1、实验八 对羟基苯甲酸酯类混合物的反相高效液相色谱分析一、实验目的(1) 了解高效液相色谱仪构造。(2) 了解高效液相色谱分析操作。(3) 学习高效液相色谱保留值定性方法和归一化法定量方法。二、实验原理对羟基苯甲酸酯类混合物中含有强极性化合物对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯和对羟基苯甲酸丁酯，可采用反相液相色谱进行分析，选用非极性的 C-18烷基键合相作固定相，甲醇的水溶液作流动相。由于在一定的实验条件下，酯类各组分的保留值保持恒定，因此在同样条件下，将测得的未知物的各组分保留时间，与已知纯酯类备组分的保留时间进行对照，即可确定未知物中各组分存在与否。本实验采用归一化法定量，
2、归一化法使用条件及计算公式，与气相色谱分析法相同。而对羟基苯甲酸酯类混合物属同系物，具有相同的生色团和助色团，因此它们在紫外光度检测器上具有相近的校正因子，可用下式：三 仪器高效液相色谱（HPLC）系统四 试剂1.对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯、甲醇等均为分析纯。2.纯水 去离子水，再经过一次蒸馏3.标准溶液的配置（1） 标准贮备液 分别于四只 100mL容量瓶中，配制浓度均为 1000 g.mL -1的上述四种酯类化合物的甲醇溶液。（2） 标准使用液 用上述四种标准贮备液分别于四只 10mL容量瓶中，配制浓度均为 10g.mL -1的酯类化合物的甲醇溶
3、液，摇均备用。（3）标准混合使用液 于一只 10mL容量瓶中，用上述四种标准溶液贮备液，配制浓度均含 10 g.mL-1 的酯类混合物的甲醇溶液，摇均备用。五 实验条件1.色谱柱 长 15cm、内径 3mm，装填 C-18烷基键合相颗粒度为 5m 的固定相2.流动相 甲醇：水（55:45） ，3.流速 1mL.min -14.检测器 DAD 检测器，254 nm，灵敏度 0.04六 实验步骤1.将配制好的流动相甲醇水溶液置于超声波发生器上脱气 15min。2.根据实验条件，将仪器按照仪器操作步骤调节至进样状态，待仪器液路和电路系统达到平衡时，图谱基线呈平直，即可进样。3.依次分别吸取 5L 的
4、四种标准适用溶液及标准混合使用液个未知试样液进样，记录各色谱图，并重复两次。在每次进样后，于进样信号附近标明进样溶液名称。七 数据及处理1.测量三种对羟基苯甲酸酯化合物色谱图的保留时间，并列表。表 1 三种对羟基苯甲酸酯化合物的保留时间保留时间组分tR（min）对羟基苯甲酸甲酯对羟基苯甲酸乙酯对羟基苯甲酸丙酯2.依次测量混合液色谱图上各色谱峰的保留时间值，然后与上表数据对照，确定各色谱峰代表何种化合物，计算各组分峰面积 A及其含量%Ci。 。表 2 未知试样色谱图定性分析 定量分析保留时间组分 tR（min ） 相应化合物名称峰面积相应化合物%峰 1峰 2峰 3八 思 考 题 1归一化法定量的使用条件？本实验为什么可以采用归一化法定量？2在高效液相色谱中，为什么可利用保留值定性？这种定性方法你认为可靠吗?
