1、生物化学分析实验南 京 罗大学 喜生二 命 牛零 科零 学 九 学年 院九 生月 物修 化订 学版 系目 录第一单元 分光光度法实验方法 1实 验 一 紫外分光光度法测定蛋白质吸收光谱曲线及含量 1实 验 二 核黄素的荧光光度定量测定法 4第二单元 柱层析分离纯化实验方法 7实 验 三 离子交换柱层析法 7实 验 四 凝胶渗透层析法 11 实 验 五 DEAE纤维素梯度层析法 14实 验 六 疏水层析（HIC）法 18第三单元 亲和柱层析分离纯化实验方法 22实 验 七 亲和层析分离纯化尿激酶 22实 验 八 亲和层析分离纯化胰蛋白酶 27实 验 九 亲和层析分离纯化胰蛋白酶抑制剂 32第四单
2、元 电泳检测分离纯化实验方法 38实 验 十 聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳 38实验十一 SDS聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳（1） 43实验十二 SDS聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳（2） 47实验十三 聚丙烯酰胺凝胶垂直平板电泳 52实验十四 SDS聚丙烯酰胺凝胶垂直平板电泳 56实验十五 管式凝胶等电聚焦 61实验十六 单向火箭琼脂糖凝胶免疫电泳 65实验十七 潜水式琼脂糖凝胶电泳 68实验十八 U 型管密度梯度等电聚焦 71实验十九 聚丙烯酰胺凝胶电泳的蛋白银染色法 74实验二十 聚丙烯酰胺凝胶电泳的蛋白铬银染色法 771第一单元 分光光度法 实 验 一紫外分光光度法测定蛋白质吸收光谱曲线及含量1、实验目的
3、与要求：（1） 、了解紫外分光光度仪的基本原理和使用方法。（2） 、学习和掌握紫外吸收光谱曲线的制作方法。（3） 、了解和掌握蛋白质的定性、定量测定原理和方法。2、实验原理： 蛋白质所含有的一些芳香族氨基酸（主要是苯丙氨酸，酪氨酸）具有共轭双键结构能够产生 及 n类型的电子跃迁，因此能够在近紫外光区产生光吸收，并且在 280 nm波长处有一特征吸收峰。利用这一特性，通过对蛋白质紫外吸收光谱曲线的测定，可以进行定性分析。根据蛋白质溶液在 280 nm 波长处的吸光度，在一定范围内与其浓度呈正比关系，可以进行定量测定。3、实验仪器与器材：3-1、实验仪器：（1） 、 紫外分光光度计（2） 、 混合
4、器（4） 、 天 平3-2、实验器材：（1） 、 可调取液器 （2） 、 试 管 （3） 、 试管架 （4） 、 吸 管 （5） 、 吸管架 （6） 、 烧 杯 （7） 、 滴 管（8） 、 定容瓶 （9） 、 洗耳球 （10） 、剪 刀（11） 、镊 子（12） 、玻 棒（13） 、骨 勺 （14） 、称量纸 （15） 、吸水纸 （16） 、洗 瓶 （17） 、标签纸2 3-14、试剂及配制：4-1、牛血清白蛋白标准品溶液的配制（1.0 毫克/毫升）： 准确称取牛血清白蛋白标准品 50 毫克，置于 50 毫升容量瓶中，然后加蒸馏水定容至刻度，溶解混匀后即为浓度 1.0 毫克/毫升的标准品溶液
5、。4-2、牛血清白蛋白测试品溶液的配制（1.0 毫克/毫升）：准确称取牛血清白蛋白测试品 50 毫克，置于 50 毫升容量瓶中，然后加蒸馏水定容至刻度，溶解混匀后即浓度为 1.0 毫克/毫升的测试品溶液。方法一、蛋白质的紫外吸收光谱曲线测定与制作1-1、蛋白质的紫外吸收光谱曲线的测定：采用 2 只光径 1.0 厘米洁净的石英比色杯，分别倒入蒸馏水 4.0 毫升和牛血清白蛋白标准品（或测试品）溶液 4.0 毫升于各比色杯中，以蒸馏水为空白溶液，调节仪器零点。样品溶液在 250300 nm 波长的范围内，每间隔 5 个 nm 波长依次测定，同时记录各波长蛋白质溶液的吸光值。在每次更换测定波长时均需
