1、 研究用 Code No. RR036A 说明书 PrimeScript RT Master Mix (Perfect Real Time) v201412Da 目 录 内 容 页 码 制品说明 1 制品内容 1 试剂盒外必备材料 1 保 存 1 特 长 1 使用注意 2 操作方法 2 Real Time PCR 2 实验例 5 附录 5 关联产品 7 制品说明 本制品是 2 Step Real Time RT-PCR 用的最佳反转录反应试剂。 5 PrimeScript RT Master Mix 中含有定量 RT-PCR的 反转录反应所需的所有 试剂 （ PrimeScript RTase
2、、 RNase Inhibitor、 Random 6 mers、Oligo dT Primer、 dNTP Mixture、 反应 Buffer） ，加入模板 RNA 和水即可迅速进行反应。使用具有较强延伸能力的 PrimeScript RTase，与制品 PrimeScript RT reagent Kit（ Perfect Real Time）（ Code No.RR037A/B）相同，可以在较短时间内高效合成 Real Time PCR 用模板 cDNA。 本制品合成的 cDNA 可以用于 SYBR Green 分析法和 TaqMan 探针分析法，可以根据实验目的与SYBR Premi
3、x Ex Taq II (Tli RNaseH Plus) 和 Premix Ex Taq (Probe qPCR)等 定量 试剂配合使用，能够进行高性能的基因表达分析。 注意： Takara Bio 使用 SYBR Green I 作为研究试剂已得到 Molecular Probes Inc.的许可。 SYBR为 Molecular Probes Inc.的注册商标。 制品内容 （ 10 l反应 200次） 1. 5 PrimeScript RT Master Mix（ for Real Time） *1 400 l 2. RNase Free dH2O 1 ml 2 支 3. EASY D
4、ilution（ for Real Time PCR） *2 1 ml *1： 含有 PrimeScript RTase、 RNase Inhibitor、 Random 6 mers、 Oligo dT Primer、 dNTP Mixture、 反应 Buffer（含有 Mg2+） 。 *2：制作标准曲线时梯度稀释 cDNA 或 RNA 标准品的稀释液。模板 DNA 或 RNA 如果用水或 TE Buffer 稀释时，由于受 Microtube 吸附作用等的影响，往往不能准确地进行稀释，导致实验 结果精度降低。使用本制品时，即使稀释至低浓度也能够进行准确地稀释，容易在宽广范围 内获得准确定
5、量的标准曲线。 本制品不影响反转录和 PCR 反应，用其稀释后的样品可直接使 用。 EASY Dilution 也可以单独购买（ Code No.9160）。 注意： EASY Dilution 请与本公司 Real Time PCR 试剂组合使用，对于其他公司的 同类制品 的适用性本公司尚未进行确认。 试剂盒外必备材料 热循环仪（或 37水浴和 85加热块） 反转录反应所用 0.2 ml 和 1.5 ml 的微量 反应 管 微量移液器和枪头（高压灭菌） 保 存： -20。 特 长 1 制品为预先混好的 Premix 形式，只需加入模板 RNA 和水便可以开始反应。 2 可以在较短时间内高效合
6、成 Real Time PCR 用 cDNA，是进行 2 Step Real Time RT-PCR 反应的最佳试剂。 3 使用了 Random 6 mers 和 Oligo dT Primer 2 种反转录引物，可以合成最适的 Real Time PCR 用cDNA。 4 Real-time RT PCR 定量需要建立标准曲线，建立标准曲线的条件就是需要将总 RNA 和反转录 cDNA稀释到较低的浓度。 如果用水或 TE Buffer 稀释时，由于模板浓度低不稳定，因而会缩小曲线范围，结果精度降低。 本制品中附加了标准曲线制作用稀释液 EASY Dilution（ for Real Time
