1、麻醉学基础研究异氟烷对大鼠肺泡上皮液体清除及肺血管通透性的影响作者单位：北京大学人民医院麻醉科 100044安海燕 李志红 杨拔贤摘要 目的 探讨自主吸入不同浓度异氟烷（Iso）对正常大鼠肺泡上皮液体清除及肺泡毛细血管通透性的影响。方法 78 只Wistar 大鼠随机取出 6 只设为空白组（E 组） ，吸入空气。剩余大鼠随机分为四组，每组 18 只：0.7% Iso 组（A 组） 、1.5% Iso 组（B 组）、2.0% Iso 组（C 组） 、氧气对照组（D 组，吸入 40% O2） ，每组又分为吸入 4h 亚组（A1、B1、C1、D1 组） 、8h 亚组（A2、B2 、 C2、D2 组）
2、和吸入 8h 停药 2h 亚组（A3、B3 、 C3、D3 组） ，每亚组 6 只大鼠。达到实验时间点时，处死大鼠取肺组织测定湿/干重比以及提取肺组织中伊万斯兰来测定肺泡毛细血管膜通透性。结果 各组间肺组织湿 /干重比和伊万斯兰量/肺组织重量之比的差异无统计学意义。结论 吸入临床常用浓度、常用时间的异氟烷并不会对正常肺脏的肺泡上皮液体清除及肺泡毛细血管通透性产生影响。关键词 异氟烷；肺血管通透性；肺水异氟烷是临床麻醉中应用广泛的吸入麻醉药之一，有研究认为吸入 1.5%异氟烷可以增加肺泡毛细血管膜通透性，其机制可能与异氟烷抑制肺泡表面活性物质的合成和（或）直接损伤肺泡上皮有关 1。但目前研究多集
3、中于异氟烷对肺损伤动物模型，以及对离体肺泡型细胞的的影响，本研究拟判断异氟烷对正常肺泡上皮细胞的损伤程度以及初步探讨其机制。材料与方法实验材料 健康成年雄性 Wistar 大鼠 78 只（军事科学院动物中心提供），体重 190210g。异氟烷（活宁，英国雅培）。180烤箱（天津市实验仪器厂），AEU-20 电子天平（德国 Siemens 公司），紫外/可见分光光度计（日本 SHIMADZU 公司）。伊万斯兰（Evans Blue, EB, Sigma USA），甲酰胺（分析纯，北京化学试剂公司）。动物分组 78 只成年雄性 Wistar 大鼠中随机取出 6 只设为空白组（E 组），仅吸入空气。
4、剩余大鼠随机分为四组，每组 18 只：0.7% Iso 组（A 组），吸入 0.7% Iso+40% O2；1.5% Iso 组（B 组），吸入1.5% Iso+40% O2；2.0% Iso 组（C 组），吸入 2.0% Iso+40% O2；氧气对照组（D 组），仅吸入 40% O2；每组又分为吸入 4h 亚组（A 1、B 1、 C1、D 1 组）、8h 亚组（A 2、B 2、C 2、D 2 组）和吸入 8h停药 2h 亚组（A 3、B 3、C 3、D 3 组），每亚组 6 只。实验前经大鼠尾静脉注射伊万斯兰（EB）50mg/kg，将注射后的大鼠放进自制的密闭实验箱内，实验箱的进气端接麻醉
5、机，出气端接多功能气体监测仪。高纯氮气（2.0L/min ）与氧气（1.5L/min）混合使氧浓度维持在 40%，大鼠保持自主呼吸，容器内温度维持在（231），湿度为（5010）%。当多功能气体监测仪监测容器内 Iso 浓度、氧浓度达到实验要求时开始计时。标本采集 按照预定实验时间点，大鼠麻醉后，放血处死，迅速打开胸腔，取出肺脏剔除肺门结缔组织后在滤纸上沾干肺表面的血液，一部分用于肺水测定；一部分用于测定肺泡毛细血管膜通透性。肺水测定 电子天平称重干燥器皿，标号 W1，将取出的右肺上叶放入干燥器皿，电子天平称重，标号 W2，将装有肺脏的干燥器皿放入烤箱内于 80烤 48h 致恒重，电子天平称重
6、，标号 W3。肺组织湿/干重比（W/D）=（W1-W2）/（W3-W1），肺水含量计算公式为：肺水含量= （湿重 -干重）/ 湿重100% 。肺泡毛细血管膜通透性 分别取 0.1%伊万斯兰标准品0、5l、15l、20l、30l、40l，加入 4ml 甲酰胺中，在 620nm 条件下用分光光度计测定 OD 值，每个样品测定三次，取平均值，以标准伊万斯兰浓度的 OD 值进行回归分析，得到伊万斯兰标准方程：y = 12.073x + 0.1856，R = 0.9974，y：伊万斯兰浓度；x：OD 值。取注射伊万斯蓝鼠的右肺中叶用电子天平称取重量，将称好的肺叶浸泡于甲酰胺溶液中(甲酰胺用量为每 100
7、mg 湿肺 2ml)，恒温水浴箱内 37孵育 24h，待组织中的色素全部浸出后取出肺组织，用分光光度计在波长 620nm 比色，根据标准曲线计算伊万斯蓝的含量，伊万斯兰含量= 伊万斯兰浓度甲酰胺的剂量，肺泡毛细血管膜通透性大小以每 mg 肺组织含有多少 ng 伊万斯蓝的量表示，即伊万斯兰的量/肺组织重量。统计分析 计量数据以均数标准差（ s）表示，应用 SPSS10.0 统计软件包，同一时间不同吸入浓度组之间、同一浓度不同时间亚组之间比较采用单因素方差分析，两两比较采用 LSD 法。结 果各组间肺组织湿/干重比、肺水含量和伊万斯兰含量的差异无统计学意义。讨 论急性肺损伤存在不同程度的肺泡上皮细