6、要重新用空白溶液调节仪器的零点后，方能再测定样品溶液。对测定波长的范围和间隔大小，亦可根据不同样品的情况和要求加以确定（加大或缩小间隔） 。1-2、蛋白质的紫外吸收光谱曲线的制作：以测定的波长为横坐标，相对应的吸光值为纵坐标对应作图。将图中各点用线连起来，即得到蛋白质的紫外吸收光谱曲线，其中最大吸收峰值所对应的波长即为该蛋白质最大吸收波长。方法二、蛋白质的紫外分光光度法含量测定2-1、牛血清白蛋白标准品溶液的配制：将已配好的牛血清白蛋白标准品（BSA）溶液（浓度为：1.0 毫克/毫升） ，按表 1 稀释成六种不同浓度的标准品溶液。表 1、六种不同浓度的标准品溶液的配制方法及结果表管 号 0 1
7、 2 3 4 5 6 样品BSA 溶液 (ml) 0.0 0.5 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0蒸馏水 (ml) 5.0 4.5 4.0 3.0 2.0 1.0 0.0总体 积 (ml) 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0实际含量(mg/ml) 0.0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0A280 nm2-2、牛血清白蛋白测试样品溶液的配制：将未知测试样品按估计含量，用蒸馏水配成在标准曲线范围内的浓度，估计浓度应尽量接近标准曲线中间点的浓度。如果测试样品估计浓度超出（低或高）标准曲线范围需重新配制。2-3、标准品溶液及测试样品溶液的测定：以蒸馏水（或样品的
8、溶剂）为空白，在 280 nm 波长处，分别测定标准品溶液和测试样品溶液的吸光值。 3-2 32-4、标准曲线的制备：（1） 、以所测得的标准品溶液吸收值为纵坐标，相应已知的标准品含量为横坐标对应作图，既得标准品溶液吸收值和含量的标准曲线。（2） 、将被测试样品的吸光值在标准曲线上查出相应蛋白质含量。友情提醒：切记！实验结束后，应及时关闭自己所有使用的仪器、设备电源开关，及时清洗自己所使用的全部玻璃器皿，及时清理自己使用范围内的台面等。为养成良好的实验操作习惯。从这节课起，我们大家就一起携起手来，开始各自从我做起来吧明天的工作环境，由于我们今天养成的良好习惯，一定会更加美好！今天的南大学子不仅
9、需要业务精湛，还需要有榜样的作用。榜样的力量是无穷的，这一点也需切记。来，同学们，快动起来！4 3-3 核黄素 二氢核黄素第一单元 分光光度法 实 验 二荧光光度法测定核黄素含量 1、实验目的和要求：（1） 、了解荧光法测定核黄素的原理和方法。（2） 、学习荧光光度计的操作和使用。（3） 、掌握荧光定量分析的工作曲线。2、实验原理：核黄素（维生素 B2）是一种异咯嗪衍生物。在水及乙醇的中性溶液中为黄色，并且有很强的荧光，这种荧光在强酸和强碱中易被破坏。核黄素可被亚硫酸盐还原成无色的二氢化物，同时失去荧光，因而样品的荧光背景可以被测定。二氢化物在空气中易重新氧化，恢复其荧光，其反应如下：核黄素的
10、激发光波长范围约为 440500nm(一般规定为 440nm),发射光波长范围约为510550nm(一般规定为 520nm)。利用核黄素在稀溶液中荧光的强度与核黄素的浓度呈正比，由还原前后的荧光差数可以进行定量测定。根据核黄素的荧光特性亦可进行定性鉴别。3、实验仪器与器材：3-1、实验仪器：（1） 、 荧光光度计（2） 、 磁力搅拌器（3） 、 天 平（4） 、 水浴锅（5） 、 混合器3-2、实验器材：（1） 、 可调取液器 （2） 、 试 管 （3） 、 试管架 （4） 、 吸 管（5） 、 吸管架 （6） 、 容量瓶（7） 、 烧 杯 （8） 、 量 筒 （9） 、 滴 管 （10） 、
