1、第二章1.六大类酶基本概念和特点（1）氧化还原酶：催化氧化还原反应，需要电子供体或受体（2）转移酶：催化基团转移反应，即将一个底物分子的基团或原子转移到另一个底物的分子上（3）水解酶：催化底物的加水分解反应（4）裂合酶：脱去底物上某一基团留下双键，或可相反地在双键外加入某一基团。（5）异构酶：催化生成异构体反应的酶，分别进行外消旋，差向异构，顺反异构，醛酮异构，分子内转移，分子内裂解等（6）连接酶：需要三磷酸腺苷等高能磷酸酯作为结合能源，有的还需要金属离子辅助因子。应用最多的是氧化还原酶，利用率最高的是水解酶2.必需基团及其作用特点必需基团包括：（1）活性部位，包括结合基团和催化基团（2）维持
2、酶空间结构的基团必需基团是酶分子氨基酸残基侧链的化学基团中，一些与酶活性密切相关的基团。必需基团在空间结构上相互靠近，组成具有特定空间结构的区域，能与底物特异性结合并将其转化为产物3.两种酶与底物的结合模型（1）锁钥模型：底物结合部位由酶分子表面的凹槽或空穴组成，这是酶的活性中心，它的形状与底物分子形状互补。底物分子或其一部分像钥匙一样，可专一地插入酶活性中心，通过多个结合位点的结合，形成酶底物复合物，同时酶活性中心的催化基团正好对准底物的有关敏感键，进行催化反应。三点结合学说指出，底物分子与酶活性中心的基团必须三点都互补匹配，酶才作用于这个底物。（2）诱导锲合模型：酶分子与底物分子接近时，酶
3、蛋白质受底物分子诱导，构象发生有利于与底物结合的变化，酶与底物在此基础上互补楔合，进行反应。4.影响酶催化作用的五种模型（1）广义的酸碱催化能供给质子的物质即为酸，能接受质子的物质即为碱。广义的酸碱催化就是指组成酶活性中心的极性基团，在底物的变化中起质子的供体或受体的作用，这就是广义的酸碱催化。发生在细胞内的许多类型的有机反应都是广义的酸碱催化。组氨酸的咪唑基值得特别注意，因为它既是一个很强的亲核基团，又是一个有效的广义酸碱功能基团。影响酸碱催化速率的因素：一是酸碱的强度，在这些功能基团中，组氨酸的咪唑基的解离情况 pK 值为 6.0，在生理 pH 条件下，既可以作质子的供体又可作质子的受体。
4、因此，咪唑基是催化中最有效最活泼的一个催化功能基团；二是这些功能基团供出质子或接受质子的速度，其中的咪唑基的情况特别突出，它供出或接受质子的速度十分迅速，其半衰期小于 10-10 秒。而且，供出或接受质子的速度几乎相等。由于咪唑基有如此的优点，所以虽然组氨酸在大多数蛋白质中含量很少，却很重要，在许多酶的活性中心处都含有组氨酸（2）共价催化酶活性中心处的极性基团，在催化底物发生反应的过程中，首先以共价键与底物结合，生成一个活性很高的共价型的中间产物，此中间产物很容易向着最终产物的方向变化，故反应所需的活化能大大降低，反应速度明显加快。常见形式是酶的催化基团中亲核原子对底物的亲电原子攻击。（3）邻
5、近效应和定向效应邻近效应：在酶促反应中，由酶和底物分子之间的亲和性，底物分子有向酶的活性中心靠近的趋势，最终结合到酶的活性中心，使底物在酶活性中心的有效浓度增加。定向效应：当专一性底物向酶活性中心靠近时会诱导酶分子的构象发生改变，使酶活性中心的相关基团和底物的反应基团正确定向排列，同时使反应基团之间的分子轨道以正确方向严格定位，使酶促反应易于进行。（4）变形或张力变化的酶分子使底物分子的敏感键产生张力，甚至变形，从而促进底物-酶络合物进入过渡态，降低了反应活化能，加速酶促反应，实际上即为诱导锲合的动态过程。（5）酶的活性中心为疏水区域酶的活性中心凹穴内相对地说是非极性的，而在疏水的非极性区介电
