1、- -1红球菌共代谢单氯苯甲酸及固定化细胞的研究齐云 1，赵林和谭欣(天津大学，环境科学与工程学院，天津，300072)文摘: 氯代苯甲酸广泛应用于工农业生产中，导致了其大量释放到环境中。同时，做为模式化合物用于研究氯代芳香化合物的生物降解及阐述氯代化合物生物脱氯的策略。作者自天津农药厂污水处理系统的活性污泥中分离纯化出高效降解 3氯苯甲酸的细菌。经鉴定将其归为红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)。该菌能在 10-30C 温度范围以 3-氯代苯甲酸为唯一碳源和能源生长， 将苯环上的有机氯完全释放出来。由于该菌有广泛的温度适应性，尤其是能在 10C 低温情况下利用底物，
2、这对于低温地区生物修复有重要意义，在低温地域有很广泛的应用前景。但该菌缺乏独立分解 2-或 4-氯代苯甲酸的酶系。在以葡萄糖为外加碳源的条件下，菌株可以共代谢降解 2-氯苯甲酸，但不能分解 4-氯苯甲酸。研究了以聚乙烯醇(PVA),海藻酸钠，壳聚糖为载体时，固定化细菌的效果。结果表明，单以 PVA 为载体时，固定化细胞不能成球性；以海藻酸钠为载体时，固定化细胞强度不足，培养一定时间后大部分菌球破裂；在海藻酸钠溶液中混入适量的 PVA 或壳聚糖都可大幅度提高固定化细胞的强度和韧性。关键词：氯苯甲酸；生物降解；共代谢；固定化氯代苯甲酸(chlorobenzoate, CBA)作为有机合成中间体或直
3、接作为农药、除草剂、防腐剂等而在工业中得到广泛应用 1。据报道，氯代苯甲酸是多氯联苯(PCB)完全降解的限速步骤 2。由于氯原子的引入，导致了苯环结构发生改变，使得氯代苯甲酸的生物降解性能大大降低，同时，由于氯代苯甲酸有较好的水溶性，容易进入自然环境，对人体健康造成严重的影响，对生态系统构成威胁。因此在水体净化和土壤修复过程中，氯代苯甲酸的无害化处理是必不可少的。共代谢是微生物对有机物作用的一种方式,现在对微生物共代谢作用一般定义为：只有在初级能源物质存在时，才能进行的有机化合物的生物降解过程, 在这一过程中，微生物体依赖初级基质的消耗而生长，同时具有降解不可利用投稿日期：2006-06-28
4、作者简介：齐云（1977-） ，女，汉，河北 联系方式：电话：02289845241；Email: - -2碳源和能源物质的能力 3。工业废水中含有大量人工合成的污染物，按照传统的方法很难降解。同时在又中存在众多营养物质，因此微生物菌群可以通过共代谢降解难降解或本身不能降解的污染物。研究某一高效菌株对特定有机物在共基质的条件下的降解不仅为生物处理污水技术提供理论依据，而且对实际水处理工程具有指导意义。目前, 国外已将氯代苯甲酸作为模式化合物用以研究氯代芳香化合物的生物降解以及阐述微生物脱氯的策略 4。但是国内对该化合物的生物降解性能研究还非常的少，并且缺乏对同类有机物共代谢降解等方面的研究。因
5、此，开展生物降解氯代苯甲酸的研究就显得尤为重要。1. 材料与方法1.1 菌株来源活性污泥采自天津市农药股份有限公司污水处理车间。活性污泥处理后进行富集培养，通过纯种分离得到高效分解菌株，命名为S7。1.2 培养基基本培养基(MM)采用Kozlovsky等人方法 5。加入200mg/L 3-氯代苯甲酸(3-CBA，Sigma-Aldrich, USA)做为唯一碳源和能源。1.3 形态观察及生理生化特性生理生化特性参照伯杰系统细菌学鉴定手册 6。1.4 16S rRNA基因扩增及序列测定将纯培养的菌株接入10l灭菌水中，送至宝生物工程有限公司，测定16S rRNA 基因序列，得到的1427bp序列
6、与美国国家生物技术信息中心 (NCBI)的BLAST工具进行对比(http:/ www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) ，对比结果采用MEGA v.3软件分析发育树分析。1.5 菌悬液的制备及培养条件菌悬液的制备：将菌株接种在营养培养基中培养24h，以12,000r/min离心10min，收集菌体，用灭菌后的无机盐培养基洗涤3次，重悬于10mL无机盐培养基中制成菌悬液。将菌悬液加入1000mL锥形瓶中，加入300mL灭菌的氯代苯甲酸无机盐培养液，使氯代苯甲酸的终浓度为200mg/L，在不同温度下，140 rpm 恒温摇床中振- -3荡培养。每隔一定时间取样，立即测定菌体浓度样
7、品以12,000r/min离心10min后，取上清液经0.22m 滤膜过滤，测定氯代苯甲酸、氯离子浓度。1.6 分析方法3-氯代苯甲酸含量的测定：采用反相高压液相色谱 (安捷仑1100，美国)，SupelcosiTM LC18色谱柱(5m , 2504.6mm)，流动相为甲醇：0.25%乙酸58：42。进样量为20l，流速为1 mL/min，在235nm紫外检测。菌体生长测定：采用美国瓦里安紫外可见分光光度计在550nm 条件下测定吸光度。氯离子测定：采用美国戴安Dionex 600离子色谱检测。1.7 共代谢降解不同取代的单氯代苯甲酸将菌悬液加到以葡萄糖为生长底物的含有2-或4-氯代苯甲酸的
