1、1中南大学生物科学与技术学院分子生物学研究中心教 案授课科目: 医学分子生物学授课内容: 基因结构与表达分析的基本策略授课对象：临床医学七年制、八年制授课时数：6 学时授课教师：授课地点：湘雅医学院新教学区授课时间：授课教材：医学分子生物学（21 世纪高等院校教材） ，胡维新主编，北京：科学出版社，2007 年 2 月，第一版；医学分子生物学（卫生部 8 年制规划教材） ，冯作化主编，北京： 人民卫生出版社，2005，第一版第七章 基因结构与表达分析的基本策略一、目的要求：掌握：DNA 双脱氧末端终止法测序、Southern blot 杂交、Northern blot 杂交和 PCR 等技术原
2、理及在因结构与表达分析中的应用；熟悉：Western blot 原理及在特定基因产物-蛋白质分析中的应用。了解：DNA 序列测定的原理及其主要应用；RNA 酶保护试验原理及应用；原位杂交技术；DNA 微阵列技术原理；流式细胞术的应用；免疫组化方法的应用。二、讲授重点：Southern 杂交和 PCR 等技术原理及应用；Northern blot、RT-PCR 和 Real-time PCR 技术原理及应用；Western blot 原理及应用。三、讲授难点： RNA 酶保护试验原理及应用。四、教学方法：多媒体教学五、教 具：多媒体课件六、讲授内容：2第一节 DNA 序列分析一、双脱氧末端终止法
3、（讲授重点与难点）（一）基本原理 1977 年，Sanger 建立的双脱氧核苷酸末端终止法以 DNA 合成反应为基础图 7-1 ATP、dATP 和 ddATP 的结构示意图3图 7-2 DNA 合成反应模式图末端终止法：在 DNA 合成反应体系中，除含有正常脱氧核苷三磷酸底物外，还加入少量的双脱氧核苷三磷酸(ddNTPs)特殊底物，由于这种底物的 5-磷酸基团是正常的，能够替代相对应的脱氧核苷三磷酸而与引物延伸链的 3羟基连接，进入部分新合成链；但由于这种特殊底物不存在 3羟基末端，故下一个核苷酸底物不能通过 5-磷酸基团与之形成 3,5-磷酸二酯键，从而导致 DNA 新链的延伸提前终止于这
4、一“异常”核苷酸处，而掺入的双脱氧核苷三磷酸则位于DNA 延伸链的最末端（图 7-3）4然而图 7-3 末端终止部位示意图（二）主要步骤1.单链 DNA 模板的制备。2.DNA 模板与测序引物退火。3.掺入法标记反应。4.延伸-终止反应。 图 7-4 测序反应的基本原理和过程55变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。6. 放射自显影。7.阅读测序结果。图 7-5 末端终止测序反应产物电泳区带放射自显影二、化学降解法（自学为主）化学降解法是建立在对原有 DNA 的化学降解过程基础之上的。（一）基本原理在化学降解法中，单侧末端标记的 DNA 片段在 5 组相互独立的化学反应中分别得到部分降解，其中每一组反应特异
5、地针对某一种或某一类被修饰碱基，因此形成 5 组带有放射性标记的长短不一的 DNA 混合物。它们的长度取决于该组反应所针对的碱基在原有 DNA 片段上的位置。然后，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分别分离这 5 组 DNA 混合物，再通过放射自显影来检测末端标记 DNA 链的电泳区带位置。6（二）主要步骤1.目的 DNA 的制备。2.单侧末端标记待测 DNA 片段。3. 碱基的特异性修饰及化学降解。图 7-6 化学降解 G 反应模式图4.聚丙烯酰胺凝胶电泳。5.阅读分析结果。图 7-7 化学降解反应产物电泳区带放射自显影示意图三、DNA 序列分析的自动化（主要了解原理）7采用 4 种带有不同琥珀酰荧光素
6、标记的终止物 ddNTPs，可以在同一个反应管中进行末端终止测序反应，并于变性聚丙烯酰胺凝胶的同一泳道中进行电泳检测，从而降低了测序泳道间迁移率差异对精确性的影响。同时，对 DNA 序列的识读也在电泳过程中完成，即当带有某种荧光素标记的单链 DNA 片段电泳到激光探头的检测范围时，激光所激发的荧光信号被探测器接收，经计算机分析数据，于记录纸上以红、黑、蓝和绿四种颜色打印出由带有不同荧光素染料标记终止物ddNTPs 标示的 DNA 片段峰谱，继而自动排出 DNA 序列。图 7-8 荧光偶联法自动 DNA 测序结果 第二节 核酸分子杂交技术1969 年，Pardue 等首先建立了细胞原位杂交技术。