6、常数低，因此，酶的催化基团被低介电环境所包围，在某些情况下排除高极性的水分子。这样，底物分子敏感键和酶的催化基团之间就会有很大的反应力，有助于加速酶的反应。水的极性过高，形成离子层，干扰离子键和氢键形成。5.专一性的分类绝对专一：只催化一种底物进行快速专一反应，甚至是立体专一性相对专一：基团专一和键专一，即可以催化一类化合物或一种化学键6.酶作为催化剂的调节性（1）酶浓度的调节两种方式：一为诱导抑制酶的合成，二为调节酶的降解（2）激素调节由催化亚基和调节亚基组成，调节亚基无催化功能，由激素控制，在于改变催化亚基的专一性（3）共价修饰调节在一种酶分子上共价引入一个基团从而改变它的活性，引入的基团
7、又可以被第三种酶催化特征：至少需要三种酶，共价键的变化，级联放大作用，反应需要能量（4）限制性蛋白水解作用与酶活力调控高特异性的共价修饰调节系统，细胞内合成的新生肽大多以无活性前体形式存在，一旦需要才通过限制水解作用使前体转变（5）抑制剂的调节（6）反馈调节催化第一步的酶被终端产物抑制（7）金属离子和其他小分子化合物的调节7.能降低酶催化反应速度的因素及其机理（1）失活作用物理或化学因素部分或全部破坏酶的三维结构，引起酶的变性，导致部分或全部丧失活性（2）抑制作用在酶不变性的情况下，由于必需基团或活性中心化学性质的改变而引起的酶活性丧失或降低（3）去激活作用某些酶只有在金属离子存在下才有活性，
8、去除金属离子会引起这些酶活性的降低或丧失。当金属离子去除后，底物与酶的结合减少，实际上是降低了底物的有效浓度。（4）阻遏作用某些因素使细胞内酶蛋白的合成减少，反应速度的降低是由于酶分子数量的减少，每分子酶的催化效力并没有变化，而抑制作用指的是一定量酶分子催化效力的减少，不涉及酶分子合成的问题。8.抑制作用的分类（1）不可逆抑制：抑制剂与酶的必需基团以共价键结合，酶活性丧失，不能用透析，超滤或凝胶过滤等物理方法去除抑制剂而使酶复活（2）可逆抑制：抑制剂与酶的必需基团以非共价键结合，酶活性丧失或降低，能用物理方法除去使酶复活两种方式与酶结合：同位抑制：与酶活性中心结合，阻止底物形成产物。别构抑制：
9、与酶活性中心以外的部位结合，酶分子空间构象改变9.竞争性抑制剂定义：与被抑制的酶的底物通常有结构上的相似性，能与底物竞争酶分子上的结合位点，从而产生酶活性的可逆的抑制作用。与酶的活性中心相结合，与酶的结合是可逆的。机理：（1）抑制剂与底物在结构上有类似之处（2）可能结合在底物所结合的位点上从而阻断底物与酶的结合（3）降低酶和底物的亲和力，即 Ks 增大过渡态类似物：底物与酶结合成中间复合体后被活化的过渡形式，由于其能障小，与酶结合紧密 。如苯 甲 酰 苯 丙 氨 醛是 胰 凝 乳 蛋 白 酶 的 过 渡 态 抑 制 剂 。10.不可逆抑制作用（1）非专一性：抑制剂可以和酶上的一类或几类基团反应
10、（2）专一性：a. Ks 型结合型不可逆抑制剂抑制剂与酶中的必需功能团起反应，每种抑制剂对酶的特定基团，包括活性部位的必需基团作用是专一的，也可以修饰酶分子其他部位的同类基团。b. Kcat 型催化型不可逆抑制剂（自杀底物）抑制剂是根据酶的催化过程来设计或天然存在的，它们与底物类似，既能与酶结合，也能被酶催化发生反应，在其分子中存在潜伏基团，该基团会被酶催化而激活，并立即与酶活性中心某基团不可逆结合，酶受抑制。例子：11.酶抑制剂的应用医学：青霉素工业生产：多酚氧化酶第三章1.固定化酶是用物理的或化学的方法使酶与水不溶性大分子载体结合或把酶包埋在水不溶性凝胶或半透膜的微囊体中制成的。酶固定化后