8、胞和肺血管内皮细胞损伤，导致肺泡上皮液体清除及肺泡毛细血管屏障功能障碍，表现为肺泡通透性增加，气体交换、弥散及代谢功能障碍。可见肺泡上皮在维持相对干燥的肺泡腔以进行正常的气体交换过程中发挥着关键作用。吸入麻醉药经肺摄取和排除，可影响上皮细胞和内皮细胞功能 1、2 。许多氟化麻醉药是高度亲脂的，一直被认为可影响生物膜对水和电解质的转运。有研究认为吸入氟化麻醉药可以加重肺水肿 3，吸入 1.5%异氟烷可以增加肺泡毛细血管膜通透性，其机制可能与异氟烷抑制肺泡表面活性物质的合成和（或）直接损伤肺泡上皮有关 1。目前研究多集中于异氟烷对肺损伤动物模型，以及对离体肺泡型细胞的的影响，至于异氟烷对正常肺脏的
9、影响目前研究较少。本研究设计了专门的动物模型，采用正常大鼠通过自主呼吸吸入异氟烷，排除机械通气对肺脏的影响。长时间吸入高浓度氧气也会引起肺损伤 4，因此本研究选用吸入 40%氧气，并且设立了 D 组，排除吸入氧气对肺泡上皮细胞和肺血管内皮细胞的影响。结果显示，吸入 40%氧气组与 E 组比较，肺组织湿/干重比、肺水含量和肺组织伊万斯兰含量差异无统计学意义。因此，在本研究中同一时间不同浓度组相比时，我们选用 40%氧气组作对照，以排除异氟烷组中氧气对肺泡上皮细胞和肺血管内皮细胞的影响。通过本研究我们认为吸入较长时间（10h）的 40%氧气不会对肺泡上皮液体清除及肺泡毛细血管屏障功能产生影响。肺泡
10、型细胞除了分泌表面活性物质以外，还参与钠的主动转运。钠离子通过位于顶质膜的氨氯吡咪敏感性钠通道进入细胞内，再由位于基侧膜的 Na+K+ATP 酶将其泵入肺间质，同时伴随着水的被动转运，一旦水被转运至肺间质，就形成了向肺门的压力梯度，通过淋巴管将水清除出肺。这一过程维持肺泡腔处于相对“干燥”状态，利于气体交换。因此 Na+K+ATP 酶的活性对于调节肺泡内的液体平衡，防止肺水肿的发生具有重要作用。有研究显示氟烷和异氟烷能够可逆性降低肺泡型上皮细胞 Na+K+ATP 酶和 Na+通道活性 5、6 ，从而使肺泡液体清除率降低。异氟烷对其它离子通道，包括 Ca2+通道亦有作用 7，异氟烷通过改变细胞内
11、 Ca2+代谢和 G 蛋白的功能来影响钠转运。本研究中同一浓度不同时间亚组之间及与 E 组比较，肺组织湿/干重比、肺水含量差异无统计学意义；同一时间不同浓度各组之间及与 D 组比较，肺组织湿/干重比、肺水含量差异也无统计学意义。本研究结果提示吸入不同浓度异氟烷以及吸入不同时间异氟烷均不会对正常肺脏肺泡上皮液体清除功能产生影响。考虑可能因为异氟烷是吸入氟化麻醉药中引起代谢反应最小的药物，其氟化物代谢水平较低。而且异氟烷不会促使产生自由基，因此也不会引起机体的还原反应。本研究中最长吸入异氟烷 8h，而长时间吸入异氟烷会导致氟化物代谢产物蓄积，因此吸入更长时间异氟烷有可能导致肺泡上皮液体清除的改变。
12、肺泡毛细血管屏障是肺泡与肺泡毛细血管中血液之间进行气体交换的屏障。正常的肺功能依赖于肺泡腔和肺毛细血管腔建立和维持各自相对独立的稳态，而这一过程首先取决于肺泡毛细血管屏障功能的完善。有报道，通过锝 99 核素研究发现手术病人在吸入 1%氟烷和 1.5%异氟烷后可以引起暂时性的肺泡毛细血管屏障功能降低。伊万斯兰可以与蛋白特异结合，因此本研究选用肺组织中伊万斯兰含量来代表肺组织中蛋白含量。结果显示，同一浓度不同时间亚组之间及与 E 组比较，肺组织伊万斯兰含量差异无统计学意义；同一时间不同浓度各组之间及与 D 组比较，肺组织伊万斯兰含量差异也无统计学意义。本研究结果提示吸入不同浓度异氟烷以及吸入不同
13、时间异氟烷均不会对正常肺脏肺泡毛细血管屏障功能产生影响。但目前异氟烷对肺泡毛细血管屏障的作用机制还不清楚 8、9 。综上所述，吸入临床常用浓度、常用时间的异氟烷并不会对正常肺脏的肺泡上皮液体清除及肺泡毛细血管屏障功能障碍产生影响，对于肺部正常的病人，选用吸入异氟烷麻醉应该是安全的。但有报道异氟烷对内毒素 10、缺血再灌注 11、酸误吸入 12等损伤肺的肺泡毛细血管屏障有影响。因此，对于有肺部损伤的病人，选用吸入异氟烷麻醉时应慎重。参考文献1. Chang lai SP, Hung WT, Liao KK. Detecting alveolar epithelial injury followi