11、镊 子 3-1 5 （10） 、镊 子（11） 、剪 刀 （12） 、玻 棒 （13） 、骨 勺 （14） 、称量纸 （15） 、吸水纸 （16） 、吸耳球（17） 、记号笔或标签纸 4、试剂与配制：4-1、试剂： （1） 、连二亚硫酸钠（保险粉）或亚硫酸钠（2） 、核黄素（3） 、冰醋酸4-2、试剂配制：（1） 、连二亚硫酸钠（保险粉）或亚硫酸钠 ，直接用.（2） 、36%醋酸溶液的配制：取冰醋酸 36.0 毫升,用蒸馏水稀释至 100.0 毫升，混匀即可。 （3） 、核黄素标准品（母）溶液（10.0ug/ml）的配制：准确称取核黄素 10.0 毫克，放入预先装有少量蒸馏水（50ml）的 1
12、000.0 毫升容量瓶中，加入 5.0 毫升 36%醋酸溶液，再加约 800.0 毫升蒸馏水，置水浴中避光加热直至溶解。冷却至室温，用蒸馏水再定容至 1000.0 毫升，混匀即可。5、操作步骤：5-1、核黄素标准品溶液的配制：用已配制的核黄素标准品溶液（10.0ug/ml） ，按表 1 再稀释成六种不同浓度。表 1、核黄素标准品溶液配制方法表步 骤 / 管 号 0 1 2 3 4 5 样品标 准 品 母 液（ml）2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.25蒸 馏 水（ml）7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 9.75总 体 积（ml）10.0 10.0 10.0 10.0 10.0
13、10.0核黄素 含量（ug/ml）2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.255-2、核黄素样品溶液的配制：将被测试的核黄素样品参照标准品溶液的含量范围和溶剂体系配成测定溶液。对于食物和生物材料中的核黄素测定，一般需要事先经过抽提，或分离、纯化处理后，方可测定。5-3、荧光测定：(1)、选用滤色片：参照附录中荧光光度计的使用说明，选用滤色片。核黄素荧光测定的激发光波长为 455nm，发射波长为 523nm。因此可选用带普通型 400nm（兰字）滤色片，选用截止型 510nm 滤色片为发射光滤色片，同时启动仪器进行预热。（2） 、调仪器满刻度：待仪器预热后，用 2.5ug/ml（含量最高的）
14、的溶液调荧光光度计相对荧光强度，既调读数到满刻度（100%） ，反复多次，直至数据稳定为止。调好的满刻度，在整个实6 3-2 验结束之前，不可随意重调满刻度。（3） 、标准品和测试样品的测定：A、未还原时标准品和测试样品溶液荧光强度的测定( F 1 )：调好满刻度之后，分别从高浓度到低浓度依次测定表 1 所配制的各浓度的标准品溶液和测试样品溶液的荧光强度，并记录各自的读数。需要特别注意的是：在每一份溶液测定完后，必需重新倒回到各自的原试管内，供测试溶液还原用。在测定中如果测试溶液的荧光强度超出 100%或荧光强度过低，则需要重新配制。B、还原后标准品和彩色测试品溶液荧光强度的测定 ( F 2
15、)：再在上述已测定并倒回到各自试管内的溶液中，分别加入连二亚硫酸钠（保险粉）约 10.0 毫克，经溶解混匀后，再重新测其各自荧光强度，并记录其读数。5-4、数据处理：每一个测定溶液的实际荧光强度校正公式为：F = F1 - F2F : 校正后的实际荧光强度F1：未还原时测定的荧光强度F2：还原后测定的荧光强度 友情提醒：切记！实验结束后，应及时关闭自己所有使用的仪器、设备电源开关，及时清洗自己所使用的全部玻璃器皿，及时清理自己使用范围内的台面等。为养成良好的实验操作习惯。从这节课起，我们大家就一起携起手来，开始各自从我做起来吧明天的工作环境，由于我们今天养成的良好习惯，一定会更加美好！今天的南