11、一般稳定性增加，易从反应系统中分离，易于控制，能反复多次使用。便于运输和贮存，有利于自动化生产。固定化酶应用于工业的开端：千烟一郎，氨基酰化酶固定化细胞用于工业的开端：千烟一郎，大肠杆菌细胞2.影响固定化酶性质的因素（1）酶本身的变化主要由于活性中心的氨基酸残基，高级结构和电荷状态发生了变化，即与底物结合位点改变（2）载体的影响a.底物在载体和溶液中存在分配效应固定化酶处于主体溶液中，形成非均相反应系统，在固定化酶附近的环境为微环境，主体溶液为大环境。由于载体和底物的疏水性，亲水性以及静电作用，使微环境与大环境有不同的性质，从而形成底物和各种效应物的不均匀分布，即为分配效应。b.空间障碍效应：
12、活性基团与底物接触受到影响，影响定向作用c.扩散限制效应底物必须从主体溶液传递到固定化酶内部的催化部位，反应后产物又沿着相反路线从酶的催化部位传递到主体溶液，在传递过程中存在扩散速率限制问题。限速步骤可能是外扩散（底物从反应液向载体表面，产物移到反应液） ，内扩散（底物从载体表面移向酶活性中心，产物移向载体表面）或酶反应，会使其动力学行为偏离液态下的动力学行为。（3）固定化方法的影响3.固定化后性质的变化（1）酶活性酶活性下降，反应速度下降（2）稳定性a.操作稳定性提高,连续催化反应工作时间加长b.贮存稳定性比游离酶大多数提高。c.对热稳定性，大多数升高，有些反而降低。d.对分解酶的稳定性提高
13、，空间障碍效应e.对变性剂的耐受力升高稳定性提高的原因：a. 固定化后酶分子与载体多点连接。b. 酶活力的释放是缓慢的。c. 抑制自降解，提高了酶稳定性。（3）pH 的变化载体带负电荷，pH 向碱性方向移动，载体带正电荷， pH 向酸性方向移动。催化反应的产物为酸性时，固定化酶的 pH 值比游离酶的 pH 值高；反之则低（4）最适温度变化（5）底物特异性变化作用于低分子底物的酶特异性没有明显变化，既可作用于低分子底物又可作用于大分子低物的酶特异性往往会变化。（6）米氏常数变化4.固定化酶评价指标5.固定化方法6.固定化细胞的特点以及方法优点：（1）可以增殖，细胞密度大，可获得高密度而体积小的生
14、产菌聚集体（2）发酵稳定性好，可以长时间反复使用或连续使用（3）发酵液中菌体含量少，利于产品的分离纯化（4）有利于需要辅酶和多酶系统才能进行的反应方法：吸附法包埋法细胞包埋法应注意问题：7.原生质体固定化（1）包埋法固定化原生质体将原生质体悬浮在含有渗透压稳定剂的缓冲液中配成原生质体悬浮液（2）原生质体制备要点是如何保护细胞内部的结构完整性，防止制备得到的原生质体破裂a.酶解前预处理：主要是为了使酶渗透到细胞器中去。采取的策略：先加入物质抑制或阻止某种细胞壁的成分合成，可以使酶插入。一般加入：巯基乙醇（酵母） ，Triton-100（霉菌）,甘氨酸（放线菌） 、青霉素（细菌）b.稳定剂的要求1
15、 加入的化合物对细胞和原生质体无毒性2 不会影响水解酶的活性3 对代谢产物无不良影响（3）原生质体细胞活性的检测荧光染色：红色：完全原生质体绿色：仍然含有细胞壁成分8.为什么要做辅酶固定化（1）有机辅因子中具有某些特殊的化学基团，参与酶的催化反应(递氢、递电子或递某些化学基团的作用） ；（2）有机辅因子在使用过程中要流失，并且不能自行再生；（3）有机辅因子价格昂贵工业上应用全酶的关键是有机辅因子的保留和再生9.反应器大概框架10.生物反应器与化学反应器的区别（1）化学反应器从原料进入到产物生成，常常需要加压和加热，是一个高能耗过程。而生物么应器则不同，在酶和微生物的参与下，在常温和常压下就可以