7、 PCR），将 Total RNA 或 cDNA 稀释至低浓度时也能够进行准确稀释，容易在宽广范围内获得准确定量的标准曲线。 -1- 使用注意 以下为使用本试剂盒时的注意事项，使用前一定认真阅读。 1 5 PrimeScript RT Master Mix 在使用 前要小心地离心收集到反应管底部。由于 5 PrimeScript RT Master Mix 粘度高，用移液枪慢慢反复吸打充分混匀后使用。 2 分装试剂时务必使用新的枪头（ Tip），以防止样品间污染。 3 本制品中已经加入了反转录 Primer（ Oligo dT Primer 和 Random 6 mers）， 如果要 使用 G
8、ene Specific Primer 进行反转录反应 ，则 不能使用本制品。 操作方法 反转录反应 RNA 的制备方法参见“附录”。 1. 按下列组份配制 RT 反应液（反应液配制请在冰上进行）。 试剂 使用量 终浓度 5 PrimeScript RT Master Mix（ Perfect Real Time） 2 l 1 Total RNA * RNase Free dH2O up to 10 l * 反应体系可按需求相应放大， 10 l 反应体系可最大使用 500 ng 的 Total RNA。 2. 轻柔混匀后进行 反转录反应 ， 条件如下 : 37 15 min（反转录反应） 85
9、 5 sec（反转录酶的失活反应） 4 注意： 得到的 RT 反应液加入到下一步的 Real Time PCR 反应体系中，其加入量不要超过 Real Time PCR 反应体积的 1/10（ V/V）量。 Real Time PCR 以下是使用本制品进行反转录反应后，选择 SYBR Premix Ex Taq II（ Tli RNaseH Plus）（ Code No. RR820A）进行 Real Time PCR 反应的操作方法。采用 TaqMan 探针法进行检测时，请选择 Premix Ex Taq（ Probe qPCR）（ Code No. RR390A）。 应用 Thermal
10、Cycler Dice Real Time System II 扩增仪的操作方法 1. 按下列组份配制 PCR 反应液（反应液配制请在冰上进行）。 试剂 使用量 终浓度 SYBR Premix Ex Taq II(Tli RNaseH Plus)（ 2） 12.5 l 1 PCR Forward Primer（ 10 M） 1.0 l 0.4 M*1 PCR Reverse Primer（ 10 M） 1.0 l 0.4 M*1 RT 反应液（ cDNA 溶液） 2 l*2 dH2O（灭菌蒸馏水） 8.5 l Total 25 l *1 通常引物终浓度为 0.4 M 可以得到较好结果。反应性能
11、较差时，可以在 0.2 1.0 M 范围内调整引物浓度。 *2 建议在 25 l 反应液中使用相当于 10 pg 100 ng Total RNA 量的 cDNA 为模板。反转录反应液的加入量不能超过 PCR 反应液总体积的 10%。 -2- 2. 进行 Real Time PCR 反应。 建议采用下列图表 显示的两步法 PCR 反应程序 。 如果该程序得不到良好的实验结果时，再进行 PCR条件的优化。 当 使用 Tm 值较低的引物或 两步法 PCR 反应扩增性能较差时，可以尝试进行三步法 PCR扩增反应。 两步法 PCR 扩增标准程序： Stage 1：预变性 Repeat： 1 95 30
12、 秒 Stage 2： PCR 反应 Repeat： 40 95 5 秒 60 30 60 秒 Stage 3： Dissociation 特别提示： 本制品中使用的 TaKaRa Ex Taq HS 是利用抗 Taq 抗体的 Hot Start 用 DNA 聚合酶，与其他公司的化学修饰型 Hot Start 用 DNA 聚合酶相比，不需要 PCR 反应前的 95、 5 15 分钟的酶的活性化反应。如果高温处理时间过长，会使酶的活性下降，其 PCR 的扩增效率、定量精度等都会受到影响。如果在 PCR 反应前进行模板的预变性，通常设定为 95、 30 秒。 3. 实验结果分析。 反 应结束后确认