7、1975 年，Southern EM 建立了检测 DNA 的 Southern 印迹杂交技术。1977 年, Stark GR 建立了检测 mRNA 的 Northern 印迹杂交技术。一、核酸分子杂交的原理 核酸分子杂交实质上是双链 DNA 或者具有二级结构的 RNA 变性后，其具有互补序列的两条单链的复性过程。1. 变性（denaturation ） 2. 复性(renaturation)3. 杂交（hybridization）二、Southern 印迹杂交(Southern blot hybridization)（要求学生重点掌握其原理及基本过程）1975 年，英国爱丁堡大学的 Sout
8、hern EM 首创了这一方法，并称之为Southern 印迹转移。Southern 印迹杂交的基本过程。1. 制备基因组 DNA。2. 用限制性核酸内切酶消化基因组 DNA。3. 适当浓度的琼脂糖凝胶电泳分离 DNA 酶切片8段。57发 现 正 常 人 类 基 因 组 上 存 在 DNA拷 贝 数多 态 性 （ copy number polymorphism，CNP基 因 或 DNA拷 贝 数 的 变 化 对 揭 示 人类 的 一 些 遗 传 差 异 和 疾 病 机 制 等 有 重 要意 义 。二 、 Southern杂 交 和 PCR等 技 术 可 分 析基 因 拷 贝 数 的 变 化4
9、. Southern 印迹转移前的凝胶预处理。5. Southern 印迹转移。图 7-9 Southern 印迹转移示意图1 重物 2玻璃板 3吸水纸 4硝酸纤维素膜5凝胶 6滤纸盐桥 720SSC6. 用标记的核酸探针与转移到固相支持物上的核酸片段进行杂交。7. 杂交结果的显示。三、Northern 印迹杂交(Northern blot hybridization)（重点掌握其原理及基本过程）1977 年, Stark GR 建立了 Northern 印迹转移。Northern 印迹转移可以对 mRNA 进行定性和定量分析，即基因表达分析。Northern 印迹转移除了在样品的制备、凝胶电
10、泳分离及凝胶的处理步骤与Southern 印迹转移不同外，其他步骤与 Southern 印迹转移基本一致。四、斑点杂交和狭缝印迹杂交(dot blot hybridization and slot blot hybridization)(了解)斑点杂交和狭缝印迹杂交系将 RNA 或 DNA 变性后直接点样于硝酸纤维素膜或尼龙膜上，用于基因组中特定基因及其表达的定性及定量研究，称为斑点印迹。五、原位杂交（in situ hybridization）(了解)1969 年，Pardue 等首先用爪蟾核糖体基因探针进行细胞原位杂交，发现该基因位于核仁，建立了原位杂交技术。20 世纪 80 年代开始采用
11、荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization, FISH)六、液相杂交(solution hybridization)91核酸酶 S1 保护分析法 (nuclease S1 protection assay)(了解)2. RNA 酶保护分析法（RNase protection assay，RPA）(了解)3. 引物延伸分析法(了解)4. 抑制性消减杂交（suppression subtractive hybridization，SSH）(了解)图 7-10 抑制性消减杂交流程图第三节 聚合酶链式反应聚合酶链式反应(polymerase chain reac
12、tion，PCR)是 Kary Mullis 于 1985 年发明的一种模拟天然 DNA 复制过程的核酸体外扩增技术。一、PCR 反应基本原理（讲授重点）PCR 是利用 DNA 聚合酶在体外条件下，催化一对引物间的特异 DNA 片段合成的基因体外扩增技术。引物是指与待扩增 DNA 片段两翼互补的寡聚核苷酸，其本质是单链 DNA 片段。当引物与单链模板互补区结合后，在 DNA 聚合酶作用下即可进行 53合成反应。10（一）PCR 技术的基本过程PCR 包括三个基本过程：变性（denaturation ） 1退火（annealing ） 2延伸（extension ） 3这三个过程组成一个循环周期