8、基本培养液中，使葡萄糖终浓度为500mg/L，2-或4-氯代苯甲酸的终浓度达到200mg/L ，在30C 140 rpm振荡培养， 每隔一定时间取样，立即测定菌体浓度样品以12,000r/min离心10min后，取上清液经0.22m 滤膜过滤，测定氯代苯甲酸浓度。1.8 固定化细菌载体的选择采用海藻酸钠、聚乙烯醇(PVA)、壳聚糖为固定化细胞载体，测定不同浓度载体及几种载体混合使用时，固定化小球的性能。2 结果与讨论2.1 菌种分离鉴定形态学特性：在营养琼脂培养基中培养14h后，菌株S7的菌丝从菌落中央开始断裂，菌落成圆形，光滑，凸起，具有粘性，色微红。24h后形成球形或杆状。在营养琼脂、葡萄
9、糖天门冬素琼脂培养基中均无气生菌丝。革兰氏阳性，严格好氧，不抗酸。细胞壁化学分析：细胞壁含有特征性的阿拉伯糖和半乳糖以及meso-DAP，细胞壁属于型。生理生化反应：菌S 7的特性见表 1。根据形态特征和生理生化反应，将该菌归为红球菌属(Rhodococcus)。16S rDNA分析： 菌株S 7的16S rDNA序列测定后网上提交到NCBI 数据库，- -4登陆号为DQ306923。利用对比工具对其和其他同属的菌株进行对比，构建系统发育树，结果表明菌株S 7与红平红球菌的亲缘关系最近，因此，该菌鉴定为红平红球菌(R. erythropolis )。表1 菌株S7生理生化特征Table 1 C
10、hemotaxonomic properties of strain S7生理生化特性 结果 碳源利用 结果淀粉水解 葡萄糖 硝酸盐还原 L阿拉伯糖 纤维素分解 D果糖 酪素分解 D半乳糖 尿素水解 D甘露糖 6 NaCl 生长 D山梨糖 牛奶凝固 肌醇 V.P实验 柠檬酸钠 明胶液化 油酸 利用葡萄糖产酸 苯酸钠 利用葡萄糖产气 氯代儿茶酚 过氧化氢酶 2氯代苯甲酸 脲酶 3氯代苯甲酸 氧化酶 4氯代苯甲酸 运动性 庚烷 革兰氏染色 甲苯 生长温度范围 437C（最适30C）石油醚 生长pH范围 5.0 12.0（最适7.0） 苯酚 红球菌是革兰氏阳性菌，在处理难降解有机物中起重要作用 8。
11、迄今为止，已经发现该属的菌株可以分解酚、萘、蒽等 9。国外对氯代苯甲酸的降解菌的研究主要集中在革兰氏阴性菌，本文为研究革兰氏阳性菌降解氯代苯甲酸提供了一个新的资料，也为进一步的生物降解工业奠定了基础。- -52.2 不同温度下菌株对3-氯代苯甲酸降解能力比较将菌株S7 在10、20、30 C三种不同温度下培养，定时取样，测定菌体生长量、释放的氯离子浓度及剩余3-氯代苯甲酸含量。实验结果见图1、2、3。图 1 红平红球菌 S-7在不同温度培养条件下菌体浓度变化 (OD550)Fig. 1 Growth of R. erythropolis S-7 at different temperature
12、s从图1可知，该菌能在1030C的温度范围内生长，但在 10C时，菌体的延迟期最长，需要24h的适应期才开始生长。20C 和30C 培养条件下菌体的生长曲线非常相似，在30C 时生长最佳。图 2 红平红球菌S-7在不同温度培养条件下游离氯浓度变化- -6Fig. 2 Chloride concentration of R. erythropolis S-7 at different temperatures图2的氯离子浓度变化表明，全部的有机氯都从苯环上释放出来，形成游离氯。S7能将所有的 3-氯代苯甲酸苯环上结合的氯释放出来，说明该菌具有降解其它氯代芳香化合物的潜能。图 3 红平红球菌S-7
13、在不同温度培养条件下残余3-CBA 浓度变化Fig. 3 3-CBA concentration of R. erythropolis S-7 at different temperatures从图3的结果表明，菌株R. erythropolis S7可以在1030C的温度范围内完全分解3- 氯代苯甲酸。降解速度在一定程度上取决于菌体的生长量。菌体生长处于延迟期时，降解速率较慢；进入对数期，降解速度增加；进入稳定期时生物量最大，在20C和30C条件下，3-氯代苯甲酸不需适应马上开始降解，在60h时，底物完全被利用。尽管菌株在10C时能氯代苯甲酸降解完全，但是需要一定的时间来适应低温环境，使得在
14、开始的24h内，底物浓度几乎没有发生变化。在寒冷的区域内，大部分的时间温度在20C以下，此时底物变得难溶解，而且细菌降解的酶系受到低温的抑制，使得难降解物质在低温条件下比常温下更难分解 10。 鉴于大部分的微生物不能在10C条件下生长并降解有机物，而该菌有广泛的温度适应性，能在我国北方大部分地区生长，该菌具有在低温区域处理污水的能力，有广泛的应用前景。2.3 葡萄糖为生长底物时菌株S7对2-氯代苯甲酸及 4-氯代苯甲酸的降解- -7葡萄糖在自然界中广泛存在，也是细菌非常容易利用的碳源，在污水处理过程中会有葡萄糖的存在，并且葡萄糖不会对环境造成风险，因此考察在以葡萄糖为生长底物时菌株对2-CBA