16、大学子不仅需要业务精湛，还需要有榜样的作用。榜样的力量是无穷的，这一点也需切记。3-3 7第二单元 柱层析法 实 验 一离 子 交 换 柱 层 析 法 1、实验目的与要求：本实验是采用阳离子交换树脂所装的柱，选以特定的 pH 缓冲洗脱液，以恒溶剂洗脱的方式来分离含有两个性质不同的氨基酸溶液。通过实验要求掌握装柱、平衡、上样、洗涤、洗脱、收集、测定等离子交换柱层析技术的要点。2、实验原理：有些高分子物质含有一些可以分离的基团，例如SO 3H；COOH 等，因此可以和溶液中的离子产生交换反应。如： RSO3H + M+ RS3M + H+或 RNH3OH + CL RNH3CL + OH这类高分子
17、物质通称离子交换剂，其中使用最普遍的是离子交换树脂。由于一定的离子交换剂对不同离子的亲和力不同，因此在洗提过程中，不同的离子在离子交换柱上的迁移速度也不同，最后得到分离。3、实验仪器、器材与装置：3-1、实验仪器：（1） 、 紫外、可见分光光度计（2） 、 水浴锅（或电炉与容器）（3） 、 自动部分收集器（4） 、 磁力搅拌器 （5） 、 混合器（6） 、 恒流泵（7） 、 天 平3-2、实验器材：（1） 、 可调取液器 （2） 、 连续加液器 （3） 、 层析柱 （4） 、 吸 管 （5） 、 吸管架 （6） 、 试 管 （7） 、 试管架 （8） 、 烧 杯 8 4-1 （9） 、 量 筒
18、 （10） 、滴 管 （11） 、玻 棒 （12） 、剪 刀 （13） 、镊 子 （14） 、骨 勺 （15） 、洗耳球 （16） 、称量纸 （17） 、吸水纸 （18） 、保膜鲜 （19） 、标签纸（20） 、胶布条 3-3、实验装置：图 1 离子交换层析实验装置图4、试剂与配制：4-1、实验试剂：（1） 、 阳离子交换树脂（2） 、 天门冬氨酸（3） 、 赖 氨 酸（4） 、 无水乙醇（5） 、 95%乙醇（6） 、 氢氧化钠（7） 、 柠 檬 酸烧杯 恒流泵 层析柱 部分收集器（8） 、 茚 三 酮（9） 、 浓 硫 酸（10） 、盐 酸4-2 9 4-2、试剂配制：（1） 、洗脱溶液的
19、配制（0.45mol/L;pH5.3,柠檬酸缓冲）：称取柠檬酸 2.85 克，氢氧化钠 1.86 克于一烧杯中，先用少量蒸馏水溶解，再加浓硫酸1.05 毫升，最后用蒸馏水稀释至 100 毫升，混匀即可。（2） 、盐酸（0.02mol/L HCL）溶液的配制:吸取 1.0 mol / L HCL,1.0 毫升，用蒸馏水稀释至 50.0 毫升，混匀即可。（3） 、样品溶液的配制（LASP 和 LYS）：分别称取赖氨酸和天门冬氨酸各 7.0 毫克，然后加 0.02 mol / LHCL10 毫升溶解即可。（4） 、60%乙醇溶液的配制：取 95%乙醇 63.0 毫升，加蒸馏水至 100.0 毫升，混
20、匀即可。（5） 、显色剂的配制：称取茚三酮 2.0 克于一烧杯中，然后加无水乙醇 100.0 毫升溶解即可。5、实验操作步骤：5-1、树脂的处理：有关市售新树脂的处理和树脂浮选的方法参见教材讲义所述，本实验采用已处理好的树脂。5-2、装层析柱：（1） 、选择层析柱，观察柱底端过滤是否完好，将选择的层析柱垂直装在台式铁架上，关闭柱底部出口，在柱内注入少许（约 1.0 cm 高）洗脱液。（2） 、将烧杯中已处理好的树脂，加适量的洗脱液，搅成悬浮状，然后沿柱内壁小心的加至适当高度。倒入时不要太快，以免产生泡沫和气泡。（3） 、待树脂在柱子底部有明显沉积（10 分钟左右）后，慢慢打开柱底部的出口，或用