13、 Real Time PCR 的扩增曲线和融解曲线 ， 进行 PCR 定量时制作标准曲线等。 分析方法参见仪器的操作手册。 应用 Applied Biosystems7300/7500/7500 Fast Real-Time PCR System 和 StepOnePlus Real-Time PCR System的操作方法 *请按照仪器使用说明书要求进行实验操作。 1. 按下列组份配制 PCR 反应液（反应液配制请在冰上进行）。 试剂 使用量 使用量 终浓度 SYBR Premix Ex Taq II(Tli RNaseH Plus)（ 2） 10 l 25 l 1 PCR Forward
14、Primer（ 10 M） 0.8 l 2 l 0.4 M*1 PCR Reverse Primer（ 10 M） 0.8 l 2 l 0.4 M*1 ROX Reference Dye or Dye II（ 50） *2 0.4 l 1 l 1 RT 反应液（ cDNA 溶液） *3 2 l 4 l dH2O（灭菌蒸馏水） 6 l 16 l Total 20 l*4 50 l*4 *1 通常引物终浓度为 0.4 M 可以得到较好结果。反应性能较差时，可以在 0.2 1.0 M 范围内调整引物浓度。 *2 ROX Reference Dye II（ 50）比 ROX Reference Dye
15、（ 50）浓度低，使用 7500 Real-Time PCR System 和 7500 Fast Real-Time PCR System时，请使用 ROX Reference Dye II（ 50）。使用 StepOnePlus Real-Time PCR System 和 7300 Real-Time PCR System 时，请使用ROX Reference Dye（ 50）。 -3- *3 建议在 20 l 反应液中使用相当于 10 pg 100 ng Total RNA 量的 cDNA 为模板。反转录反应液的加入量不能超过 PCR 反应液总体积的 10%。 *4 按不同仪器的要求确
16、定反应液的体积。 2. 进行 Real Time PCR 反应 建议采用下列图表显示的两步法 PCR 反应程序，如果该程序得不到良好的实验结果时，再进行 PCR条件的优化。 当使用 Tm 值较低的引 物或 两步法 PCR 反应扩增性能较差时，可以尝试进行三步法 PCR扩增反应。 两步法 PCR 扩增标准程序： Stage 1：预变性 Reps： 1 95 30 秒 Stage 2： PCR 反应 Reps： 40 95 5 秒 60 30 34 秒 * Dissociation Stage * 使用 StepOnePlus 时请设定在 30 秒。 使用 7300 时请设定在 31 秒。 使用
17、7500 时请设定在 34 秒。 两步法 PCR 扩增标准程序： Stage 1：预变性 Reps： 1 95 30 秒 Stage 2： PCR 反应 Reps： 40 95 3 秒 60 30 秒 Dissociation Stage 特别提示： 本制品中使用的 TaKaRa Ex Taq HS 是利用抗 Taq 抗体的 Hot Start 用 DNA 聚合酶，与其他公司的化学修饰型 Hot Start 用 DNA 聚合酶相比，不需要 PCR 反应前的 95、 5 15 分钟的酶的活性化反应。如果高温处理时间过长，会使酶的活性下降，其 PCR 的扩增效率、定量精度等都会受到影响。如果在 P
18、CR 反应前进行模板的预变性，通常设定为 95、 30 秒。 3. 实验结果分析 反应结束后确认 Real Time PCR 的扩增曲线和融解曲线，进行 PCR 定量时制作标准曲线等。 分析方法参见仪器的操作手册。 -4- 实验例 反转录反应时间和 cDNA合成量的研讨实验 方法 1. 反转录反应 试 剂： PrimeScript RT Master Mix（ Perfect Real Time） 模 板： Human Placenta Total RNA 2 pg 2 g 反应体积： 20 l 反应条件： 37 15、 30、 60 min 反应后 85 5 sec 热变性， 4保存 2.