13、；每个周期合成的产物又可作为下一个周期的模板，如此循环往复，经过 n 轮循环后，靶 DNA 的拷贝数理论上呈 2n 增长（图7-11） ，亦即一个靶 DNA 分子经过 20 轮循环后，理论上，其拷贝数将达百万（2 20=1 048 576）个分子。图 7-11 PCR 技术的原理示意图引物延伸产物：比两引物限定区长的延伸产物。仅能发生在以原始模板DNA 为模板的扩增过程中。（二）平台期与平台效应经过一定数量的循环后，随着产物的对数累积趋于饱和，DNA 片段不再呈指数积累，而是进入线性增长期或静止期，此过程称为平台效应（plateau effect） 。下列因素与平台期有关：引物、dNTP 快速
14、掺入底物中，浓度降低，掺入速度减慢。 1随产物增加，酶与模板的比例下降。 2非特异性产物或引物二聚体与反应物的竞争。 311产物的再结合。 4二、耐热的 DNA 聚合酶（一）Taq DNA 聚合酶该酶是从嗜热水生菌 Thermus aquatics YT-1 株中直接分离出来的。基因全长2 499 bp，编码分子量为 94 kD、长度为 832 个氨基酸的蛋白质。1. Taq DNA 聚合酶活性Taq DNA 聚合酶具有较高的热稳定性。Taq DNA 聚合酶具有以下特性：53方向的聚合活性；53方向的外切酶活性；逆转录酶活性；较弱的非模板依赖性；缺乏 35方向的外切酶活性，因而无校正功能。2.
15、 无机离子和抑制剂Taq DNA 聚合酶的活性对 Mg2+浓度和单价离子（ K+或 NH4+）的性质和浓度较敏感。 3. 保真性表 7-1 各种 DNA 聚合酶在 PCR 过程中的保真性35 外切酶活性 碱基替换聚合过程中核苷酸的错误率T4 DNA 聚合酶 1/80 000 1/260 000修饰的 T7 DNA 聚合酶 1/53 000 1/190 000Klenow 片段 1/27 000 1/140 000Taq DNA 聚合酶 1/9 000 1/41 000采用以下优化条件可提高 PCR 过程中 DNA 聚合酶催化掺入核苷酸的保真性：在 PCR 反应体系中，除使用 Taq DNA 聚
16、合酶外，加入少量的具有 35外 1切酶活性的耐热 DNA 聚合酶如 Pfu、Vent 、Pwo 等可使错配率降为原来的1/10； 使 4 种三磷酸脱氧核苷酸浓度相等； 2在不影响 DNA 合成的情况下，尽可能使用低浓度的 MgCl2。尽量缩短高温反应时间，以减少对 DNA 的热损伤。尽可能减少循环数。使在 70时反应体系的 pH 值低于 6.0。 612（二）其他耐热 DNA 聚合酶1Tth DNA 聚合酶2Vent DNA 聚合酶3Pfu DNA 聚合酶三、PCR 引物及设计原则（重点，注重实际运用）（一）引物设计的原则1长度及碱基分布：引物长度一般为 1030 个核苷酸。4 种碱基的分布应
17、遵循随机原则，不应有聚嘌呤或聚嘧啶存在，尤其 3端不应超过 3 个连续的 G 或C，因为这样会使引物在 G+C 富含区引发错误延伸。 G+C 含量一般为40%60%，引物与非特异性扩增序列的同源性不应超过 70%，避免有连续 8 个以上碱基同源。2引物之间及引物自身：两引物之间不应有互补性，尤应避免 3端互补重叠以防引物二聚体的形成。3引物 3端：引物的延伸从 3端开始，3端不能进行任何修饰，也不能有形成任何二级结构的可能。4引物 5端：引物 5端限定 PCR 产物的长度6简并引物：简并引物（degenerate primers）是指碱基序列不同，但有相同碱基数的一组针对某一基因相同区域的寡核