21、吸管吸去柱内上层过多的洗脱夜，继续向柱内加入悬浮的树脂直至沉积后柱床体高度达 6.0 厘米为止。（4） 、在装柱时要避免使柱内液体流干而使装柱失败。另外树脂悬浮液的温度要相对恒定或应与室温接近，否则柱床体内易产生气泡而影响层析效果。（5） 、检查层析柱是否装好。装好的层析柱应该没有“纹路” ，节痕和气泡，并且柱床体表面平整而均匀。这样方可投入使用，否则需要按上述步骤(1-4)重新装柱直至达到要求为止。（6） 、在装柱的同时应将其他仪器设备（如：自动部分收集器，恒流泵）接通电源，并按实验要求进行调试。5-3、层析柱平衡：层析柱装好后接上已调好流速的恒流泵，用洗脱液以 0.4 ml / min 的
22、流速进行平衡，直至流出液的 pH 与洗脱液的 pH 相同为止（大约 2-3 倍柱床体积） 。5-4、层析柱加样：（1） 、移去层析柱上端出口塞，打开层析柱底端出口，小心使层析柱内液体流至层析柱床体表面时即行关闭。（2） 、打开自动部分收集器电源开关，以 0.4ml / min 的流速，按 4.0 ml / 10.0 min / 管的条件开始进行收集。（3） 、自动部分收集器电源开关打开后，用自动吸管吸取 0.5 毫升氨基酸混合样液沿柱内壁缓慢地加入柱中，以免冲坏树脂表面。加样完毕后，慢慢打开层析柱底端出口，使液面流至与树脂表面相平时即行关闭。 5-5、层析柱洗涤：用自动吸管（或滴管）吸取适量（
23、0.5ml）洗脱液，重复上样方法反复洗涤层析柱内壁四周2-3 次，当最后一次洗脱液面流至与树脂表面相平时即行关闭柱底端出口。5-6、层析柱洗脱： 10 4-3 用自动吸管（或滴管）吸取洗脱液，沿柱内壁缓慢地加入柱中，以免冲坏树脂表面。加至约 2-3 厘米高后，接上移去的层析柱上端出口塞，同时打开层析柱底端出口和已调好流速的恒流泵开关，开始进行自动洗脱。5-7、收集样液：以每管 4.0 毫升的条件进行收集，约需收集 12-15 管即可。也可一边收集，一边测定，根据测定结果来确定收集的管数，即结果所显示的第二样品峰完全洗脱完毕。此时即可停止收集。5-8、样液的测定：（1） 、将收集的各管按序编号后
24、，依次分别吸取各管收集液 0.5 毫升，于另一批同样编号的各对应的试管中。（2） 、然后各管分别加入洗脱缓冲液 1.0 毫升和茚三酮溶液 0.5 毫升,混匀后于 100 度沸水浴中加热 20 分钟左右，然后用自来水冷却至室温。（3） 、再在各管分别加入 60%乙醇溶液 3.0 毫升，用混合器混匀，即可。（4） 、混匀后的各管样液，以“0”号管为对照管于 570 nm 处进行比色。（5） 、测定后，以光吸收值（A570nm）为纵坐标，收集的管数（或体积）为横坐标绘制洗脱曲线图。同时书写出结论性报告结果。友情提醒：实验结束后，请立即回收树脂，清洗层析柱、管道及其它用具、器皿、台面等等。上次你做到了
25、吗？11 4-4 第二单元 柱 层 析 法 实 验 二凝 胶 渗 透 层 析 法 1、实验目的与要求： 用凝胶柱，分离一含有溶质分子大小不同的样品溶液。并绘出洗脱曲线。通过实验了解并熟悉凝胶渗透层析的原理和实际应用。2、实验原理：凝胶渗透层析就是按照溶质分子的大小不同而进行分离的一种层析技术。当溶质分子大小不同的样品溶液通过凝胶柱时，由于凝胶颗粒内部的网络结构具有分子筛效应，分子大小不同的溶质就会受到不同的阻滞作用。分子量大的因不易渗入网络，被排阻在颗粒外，因而所受到的阻滞作用小，先流出层析床，分子量小的因能渗透到网络内部洗脱流程长，因而所受到的阻滞作用大，后流出层析床，这样就可以达到分离的目
