体，将两道工序和为一道，节省了设备和时间，比前两者更适合于实验室操作。 缺点是所有的可溶性杂质都没有除去，混杂在产物中间，给后续分离带来困难。,路线三：,1）包涵体的洗涤细胞破碎后，包含体呈颗粒状，致密。 洗涤的重要性：收集的沉淀中，除包涵体外，还包括许多杂质，如膜蛋白、肽聚糖、脂多糖等，复性时会与目标蛋白一起复性形成杂交分子而聚集，给后步纯化带来困难。 洗涤剂：温和的表面活性剂、蔗糖、低浓度的弱变性剂（如尿素）或脱氧胆酸等。能溶解除去部分膜蛋白和脂质类杂质。 洗涤剂浓度以
26、溶解杂质，不溶解包涵体中表达产物为原则。,2）包涵体的变性溶解 包涵体中不溶性的目标蛋白必须溶解到液相中，才能进一步纯化。一般水溶液很难将其溶解，只有采用蛋白质变性才能使其形成可溶性的形式。 常用变性剂： 5-8 mol/L盐酸胍和6-8 mol/L尿素, 作用：破坏离子间相互作用； 表面活性剂如1-2 SDS， 作用：破坏蛋白质肽链间的疏水相互作用。 PH9.0的碱溶液和有机溶剂，使用较少。 影响变性因素：时间、pH、离子强度、变性剂种类和浓度。,3） 目标蛋白的复性,原理：在变性剂溶液中，溶解的蛋白质呈变性状态，即蛋白质高级结构被破坏，但一级结构和共价键没有破坏。当部分变性剂被除去后，蛋白
27、质会重新折叠成具有活性的正确构型，该过程称复性。 复性方法： 稀释法除变性剂 加入大量水或缓冲液。 膜分离法除变性剂 透析、超滤、电渗析。 层析法：凝胶层析，高效疏水层析,蛋白质一级结构：在每种蛋白质中氨基酸按照一定的数目和组成进行排列，并进一步折叠成特定的空间结构前者我们称为蛋白质的一级结构，也叫初级结构或基本结构。 蛋白质二级结构：指蛋白质多肽链本身的折叠和盘绕的方式。二级结构主要有-螺旋、-折叠、-转角。常见的二级结构有-螺旋和-折叠。二级结构是通过骨架上的羰基和酰胺基团之间形成的氢键维持的，氢键是稳定二级结构的主要作用力。 蛋白质三级结构: 蛋白质分子处于它的天然折叠状态的三维构象。三
28、级结构是在二级结构的基础上进一步盘绕，折叠形成的。三级结构主要是靠氨基酸侧链之间的疏水相互作用，氢键，范德华力和静电作用维持的。 蛋白四级结构：在体内有许多蛋白质含有2条或2条以上多肽链，才能全面地执行功能。没一条多肽链都有其完完整的三级结构，称为亚基（subunit），亚基与亚基之间呈特定的三维空间分布，并以非共价键相链接，这种蛋白质分子中各亚基的空间排布及亚基接触部位的布局和相互作用，称为蛋白质的四级结构（Quaternary structure） 。也是指亚基的种类，数目及各个亚基在寡聚蛋白中的空间排布和亚基之间的互相作用。,作业,1、细胞破碎主要有哪几种方法？ 2、机械法细胞破碎与非机械法相比较有何特点？ 3、机械法中的高压匀浆法和超声波法的原理是什么？ 4、什么是酶溶法，酶溶法有何优缺点？ 5、什么是包涵体？包涵体是如何形成的？,