18、苷酸混合物。图 7-12 列举了几种因引物设计缺陷而导致的后果。图 7-12 几种常见引物设计缺陷及其后果（二）引物的合成与纯化（三）引物的用量及其计算（掌握）1 A260 单位相当于 33 g的 oligo DNA，一条含 N 个碱基的引物，有 X A26013单位的 oligo DNA，其 pmol 量为：105 1 XY=X33 = 10 5（pmol） （公式 1）33 N N四、PCR 反应条件的优化1 Taq DNA 聚合酶的浓度： 1.02.5 U/100 l 反应液。2dNTP 的浓度： 20200 mol/L 。3Mg 2+浓度： 0.52.5 mmol/L。4引物的浓度：
19、0.10.5 mol/L 。五、常用的 PCR 改进技术（一）RT-PCR (reverse transcription PCR)（讲授重点）RT-PCR 原理是先在逆转录酶的作用下，以 mRNA 为模板合成 cDNA，再以此cDNA 为模板进行 PCR 反应（图 7-13） 。常用的逆转录酶有两种， AMV 逆转录酶和 MMLV 逆转录酶。图 7-13 RT-PCR 原理示意图（二）半定量 RT-PCR(semi-quantitative RT-PCR)(掌握)（三）实时荧光定量 RT-PCR（real-time fluorescent quantitative PCR，FQ-PCR） （熟
20、悉并了解其原理）1原理（1）荧光染料（fluorescent dye, fluorochrome）14（2）荧光共振能量转移（fluorescence resonance energy transfer，FRET） （3）荧光标记探针 PCR 体系中除常规扩增引物外，还需要特异性针对扩增模板的探针，位置在引物对中间。A.采用双荧光标记探针（Taqman TM 5-nuclease assay） ，利用 Taq DNA 聚合酶的 53聚合酶活性及 53外切酶活性，可以在链延伸过程中实现链替换，并将被替换的探针切断，故可进行定性与定量检测。（图 7-15） 。荧光探针必须完全与靶基因互补，长度以
21、2030 个核苷酸为宜，必要时 3端磷酸化封闭，以防在扩增时作为引物延伸。图 7-15 双标记探针荧光 PCR 定量分析原理B. 分子信标探针（molecular beacon TM） 。是一个发夹样结构的特异探针，其环状部分与靶序列互补。在室温时，分子信标的发夹紧闭，荧光淬灭；PCR 扩增时，随着温度升高，发夹松开，与单链模板特异结合，发出荧光；荧光强度与模板呈正比，故可用于 PCR 产物的定性及定量分析（图 7-16）。15图 7-16 分子信标探针发光原理示意图（4）实时荧光定量 PCR 计算原理临界点（threshold）选择。临界点循环（threshold cycle，Tc 或 Ct
22、） 。标准曲线绘制。PCR 扩增包含定量对照即引入一系列已知起始浓度的模板与未知样品同时进行扩增，配合使用 PCR 扩增与荧光检测合二为一的仪器，利用该系列模板 Ct 值与已知浓度对数做直线回归得到标准曲线，从而计算出未知样品的起始模板浓度。（四）反向 PCR（inverse PCR） （了解）反向 PCR 是对已知 DNA 片段两侧的未知序列进行扩增和研究的一种简捷方法。其原理是：用限制性内切酶 A 消化 DNA 片段，然后用连接酶将酶切产物连接成环状，再用已知序列上两端相反方向的引物进行 PCR 扩增。 （图 7-17） 。16图 7-17 反向 PCR 原理示意图A 和 B 分别为限制性
23、内切酶及其酶切位点；P1 和 P2 分别为引物；黑色区域为已知序列；空白区域为未知序列（五） Alu-PCR（了解）利用 Alu 高度保守区序列设计引物，扩增未知 DNA 片段的方法称 Alu-PCR（图 7-18） 。图 7-18 Alu-PCR 原理示意图（六）原位 PCR(in-situ PCR) （了解）17原位 PCR 是指直接用细胞涂片或石蜡包埋组织切片在单个细胞中进行 PCR 扩增，然后用特异探针进行原位杂交检测含该特异序列的细胞的一种方法。（七）巢式 PCR（nested PCR） （了解）有时由于扩增模板含量太低，为了提高检测灵敏度和特异性，可采用巢式PCR。巢式 PCR 是