26、的。3、实验仪器、器材与装置：3-1、实验仪器：（1） 、 层析工作站装置（2） 、 笔记本电脑（2） 、 紫外检测仪（3） 、 磁力搅拌器（4） 、 恒流泵（5） 、 混合器（6） 、 天 平3-2、实验器材：（1） 、 可调取液器 （2） 、 砂芯漏斗 （3） 、 吸 管 （4） 、 吸管架（5） 、 烧 杯 （6） 、 量 筒 （7） 、 抽滤瓶 （8） 、 层析柱 （9） 、 滴 管（10） 、玻 棒（11） 、剪 刀 （12） 、镊 子 （13） 、骨 勺 12 3-1（14） 、吸耳球 （15） 、称量纸 （16） 、吸水纸 （17） 、保膜鲜 （18） 、标签纸或记号笔等 3-3
27、、实验装置图:4、试剂与配制：4-1、试剂：(1)、葡聚糖凝胶 (2)、磷酸氢二钠(3)、磷酸二氢钠(4)、血红蛋白(5)、核黄素4-2、试剂配制：(1)、洗脱液（0.05 mol / L,pH 4.3 磷酸缓冲）的配制：分别称取磷酸二氢钠 克；磷酸氢二钠 克于一烧杯中，加蒸馏水 毫升，搅拌溶解即可。(2)、样品溶液的配制：分别称取血红蛋白 20.0 毫克;核黄素 20.0 毫克于一烧杯中，加磷酸缓冲液 10.0 毫升，搅拌溶解即可。 5、操作步骤：5-1、凝胶的处理：将凝胶放入过量的蒸馏水中浸泡 6 小时（沸水浴中 2 小时） ，使其充分溶涨，浸泡时3-2 13 动凝胶再静置，等凝胶沉积后，
28、轻轻倾去上层细颗粒悬浮液，如此反复数次，以除去凝胶中的细颗粒。新购凝胶的处理方法祥见教科书。5-2、凝胶静态预平衡：将经过浸泡处理的凝胶抽干，用约 10 倍量的洗脱液处理约 1 小时，方法同浸泡操作，每次均要将上层细颗粒悬浮液弃去。 5-3、装柱： 将层析柱垂直装好在台式铁架上，关闭柱下端出口，加适量（约 1.0 厘米高）洗脱液，再在经预平衡处理的凝胶烧杯中加 1.0 倍量的洗脱液，搅成悬浮液，然后自柱顶部沿管内壁缓缓加入柱中，待柱底部凝胶沉积至 12 厘米高时，缓缓打开柱底端出口，随之继续添加凝胶悬浮液直至柱床体沉积至 15.0 厘米高度为止。柱内如有气泡、节痕和床表面不平整，必须重新装柱，
29、直至无气泡、节痕和床表面平整为止。在装柱的同时应将恒流泵的流速调至 0.5 毫升/分钟，以及电脑、色谱工作站等一切设备的连接与调试完毕，准备随时可以启用。需要注意的是，必须将恒流泵与层析柱的连接管道内的气泡全部排除，否则会影响层析效果。 5-4、平衡：柱装好后，使柱床体稳定 5.010.0 分钟，然后接上恒流泵，打开柱下端的出口，用 2.0倍于床体积的洗脱液动态平衡，同时也使层析柱床体稳定。平衡好的柱子在上样之前，除了用眼观察无误（无气泡和“纹路” ，床表面平整）外，最好还要用兰葡聚糖 2000 进行层析行为的检查。在层析柱内加入 1.0 毫升兰葡聚糖 2000 溶液（2.0 毫克/毫升） ，
30、然后用洗脱液进行洗脱（流速不变） 。在层析中移动的指示剂色带狭窄均一则表明装柱良好。检查后，再重复步骤 5-4 进行重新平衡，方可使用。 5-5、加样：打开平衡好的层析柱底端出口，使柱内液体流至床体表面相平时，关闭层析柱底端出口，吸取样品溶液 0.5 毫升，沿柱内壁缓缓加入，尽量不要破坏柱表面，加样完毕后，先启动已调好的电脑-色谱工作站，然后打开层析柱底端出口，自然流出，当样品溶液流至床表面相平 时，再次关闭层析柱底端出口，但色谱工作站继续工作。5-6、洗涤：吸适量洗脱液（约 1.0 毫升/次）如同加样方法，反复洗涤层析柱床体表面 2-3 次，完毕后，将层析柱内再加入洗脱液至 3.0 厘米高，
31、目的是防止柱床体表面被冲坏。5-7、洗脱：此时接上已调好流速的恒流泵进行自动洗脱。当电脑屏幕出现的第二个洗脱峰回到基线后，继续洗脱 10 分钟，停止洗脱（约 6080 分钟） 。5-8、保存和打印实验结果：停止洗脱后,将实验结果保存到老师规定的文件中，同时打印实验结果报告，并给出结论性的结果。 5-9、清洗仪器及相关装置：（1） 、先从仪器装置中移去层析柱，并回收柱内的填充凝胶，然后用自来水冲洗层析柱，洗净后的层析柱再用蒸馏水荡洗一遍，方可。（2） 、将紫外检测仪比色管道的出口端（上部）与所用其他管道相连接，再把恒流泵管道的进口端放入一干净盛有蒸馏水的烧杯中，同时将另一烧杯放在管道的出口端，收