15、(图4)及4-CBA(图5)的降解能力。 图 4 葡萄糖为生长底物时对2-氯代苯甲酸的共代谢Fig. 4 2-CBA cometabolism with glucose as growth substrate图4和图5细菌的生长曲线表明，葡萄糖的存在加快了微生物新陈代谢的速率,增加了生物量。在以葡萄糖为唯一碳源时适应期很短，很快就进入对数期，24h后进入稳定期。在以2-或4-CBA为唯一碳源时，由于细菌缺乏相应降解的酶系，细菌不能利用底物生长。加入葡萄糖后，由于氯代苯甲酸的存在，使得菌体的生长的适应期增长，24h后才开始生长。在以葡萄糖和2-氯代苯甲酸为底物的培养条件下，2-CBA 可部分降解
16、(图4)，其降解曲线和细菌的生长曲线相似，都有适应期的存在。在培养36h以后，2-CBA的降解才逐渐增加。而且在葡萄糖耗尽后(72h) ，细菌降解2-CBA的能力也逐渐减弱，最后完全消失。这种现象主要是因为在降解2-CBA过程中，葡萄糖不仅为细菌提供了碳源，同时也提供还原力NADH和其它必需因子，使得细菌能在利用葡萄糖的同时降解2-CBA。在葡萄糖耗尽后，细菌通过内源代谢来维持酶活性，此时2-氯代苯甲酸的转化仍可以进行。但内源代谢的时间较短，直至降解能力完全消失。- -8图 5 葡萄糖为生长底物时对4-氯代苯甲酸的共代谢Fig. 5 4-Chlorobenzoate cometabolism
17、with glucose as growth substrate从图5的4- 氯代苯甲酸降解曲线可见，虽然细菌能在以葡萄糖和4-CBA 为底物的培养基中生长，但是4-CBA不能被降解。4-CBA也同样抑制菌体的生长，适应期增加。菌株不能共代谢4-CBA可能是由于在这种情况下，即使添加了葡萄糖，葡萄糖所提供的因子仍不能满足降解4-CBA 所需，这与Schukat 等人的实验有相似之处 11。2.4 固定化细菌载体的选择2.4.1 海藻酸钠为包埋载体时载体浓度的选择将菌悬液加到不同浓度的海藻酸钠溶液后，用 7 号针头滴加到 3%氯化钙溶液中，钙化 24h 形成微球，然后用生理盐水冲洗小球。取定量微
18、球，测定其强度。表 2. 海藻酸钠浓度对固定化小球载体性能的影响Table 2 Effect of sodium alginate concentration on immobilized balls properties海藻酸钠浓度(%) 操作难易程度 成球性 手感压缩性1.5 易操作 较好 弹性较好3 易操作 好 弹性较好5 较难操作 好 弹性好采用 1.5%、3% 、5%的海藻酸钠作为固定化载体。操作结果见表 2。经过- -95d 的摇床培养后，发现所制备微球大部分都破裂。2.4.2 以聚乙烯醇(PVA)为固定化载体将菌悬液加到不同浓度的PVA溶液后，用7号针头滴加到 饱和硼酸溶液中，室
19、温下在饱和硼酸溶液中交联24h ,然后用生理盐水冲洗小球,除去其表面粘附的硼酸。取定量微球，测定其强度。 试验结果见表3。表 3. 聚乙烯醇浓度对固定化小球载体性能的影响Table 3 Effect of PVA concentration on immobilized balls propertiesPVA 浓度（%） 操作难易程度 成球性 强度5 易操作 差 较好8 易操作 差 较好10 较难操作 差 好12 难操作 差 好PVA 作为最广泛应用的固定化包埋材料之一,近年来受到广大研究者的关注,但是,在实验中发现, PVA 在作为载体材料包埋固定化过程中存在着成球难,水溶膨胀性等等问题。随
20、着浓度增加，机械强度增加，但是操作难度也增加，当 PVA 浓度大于 12%时，由于液体黏度很大，PVA 缓冲液很难与菌悬液混合均匀，2.4.3 壳聚糖抑菌实验的研究配置不同浓度的壳聚糖溶液，加到牛肉膏蛋白胨液体培养基中，以不加入壳聚糖的培养基作为空白对照， 30C 培养 3d 后测定 OD 值。结果见表 4。表4. 不同浓度壳聚糖对菌株生长的影响Table 4 Effect of chitosan concentration on growth of strain壳聚糖浓度（%）OD550 (三个样品的平均值) 相对存活能力（%）0 1.22 1000.1 1.21 980.3 1.19 97
21、0.6 1.16 96- -101.0 1.13 945.0 1.0 8210.0 0.84 69从表中可以看出，菌体对壳聚糖的耐受能力比较高，基本对菌体生长没有太大影响，可以作为固定化细菌的载体使用。2.4.4 以海藻酸钠和壳聚糖为固定化载体在菌悬液中加入 3%海藻酸钠，充分溶解至成糊状，用 7 号针头滴入 3%氯化钙溶液中浸泡 24h。在 4C 条件下将制备的小球置于 0.6%、pH 5.5 的溶于1.0%冰醋酸中的壳聚糖溶液中进行成膜反应，15min 后取出，用生理盐水洗净后，浸入 0.15%的海藻酸钠中 5min，再用生理盐水洗净后，浸入 11.6%的柠檬酸溶液中，液化 30min，用