24、设计两对引物，一对引物对应的序列在模板的外侧，称外引物（outer primer） ，另一对引物互补序列在同一模板的外引物的内侧，称内引物（inter primer） ，即外引物扩增产物较长，含有内引物扩增的靶序列，这样经过二次 PCR 放大将单拷贝的目的 DNA 片段检出（八）不对称 PCR（asymmetric PCR） （了解）不对称 PCR 的目的是扩增产生特异长度的单链 DNA。 图 7-19 不对称 PCR 原理示意图（九）固相锚定 PCR（solid-anchored PCR） （了解）固相锚定 PCR 是利用耦合于一固相基质上的特异性寡核苷酸链作为引物合成cDNA，从而使合成的
25、 cDNA 与固相基质以共价键相结合。（十）长片段 PCR（long distance PCR） （了解）人们利用两种耐热 DNA 聚合酶的混合体进行长片段 PCR 扩增，第一种耐热 DNA聚合酶缺乏 35外切酶活性；而第二种酶含量较少，具有 35外切酶活性。这样，在长 PCR 扩增过程中，当第一种酶（如 Taq DNA 聚合酶）错误地掺入一个 dNTP 时，随后的 DNA 新链合成延伸过程将变慢甚至中止。这时，第二种酶（如 Pfu 或 Tli DNA 聚合酶）则可切除错误的碱基，使 Taq DNA 聚合酶能继续将新链合成下去。18（十一）多重 PCR(multiple PCR) （了解）多重
26、 PCR 是在一次反应中加入多种引物，同时扩增一份 DNA 样品中的不同序列。 第四节 基因芯片和微阵列技术(了解原理）一、芯片制备技术 二、样品制备与杂交反应 1. 样品标记2.杂交反应及过程控制技术3.杂交信号检测4.信号分析与解读图 7-20 基因芯片分析的主要流程三、DNA 芯片技术的主要应用1应用 DNA 芯片技术分析基因组及发现新基因2DNA 芯片用于基因表达的研究193DNA 芯片用于 DNA 序列分析4基因诊断和基因药物的设计第五节 Western 免疫印迹技术（掌握原理）细胞内基因表达的最终产物是蛋白质，因此检测蛋白质是研究基因表达最常用、最有效的手段之一。Western 免
27、疫印迹的基本原理与 Northern 印迹杂交和 Southern 印迹杂交十分相似，都是由凝胶电泳、转膜、杂交和信号显示等步骤组成。不同之处是Western 免疫印迹检测的是蛋白质，使用的凝胶是 SDS聚丙烯酰胺凝胶, 所用的探针是蛋白质抗体，而不是核酸。化学发光法检测原理如图 7-21 所示：图 7-21 Western 免疫印迹信号检测原理第六节 基因结构与表达分析的其它技术一、cDNA 末端快速扩增技术（了解）快速扩增 cDNA 末端（rapid amplification of cDNA ends，RACE）是一种用PCR 扩增转录物的某一点与 3或 5端之间区域的方法（图 7-22
28、） 。20图 7-22 5RACE 原理示意图二、PCR 产物单链构象多态性检测（PCR-single strand conformation polymorphism, PCR-SSCP） （了解原理）其原理是：在不含变性剂的中性聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，单链 DNA 的迁移率除与 DNA 链的长度有关外，更主要的是取决于该 DNA 单链所形成的构象。可用该法对基因突变进行检测。21图 7-23 PCR-SSCP 分析原理示意图三、限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism, RFLP) 和 PCR-RFLPRFLP 技术的基本原理是
29、利用特定的限制性内切酶识别并切割（消化）不同生物个体的基因组 DNA，得到许多大小不等的 DNA 片段， 所产生的 DNA 数目和各个片段的长度反映了 DNA 分子上不同酶切位点的分布情况。RFLP 的产生机制包括: DNA 分子中产生点突变，导致酶切位点的丧失或出现；限制性酶切位点之间重复序列数目改变；限制性酶切位点前后 DNA 片段的插入或缺失，导致酶切片段长度改变。参考文献1. 胡维新医学分子生物学长沙：中南大学出版社，20012. 冯作化医学分子生物学北京：人民卫生出版社，20013Sambrook J, Fritsch F, Maniatis T. Molecular Cloning
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