32、集流出的废液。启动恒流泵，冲洗管道 15 分钟，方可。友情提醒：实验结束后，请及时将所有的仪器设备的电源开关关闭，并清洗所有用具和台面。14 3-3第二单元 柱层析法 实 验 三DEAE 纤维素梯度层析实验 1、实验目的与要求：通过 DEAE-纤维素阴离子交换剂，采用一条线型离子强度和恒定 pH 洗提曲线，对鸡蛋白蛋白（CEA）样品进行分级分离，以了解梯度洗提的层析方法。2、实验原理：DEAE-纤维素是以纤维素为母体接有二乙基氨基乙基（DEAE）活性基团的弱碱性阴离C2H5子交换剂（纤维素-O-CH2-CH2-NH ） 。它在离子交换层析中可用于蛋白质、核酸、激素、C2H5酶等大分子的分离与纯
33、化。对于某些组分比较复杂或性质比较相近的蛋白质样品。在采用一般的恒溶剂系统进行离子交换柱层析时，往往不容易分离，这时可采用梯度洗提（装置见图 1-2） 。即利用一定的样品离子在不同的离子强度（或 pH）溶液中对一定的离子交换剂的平衡常数不同，在洗提过程中，通过不断改变洗提的离子强度（pH 不变） 根据实验的具体情况，也可同时改变离子强度和 pH，以逐步改变样品中各组分与离子交换剂的交换能力，最后得到分离，这种层析方式即称为梯度洗提层析。洗提剂的梯度产生如图所示，当 A1=A2 时，产生线形梯度；当 A1A2 时，产生凹型梯度；当 A1A2 时，产生凸型梯度（见附图 1） 。不同的样品，应根据实
34、验情形，选择合适的梯度洗提曲线。3、实验器材与装置：3-1、实验仪器：（1） 、电脑及装置（2） 、紫外检测仪（3） 、磁力搅拌器（4） 、恒流泵（5） 、天 平（6） 、混合器（7） 、梯度混合仪3-2、实验器材：（1） 、层析柱（2） 、烧 杯 （3） 、量 筒 4-1 15 （4） 、 可调取液器（5） 、 剪 刀（6） 、 镊 子（7） 、 玻 棒（8） 、 骨 勺 （9） 、 称量纸 （10） 、吸水纸 （11） 、保膜鲜（12） 、标签纸或记号笔3-3、实验装置图（见附图）4、试剂与配制：4-1实验试剂：（1） 、三羧甲基氨基甲烷（Tris） （2） 、鸡蛋白蛋白（CEA） （3）
35、 、DEAE-52（4） 、盐 酸（5） 、氯化钠4-2试剂配制：（1） 、Buffer A（20mM pH8.0 Tris-HCl ）的配制：称取 Tris 60.7mg ，于一烧杯中，先加少量蒸馏水溶解，然后用稀 HCl 调至 pH8.0，最后加蒸馏水稀释至 100 毫升，混匀即可。（2） 、Buffer B 的配制：取 Buffer A 50 毫升，加氯化钠（1.0M）2.9 克，溶解混匀即可。（3）：CEA 样液的配制：20.0mg CEA+1ml Buffer A5、方法与步骤：（1） 、DEAE-纤维素处理：本实验采用 20 mMol/L ,pH8.0 Tris-HCl 平衡好的
36、DEAE-纤维素。*新 DEAE-纤维素的处理详见教课书（2） 、装柱：将处理好的 DEAE-纤维素置于烧杯中，并加有约 1 倍体积的 Buffer A，用玻棒搅匀，随即缓缓倒入垂直架好并底端出口关闭的层析中，静置约 5 分钟，打开层析柱底端出口，吸取过多的柱内上清液，继续添加纤维素悬液，直至沉积高度为 10.0cm。在装柱过程中要防止柱床流干。柱装好后，应无节痕，气泡，斑纹，界面平整。（3） 、平衡：柱装好后，接上调好流速的恒流泵。用 Buffer A 以 0.8ml/min 流速，平衡 30 分钟既可。（5） 、加样：加样前先启动已调试完毕的色谱工作站，如：电脑、紫外检测仪和恒流泵等装置，