22、生理盐水洗净制得微胶囊。从表中可以看出，采用0.6%壳聚糖和海藻酸钠为载体时微球性能最好。表5. 以海藻酸钠和壳聚糖为固定化载体时对固定化小球性能的影响Table 5.When using sodium alginate and chitosan as carrier, the properties of the immobilized balls壳聚糖浓度（%）操作难易程度 成球性 手感压缩性0.3 易操作 好 较好0.6 易操作 好 较好1.0 较难操作 好 好2.4.5 以海藻酸钠和聚乙烯醇(PVA)为固定化载体在菌悬液中加入 3%海藻酸钠，0.15%、3%或 10%PVA，充分溶解，用
23、 7号针头滴入 3%氯化钙的饱和硼酸溶液中浸泡 24h。用生理盐水洗净制得微胶囊。表6. 以海藻酸钠和PVA为固定化载体时对固定化小球性能的影响Table 6 When using sodium alginate and PVA as carrier, the properties of the immobilized ballsPVA 浓度（%） 操作难易程度 成球性 手感压缩性- -110.15 易操作 好，且成球均匀好3 较易操作 好 好10 难操作 较好 弹性差，成乳白色比较不同浓度 PVA 制得的微球性能可知在以 0.15PVA 和 3海藻酸钠为载体时，微球性能最佳。2.4.6 以
24、PVA、海藻酸钠、壳聚糖为固定化载体采用 3%海藻酸钠、0.6%壳聚糖和 0.15%PVA 为载体时固定化微球的性能。操作时比较容易，成球性好，弹性较强，强度较大。3 结论自农药厂污水处理系统的活性污泥中分离出一株降解3-氯代苯甲酸的菌株S7，经鉴定为 红平红球菌（ Rhodococcus erythropolis） 。该菌可在10C的低温条件下完全降解3-氯代苯甲酸，在20C和30C 时能在 60h内利用全部的底物。此外，该菌能在以葡萄糖为生长底物的环境中共代谢利用2-氯代苯甲酸，但不能共代谢4- 氯代苯甲酸。研究了以聚乙烯醇(PVA),海藻酸钠，壳聚糖为载体时，固定化细菌的效果。在海藻酸钠
25、溶液中混入适量的PVA 或壳聚糖都可大幅度提高固定化细胞的强度和韧性。参考文献： 1 Yuroff S A, Sabat G, Hickey J W. Transporter-mediated uptake of 2-chloro- and 2-hydroxybenzoate by Pseudomonas huttiensis strain D1J. Appl Environ Microbiol, 2003, 69(12): 740174082 Corbella E M, Pertierra G A, Puyet A. Induction of the halobenzoate catabol
26、ic pathway and cometabolism of ortho-chlorobenzoates in Pseudomonas aeruginosa 142 grown on glucose-supplemented mediaJ. Biodegradation, 2001, 12(3): 1491573 Roman N, Petra P W, Lothar E, and Hermann S. Cometabolism of a nongrowth substrate: L-serine utilization by Corynebacterium glutamicumJ. Appl
27、Environ Microbiol, 2004, 70(12): 714871554 Yi H, Min K, Kim C, Ka J. Phylogenetic and phenotypic diversity of 4- -12chlorobenzoate-degrading bacteria isolated from soilsJ. FEMS Microbiol Ecol, 2000, 31: 53-605 Kozlovsky S A, Zaitsev G M, Kunc F et al. Degradation of 2-chlorobenzoic and 2,5-dichlorob
28、enzoic acids in pure culture by Pseudomonas stutzeriJ. Folia Microbiol, 1993, 38: 371-3756 Goodfellow, M. Genus Rhodococcus Zopf 1891, 28ALM. Bergeys Manual of Systematic BacteriologyM. USA. Williams and Wilkins, 1986.7 J.萨姆布鲁克, D.W. 拉赛尔著，黄培堂等译。 分子克隆实验指南 M。第三版，北京：科学出版社，20058 Bell K, Philip J, Aw D W
29、 et al. The genus RhodococcusJ. J Appl Microbiol, 1998, 85(2):195-2109 Prieto M, Hidalgo A, Serra J et al. Degradation of phenol by Rhodococcus erythropolis UPV-1 immobilized on Biolite in a packed-bed reactorJ. J Biotechnol, 2002, 97(1): 1-1110 Kato T, Haruki M, Imanaka T et al. Isolation and chara