19、Real Time PCR 反应 试 剂： SYBR Premix Ex Taq II（ Perfect Real Time） 模 板： 上述反转录反应液 2 l 反应体积： 25 l Target Gene： Human ACTB 反应条件： Thermal Cycler Dice Real Time System 标准反应条件 结果 Real Time PCR 扩增曲线图及标准曲线图如下： 扩增曲线图 标准曲线图 以上 Real Time RT-PCR 扩增结果显示，不同反转录反应时间（ 15、 30、 60 min）在宽广模板浓度范围内都可以得到同等的扩增效 率。 附 录 RNA样品制备
20、 本制品是将 RNA 反转录成 cDNA 的专用试剂。 RNA 的纯度会影响 cDNA 的合成量，而制备 RNA 的关键是要抑制细胞中的 RNA 分解酶和防止所用器具及试剂中的 RNA 分解酶的污染。因此，在实验中必须采 取以下措施：戴一次性干净手套；使用 RNA 操作专用实验台；在操作过程中避免讲话等等。通过以上办法可以防止实验者的汗液、唾液中的 RNA 分解酶的污染。 -5- 15 min（紫色） 30 min（红色） 60 min（ 黄色 ） 15 min（紫色） Rsq: 0.999 Eff 99 Y -3.346LOG（ X） +34.52 30 min（红色） Rsq: 1.000
21、 Eff 98.9 Y -3.349LOG（ X） +34.46 60 min（ 黄色 ） Rsq: 0.999 Eff 100.9 Y -3.301LOG（ X） +34.24 【 使用器具】 尽量使用一次性塑料器皿，若用玻璃器皿，应在使用前按下列（ 1）或者（ 2）方法进行处理。 (1) 干热灭菌（ 180 ， 60 min） (2) 用 0.1% DEPC（焦碳酸二乙酯）水溶液在 37下处理 12 小时。然后在 120下高压灭菌 30 分钟除 去残留的 DEPC。 RNA 实验用的器具和仪器建议专门使用，不要用于其它实验。 【试剂配制】 用于 RNA 实验的试剂，需使用干热灭菌（ 180
22、， 60 min）或用上述方法进行 DEPC 水处理灭菌后的玻璃容器盛装（也可使用 RNA 实验用的一次性塑料容器），使用的无菌水需用 0.1%的 DEPC 处理后进行高温高压灭菌。 RNA 实验用的试剂和无菌水都应专用，避免混用后交叉污染。 【制备方法】 使用 简单的 RNA 纯化方法即可获得满足于 RT-PCR 反应的 RNA（只需少量的 RNA 便可进行 RT-PCR反应）。但为了保证实验的成功率，建议使用 GTC 法（异硫氰酸胍法）制备的高纯度 RNA。 从培养细胞、组织中提取时，使用 RNAiso Plus（ Code No. 9108/9109） 。 纯化的 RNA 用灭菌蒸馏水或
23、灭菌的 TE 缓冲液溶解。 【 Total RNA 中混有基因组 DNA 的对策】 提取的 Total RNA 中常常混有基因组 DNA，而基因组 DNA 可以直接作为 PCR 模板进行扩增，造成解析结果不准确。为了避免这种情况发生， 我们必须采取如下两种措施： 1、引物设计时避免基因组 DNA 扩增； 2、使用 DNase I 处理除去基因组 DNA。 1、引物设计时避免基因组 DNA 扩增 我们可以利用基因组 DNA 具有外显子和内含子的结构，在引物设计上下工夫，使 PCR 反应时不能扩增基因组 DNA。此时我们首先应确认目的基因的基因组结构，选择较长的内含子。然后，在这个内含子两侧的外显
24、子上分别设计上、下游引物。 Real Time PCR 反应时通常扩增的目的 DNA 片段长度都比较短，设置的条件也是适合短片段 DNA 的扩增。所以，当内含子足够长时，基因组 DNA 来源的 扩增就不能发生；当内含子较短时，基因组 DNA 来源的扩增可能发生，但基因组 DNA 来源的扩增产物比 mRNA 来源的扩增产物长，可通过分析融解曲线的方法加以区分。但是，此种方法不适合具有单个外显子的基因、或者不具有内含子的生物种以及基因组情报没被解析的生物种等，此时必须采取 2、的方法解决。 2、使用 DNase I 处理除去基因组 DNA 使用常规方法提取 Total RNA 后，再使用 DNas
25、e I(RNase-free)(Code No.2270A)分解混入的基因组DNA，最后进行苯酚 /氯仿抽提、乙醇沉淀等纯化 Total RNA。 操作流程 按下列组份配制反应液。 试剂 使用量 Total RNA 20 50 g 10 DNase I Buffer 5 l RNase Inhibitor 20 U DNase I（ RNase-free） 2 l（ 10 U） DEPC 处理水 up to 50 l 37 20 min。 使用以下两种方法使 DNase I 失活。 A热处理 （ 1）加入 2.5 l 0.5 M EDTA 80 2 min。 （ 2）用 DEPC 处理水 定容