37、使整个装置处于工作状态，然后使柱内液面降至床表面，吸取 1.0ml 样液沿柱管内壁缓缓加入，加毕，打开层析柱底端出口，等液面降至床表面时，再吸取少量 Buffer A，洗涤柱内壁 2-3次，每次洗涤均需将液面降至床表面，并防止冲坏床表面，最后将溶液加至 3cm 高。（6） 、洗涤：层析柱接上恒流泵，用 Buffer A 以 0.8ml/min 流速，洗涤 15 分钟方可。16 4-2 （7） 、洗脱：先将梯度混合仪混合阀门和输出阀门关闭（向左）,然后倒入 buffer B 溶液 60ml 于梯度混合仪左杯中，打开混合阀门（向右） ，让溶液经过通道渗入右杯，立即关闭混合阀门,再将搅拌磁棒放入混合
38、仪右杯中，同时，然倒入 buffer A 溶液 60ml。再将恒流泵进口端与梯度混合仪中盛有 Buffer A 的梯度杯底部出口端相连接，然后打开层析柱底部出口和梯度混合仪电磁搅拌器开关， 以调好的 0.8ml/min 流速和方向进行梯度洗提层析。在洗提中，随着 Buffer A 的烧杯中洗提液的减少，液面将下降，此时 Buffer B 的烧杯中溶液将由连通管虹吸到 Buffer A 的烧杯中来，以不断地补充和趋向平衡并且迅速搅匀，这样就产生了一种浓度以梯度形式不断增加的洗提曲线进行梯度洗提层析。待样液最后一个峰已回到基线时，继续洗脱 10 分钟。（8） 、层析柱再生：以同样的流速，层析柱改用
39、 1.0 mol/L 氯化钠溶液洗脱 20 分钟。 （9） 、保存和打印结果：层析完毕，将结果保 存到老师要求的文件夹中， 并给出结论性的结果。6、实验 装置附图：附 图 1、 梯度洗脱示意图：4-3 17 附图 2 、实验装置图友情提醒：实验结束后，移去层析柱，回收柱内的 DEAE，清洗层析柱，同时用恒流泵输送蒸馏水清洗所有与紫外检测仪相连的管道 10 分钟。并将所有器皿也清洗干净（详细清理方法同凝胶实验中 5-9 所叙） 。谢谢同学的合作！18 4-4 第二单元 柱 层 析 法 实 验 四 疏 水 层 析 （HIC） 1、实验目的与要求:通过苯基琼脂糖疏水层析柱，采用阶段洗脱的方式分离血红
40、蛋白，以此了解疏水层析的原理、方法和实际的应用。2、实验原理:疏水层析(Hydrophobic Interaction Chromatography HIC) 是利用被分离样品中不同生物分子表面的疏水性差别，而将其分离纯化的一种层析技术。疏水层析的介质通常是一类在惰性支持物上接有疏水基团的层析载体，如苯基琼脂糖（Phenyl Sepharose）, 辛基(Octyl), 丁基(butyl) 琼脂糖等。对于不同的蛋白质和多肽而言，其分子表面一般有着不同的疏水和亲水结构区域，当将这些生物样品加入到含有高盐（高离子）浓度缓冲液的 HIC 柱中时，由于溶液中高浓度盐离子与水分子的作用，降低了样品分子的
41、溶剂化作用，从而增加暴露了样品分子表面的疏水区，这样就促使样品分子表面疏水基团与 HIC 柱上的疏水基团相互作用结果使样品被吸附到 HIC 柱上。因此疏水层析亦称疏水相互作用层析。样品吸附在 HIC 柱上的强弱程度，取决于样品本身的疏水性质和样品环境中盐离子的强度。一般来说疏水性强的只需要较低的盐浓度，疏水性弱的则需要较高的盐浓度如 1.0 mol/L (NH4)2SO4。吸附在 HIC 柱上的生物分子，可以采用降低洗脱液中盐浓度的方法，使其从柱上洗脱下来，洗脱方法可以是梯度也可以是阶段洗脱的方式。样品中不同分子被洗脱的顺序依据其疏水性强与弱从先到后，从而达到分离的目的。3、实验仪器与器材:3-1、实验仪器：（1） 、层析工作站装置（2） 、笔记本电脑（3） 紫外检测仪 （4） 、磁力搅拌器（5） 、恒流泵（6） 、天 平（7） 、混合器 3-2、实验器材：（