16、进行化学合成。11.关注三点应用（1）工农业生产葡萄糖异构酶世界上生产规模最大的一种固定化酶。用吸附法、结合法、凝胶包埋法等进行固定化。聚丙烯酰胺凝胶包埋含有延胡索酸酶的产氨短杆菌菌体，制得固定化延胡索酸酶。工业化生产 L-苹果酸利用固定化乳糖酶可以连续生产低乳糖奶，固定化酵母细胞等微生物可用于生产各种酒类（2）分析化学中的应用酶柱和酶管，可与分光光度计、荧光计或电量计结合，形成酶电极，进行某些物质的自动分析。酶电极：生物传感器的一种。在基础电极的敏感面上装有固定化酶膜，当电极插入待测溶液时，酶膜中的酶发生催化反应产生电极活性物质，引起基础电极电位变化，由此测出该酶所催化的反应中反应物或反应产
17、物的浓度。（3）基础理论研究阐明酶反应机理揭示酶原激活机理第四章1.有机相酶反应的优点（1）有利于疏水性底物的反应，能催化在水中不能进行 的反应（2）可提高酶的热稳定性.（3）可改变反应平衡移动方向（4）可控制底物专一性（5）酶和产物易于回收。（6）可避免微生物污染。2.一些概念仿水溶剂体系：可用二甲基甲酰胺（DMF） ，乙二醇，丙三醇等极性添加剂部分或全部替代系统中的辅助溶剂水，从而影响酶的活性和立体选择性。称为仿水溶剂体系。分子印迹：酶在含有其配体的缓冲液中，肽链与配体之间的氢键等相互作用使酶的构象改变，这种新构象除去配体后在无水有机溶剂中仍可保持，并且酶通过氢键能特异地结合该配体，这种方
18、法叫生物印迹。 利用酶与配体的相互作用，诱导、改变酶的构象，制备具有结合该配体及其类似物能力的新酶称为生物印迹酶为什么在有机相中会产生印迹现象？ 3.有机相中关于水的一些解释（1）水在酶催化反应中的作用水直接或间接参与了酶天然构象中所有的非共价相互作用，水充当了酶结构的“润滑剂”，使酶分子的柔性增强有机相中刚性增强的原因：（2）必需水：紧紧吸附在酶分子表面，维持酶催化活性所必需的最少量水称为必需水（3）水活度指特定的温度和压力条件下，反应体系中水的摩尔分数 Xw 与水活度系数 w 的乘积： w =w* Xw水活度系数 w 是溶剂疏水性的函数，溶剂疏水性越大， w 越大。 w 是一个强质性质的物
19、理量，在平衡状态时，反应体系中各组分（酶、溶剂、底物和产物）的 w 是相同的。（4）酶活与水的关系酶活最大时蛋白质结构的动力学刚性和热力学稳定性（柔性）之间达到最佳平衡点。4.酶形式的选择（1）酶粉酶蛋白分子骨架的构象与水中无明显变化（2）化学修饰酶（3）固定化酶把酶吸附在不溶性载体上（如硅胶、硅藻土、玻璃珠等）制成固定化酶，其对抗有机介质变性的能力、反应速度、热稳定性等都可提高。5.反胶束，表面活性剂及如何变化（1）反胶束：表面活性剂分散于连续有机相中自发形成的纳米尺度的一种聚集体。反胶束溶液是透明的热力学稳定的系统。大量与水不溶的有机溶剂中，含有少量的水溶液，加入表面活性剂后形成的油包水的
20、微小液滴制备：将表面活性剂溶于非极性的有机溶剂中，并使其浓度超过临界胶束浓度（CMC） ，便会在有机溶剂内形成聚集体，这种聚集体则为反胶束。（2）表面活性剂：表面活性剂是由亲水憎油的极性基团和亲油憎水的非极性基团两部分组成的两性分子。在有机相酶反应中用得最多的是阴离子表面活性剂（3）临胶束浓度：是胶束形成时所需表面活性剂的最低浓度，用 CMC 来表示。 CMC 的数值可通过测定各种物理性质的突变（如表面张力、渗透压等）来确定。 （4）反胶束的影响因素反胶束的尺寸和形状随表面活性剂-溶剂系统的变化而变化，同时也受温度、压力、离子强度的影响。反胶束的大小取决于反胶束的含水量 Wo。Wo 的定义为反
