1、如何解决细胞培养中的支原体污染？一说起支原体，估计细胞培养的人员就开始手心冒汗了。细胞培养中的急性污染往往容易察觉，而支原体则像慢性毒药一般，杀细胞于无形中。除了非常有经验的老手，很多实验人员都察觉不到支原体的污染。据统计，超过 25%的细胞系中感染了支原体，而研究者大多并不知晓。早期，血清可能是主要的污染源；之后，通过实验室的仪器、培养基或其他试剂渐渐蔓延开来，细胞无不中招。怎样才能根除讨厌的支原体污染呢？让我们先来认识这个小东西。狡猾的支原体支原体是唯一一种没有细胞壁的原核生物，大多呈不规则球状或丝状。由于它的直径小（约为 0.15-2 m） ，而且形状灵活，所以能逃过实验室常用的滤膜。支
2、原体的种类非常多，超过了 100 种。当然，大部分支原体检测都不可能检测到所有的种类。不过，在实验室中捣乱的支原体也通常就是那一小撮。支原体生长缓慢，通常不破坏宿主细胞。然而，它们能以许多不同方式改变细胞的新陈代谢。细胞除了长得不好之外，几乎所有的实验表现如蛋白表达也都会受到影响。传统的抗生素对支原体并不奏效，因为它们大多破坏细胞壁的完整性，而支原体恰恰没有细胞壁。这也就是支原体感染率高企的主要原因。曾有一位细胞培养专家戏称：“我可是支原体方面的专家，并不是因为我喜欢他们，而是 25-60%的细胞系都感染了支原体。 ”支原体总在偷偷地改变细胞，篡改我们的实验数据。怎么办？检测、检测、再检测对培
3、养物进行常规的支原体检测非常重要。尽管各个实验室的检测频率不同，从几个星期到几个月不等，不过这主要取决于你们实验室有多少人接触细胞，以及你们引进新细胞的频率。比如美国国立细胞培养中心（NCCC） ，它经常从其他实验室获得细胞培养物，就会对每个样品进行检测，并将它们隔离，直至最后证明无支原体污染。一般来说，每两三个月进行一次定期检测是必要的。如果有新细胞进入实验室，或准备将细胞进行液氮保存，都应该进行检测。当然，如果细胞不大对劲，应立马检测。检测频率是一方面，选择合适的检测方法也很重要。到底是 PCR、生化分析、ELISA 还是免疫荧光呢？PCR 应该算是检测支原体的理想方法，它综合了几个优势：
4、灵敏、特异、快速、廉价等。细胞培养上清可直接用来检测，非常方便。Sigma-Aldrich 公司的 LookOut Mycoplasma PCR Detection Kit，扩增的就是支原体基因组上 16S 核糖体 RNA 基因。此区域高度保守，因此可检测多达 19 种支原体。当然，为了避免假阳性和假阴性，实验中必须设立多种对照：阳性对照、阴性对照和内对照。如果电泳图上出现 259bp 的清晰条带，对不起，你中招了。以色列 Biological Industries（BioInd ）公司的 EZ-PCR Mycoplasma Test Kit 也能提供支原体的快速检测，引物与 Sigma 类似
5、，也是扩增 16S rRNA。这个试剂盒的灵敏度颇高，M. capricolum 的检测极限为 5.5 CFU/ml，M. hyorhinis 则为 10.5 CFU/ml。Stratagene 新的 MycoSensor QPCR Assay Kit 通过实时定量 PCR 的方法来检测最低 10 个拷贝的支原体，连跑胶的时间都省了，整个过程只需要 2 小时。阳性 PCR 产物的 Tm 值为85C，而内对照为 82C，通过熔解曲线分析能将两者区分开。另外， Stratagene 也提供了PCR 检测支原体的试剂盒。如果你对杂交过程得心应手，还可以选择 R&D 公司的 MycoProbe Myc
6、oplasma Detection Kit。它利用标记了碱性磷酸酶的寡核苷酸探针与 16S 核糖体 RNA 杂交，随后用显色底物就能了解支原体的存在。整个过程只需 4.5 小时，也还算快，能检测 8 种最常见的支原体。用 Hoechst 33258 染料检测支原体是很多教科书推荐的方法。由于支原体含有 DNA，能与Hoechst 33258 染料结合，在 500 倍放大情况下，表现为细小颗粒或纤毛染色。但操作过程较繁琐，且需要一定的经验来辨别支原体，新手可能不大容易掌握。特别值得一提的是：最近笔者尝试采用一种上海易色医疗科技有限公司生产的一步法恒温支原体检测试剂盒 ，其通过独特的滚环扩增技术，在一个温度下即可完成整个反应过程，而且整个检测过程一步即可完成，不需要电泳，肉眼直接判断反应结果，反应后反应管呈蓝绿色为阳性，粉红色则为阴性，非常方便快捷。耗时也非常少，只需 1 小时。据说其灵敏度比 PCR 灵敏 10-1000 倍，当然笔者没有具体去比较。大家可以去尝试一下。不过，预防支原体的最佳方法还是良好的细胞培养技巧和正确的态度。虽然这些都是老生常谈，但一旦熟悉了细胞培养，就很容易麻痹大意，时常敲敲警钟还是相当必要的。