26、至 100 l。 -6- B苯酚 /氯仿抽提 （ 1）用 50 l DEPC 处理水 定容至 100 l 后加入等体积的苯酚 /氯仿 /异戊醇（ 25： 24： 1）混匀。 （ 2）室温， 15,000 rpm 5 min 离心，取上清。 （ 3）加入等体积的氯仿 /异戊醇（ 24： 1）混匀。 （ 4）室温， 15,000 rpm 5 min 离心，取上清。 加入 10 l 3 M 醋酸钠， 250 l 冷乙醇，冰上放置 10 min。 4， 15,000 rpm 15 min 离心，弃上清。 加入 70%冷乙醇洗净， 4， 15,000 rpm 5 min 离心，弃 上清。 沉淀干燥。 加
27、入适量 DEPC 处理水 溶解。 【基因组 DNA 确认方法】 不进行反转录反应，通过 Real Time PCR 确认基因组 DNA 混入量。此实验使用从基因组 DNA 和 mRNA中都能进行扩增的 Primer。 DNase I 处理后的基因组 DNA处理情况也可以通过此方法进行确认。另外，使用跨内含子对基因组 DNA 不能进行扩增的 Primer 也有扩增产物时，怀疑有伪基因存在，这种情况也可以用此方法进行确认。 关联产品 SYBR Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus) (Code No. RR820A/B) SYBR Premix Ex Taq (Tli
28、 RNaseH Plus) (Code No. RR420A/B) Premix Ex Taq (Probe qPCR) (Code No. RR390A) EASY Dilution (for Real Time PCR) (Code No. 9160) Thermal Cycler Dice Real Time System II (Code No. TP900/TP960) PrimeScript RT Reagent Kit (Perfect Real Time) (Code No. RR037A) PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser
29、 (Perfect Real Time) (Code No. RR047A/B) RNAiso Plus (Code No. 9108/9109) This document has been translated and prepared by Takara Biotechnology (Dalian) Co., Ltd. For the latest version of this document, please refer to the Takara Bio Inc. website. -7- Note This product is for research use only. It
30、 is not intended for use in therapeutic or diagnostic procedures for humans or animals. Also, do not use this product as food, cosmetic, or household item, etc. Takara products may not be resold or transferred, modified for resale or transfer, or used to manufacture commercial products without writt
31、en approval from TAKARA BIO INC. If you require licenses for other use, please contact us by phone at +81 77 543 7247 or from our website at www.takara-. Your use of this product is also subject to compliance with any applicable licensing requirements described on the product web page. It is your responsibility to review, understand and adhere to any restrictions imposed by such statements. All trademarks are the property of their respective owners. Certain trademarks may not be registered in all jurisdictions. 技术咨询热线： 0411-87641685， 87641686 4006518761， 4006518769 URL: http:/ v201412Da