21、胶束中水分子数与表面活性剂分子数之比，也即有机溶剂中水的摩尔浓度与表面活性剂的摩尔浓度之比。6.有机溶剂如何影响酶的催化（1）有机溶剂能通过直接与酶相互作用引起抑制或失活A 增大酶反应的活化能来降低酶反应速度B 降低中心内部极性并加强底物与酶之间形成的氢键，使酶活 性下降。C 酶三级结构变化，间接改变酶活性中心结构影响失活。 （2）有机溶剂与扩散的底物或产物相互作用而影响酶活酶宏观上在有机相中反应，微观上在水相中反应（3）有机溶剂直接与酶附近的必需水相互作用产物要进去，底物要出来7.有机介质对酶稳定性与活性的影响（1）稳定性热稳定性提高储存稳定性提高在低水有机溶剂体系中，酶的稳定性与含水量密切
22、相关；一般在低于临界含水量范围内，酶很稳定；含水量超出临界含水量后酶稳定性随含水量的增加而急剧下降。（2）活性a.结构变化：脱水阶段折叠大大减少，加入保护剂防止脱水b.与底物接触程度降低。聚集成团形成悬浮液，做成颗粒状，逆交束体系c.底物的去溶剂化，底物从溶剂中到水处反应d.可塑性变弱，因为缺水（一）单相共溶剂体系中，有机溶剂对酶活性影响a.有机溶剂直接作用于酶，破坏维持酶活性构象的氢键和疏水作用力，或破坏酶周围水化层，使酶失活或变性。b.有些酶的活性会随着某些有机溶剂浓度升高而增大，在某一浓度（最适浓度）达到最大值；若浓度再升高，则活性下降。（二）低水有机溶剂体系中，大部分酶活性得以保存，但
23、也有某些酶活性亦变化（三）在反向微团体系中，微团效应使某些酶活性增加酶活力依赖微团的水化程度，即取决于水与表面活性剂的摩尔比（R）超活性：凡是高于水溶液中所得酶活性值的活性称为超活性（Super-activity） 。认为：超活性是由围绕在酶分子外面的表面活性剂这一外壳之较大刚性所引起。8.利用什么酶，做了什么，得到什么第五章1.为什么要做化学修饰（1）稳定性不够，不能适应大量生产的需要热稳定，pH 稳定（2）作用的最适条件与工业生产不一定相符（3）酶的主要动力学性质的不适应解决抑制剂的问题（4）临床应用的特殊要求，用的最多，解决异源蛋白产生抗原性的问题2.怎么做化学修饰（1）修饰剂的要求a.
24、修饰剂的分子量、修饰剂链的长度对蛋白质的吸附性。b.修饰剂上反应基团的数目及位置。c.修饰剂上反应基团的活化方法与条件（2）酶性质的了解a.酶活性部位情况b.酶的稳定条件、酶反应最适条件c.酶分子侧链基团的化学性质及反应活泼性等（3）反应条件的选择a.反应体系中酶与修饰剂的分子比例。b.反应体系的溶剂性质，盐浓度和 pH 条件。c.反应温度及时间。（4）酶修饰方法a.酶分子侧链基团的化学修饰 b.有机大分子对酶的化学修饰c.蛋白质类及其他3.化学修饰后得到了什么（1）热稳定性a.修饰剂与酶多点交联，固定了酶的分子构象，增强了酶的结构刚性。b.减少了酶分子内部基团的热振动（2）抗原性部分可消除，
25、PEG、人血清白蛋白在消除酶抗原性上效果明显。原因：a.组成抗原决定簇的基团与修饰剂形成了共价键，破坏了抗原决定簇的结构b.大分子修饰剂遮盖抗原决定决定簇和阻碍抗原、抗体产生结合反应（3）体内半衰期延长，由于酶分子经修饰后，增强对热、蛋白酶、抑制剂等的稳定性，从而延长了在体内的半衰期（4）最适 pH大部分经过修饰后发生变化，修饰的最适 pH 更接近于生理环境，在临床应用上有较大意义。（5）酶学性质的改变（6）对组织的分布能力变化对组织的分布能力有所改变，能在血液中被靶器官选择性地吸收。4.酶修饰在空间结构的应用（1）研究酶分子的解离-缔合现象。（2）推算出酶分子大小、形态及构象变化。（3）测定氨基酸残基在酶分子中存在的状态。（4）利用双功能试剂交联修饰可以测定酶分子中特定基团的距离5.化学局限性有那些（1）化学修饰专一性相对（2）酶的构象有些变化（3）只能在具有极性的氨基酸残基侧链上进行（4）研究酶结构与功能缺乏准确性和系统性