30、cterization of long-chain-alkane degrading Bacillus thermoleovorans from deep subterranean petroleum reservoirsJ. J Biosci Bioeng, 2001, 91(1): 64-70.11 Schukat B, Janke D, Krebs D et al. Cometabolic degradation of 2- and 3-chloroaniline because of glucose metabolism by Rhodococcus sp. An 117J. Curr
31、 Microbiol, 1983, 9(1):81-86- -13Cometabolic degradation of mono-chlorobenzoate by a Rhodococcus sp. and research on the immobilized cell Qi Yun1，Zhao Lin and Tan Xin(1School of Environmental Science and Engineering, Tianjin University, Tianjin 300072, China)Abstract: Large amounts of chlorobenzoate
32、s are released into the environment as a result of their wide use in agriculture and industry. They also have been used as models to study the biodegradation of halogenated aromatic compounds, and to elucidate the microbial strategies implicated in the release of chlorine substituents. A strain S7 w
33、hich can degrade 3-chlorobenzoate was isolated from activated sludge of a pesticide wastewater treatment plant, Tianjin, China. The organism S7 was classified as Rhodococcus erythropolis. The strain can use 3-chlorobenzoate as sole carbon and energy sources from 10-30C with complete chloride ions re
34、lease from the benzene. The wide temperature adaptation, especially the psychrotolerant ability, was significant for bioremediation in low temperature regions. However the strain lacks the enzyme systems which catalyze the degradation of 2- or 4-chlorobenzoate. When glucose was added as grow substra
35、te, strain S7 can cometabolic degrade 2-chlorobenzoate, but cannot biodegrade 4-chlorobenzoate. The immobilized bacterial prepared by polyvinyl alcohol (PVA), sodium alginate, chitosan. Results showed that when used PVA alone, the immobilized cell can not form beads. Using alginate alone, intension of the immobilized cell was not strong enough, which were broken after - -14period of culture time. When added PVA or chitosan to the alginate, both strength and tenacity were enhanced greatly.Key words: chlorobenzoate; biodegradation; cometabolic degradation; immobilize