14、ng volatile anesthetics by Tc99m DTPA radioaerosol inhalation lung scan. Respiration.1999,66:506-510.2. Gunaydin B, Karadenizli Y, Babacan A, et al. Pulmonary microvascular injury following general anaesthesia with volatile anaesthetics-halothane and isoflurane: a comparative clinical and experiment
15、 study.Resp Med.1997,91:351-360.3. Shayevitz JR, Johnson KJ, Knight PR. Halothane-oxidant interactions in the ex vivo perfused rabbit lung: Fluid conductance and eicosanoid production. Anesthesiology. 1993, 79:129-138.4. Buckley S,Barsky L,Driscoll B,et al.Apoptosis and damage in type alveolar epith
16、elial cells cultured from hyperoxic rats.Am J Physiol. 1998,274(5 Pt 1):L714-720.5. Molliex S, Dureuil B,Aubier M, et al.Halothane decrease Na-K-ATPase, and Na channel activity in alveolar type cells. Anesthesiology.1998,88:1606-1614.6. Rezaiguia-Delclaux S, Jayr C, Luo DF, et al. Halothane and isof
17、lurane decrease alveolar epithelial fluid clearance in rats. Anesthesiology. 1998,88(3):751-760.7. Miao N, Frazer MJ, Lynch C. Volatile anesthetics depress Ca sup 2+ transients and glutamate release in isolated cerebral synaptosomes. Anesthesiology. 1995, 83:593-603.8. Hung CJ, Liu FY, Shaiu YC, et
18、al.Assessing transient pulmonary injury induced by volatile anesthetics by increased lung uptake of technetium-99m hexamethylpropylene amine oxime. Lung. 2003,181:1-7.9. Sun SS, Hsieh JF, Tsai SC, et al.Transient increase in alveolar epithelial permeability induced by volatile anesthetics with isofl
19、urane.Lung. 2000,178: 129-135.10.Plachinta RV, Hayes JK, Cerilli LA, et al. Isoflurane pretreatment inhibits lipopolysaccharide-induced inflammation in rats.Anesthesiology. 2003,98:89-95.11.Nielsen VG, Baird MS, Mcadams ML, et al. Desflurane increases pulmonary alveolar capillary membrane permeability after aortic occlusion reperfusion in rabbits. Anesthesiology.1998,88:1524-1534.12.Djalal NN, Knight PR, Bacon MF, et al. Alterations in the course of acid-induced lung injury in rats after general anesthesia:volatile anesthetics versus ketamine. Anesth Analg.1998,86:141-146.
