1、医学机能学实验设计大纲实验名称： 课题来源：自选设计班级： 设计人员： 设计日期： 指导老师： 基础医学实验教学示范中心2014 年制一、实验设计的目的意义：实验设计的目的意义，国内外研究现状，存在的问题，解决问题的思路。目的与意义:复制膀胱癌模型，利用直接采用药物灌注的的方法，比较研究盐酸米托蒽醌与卡介苗的治疗作用。本实验的目的即在于探讨盐酸米托蒽醌与卡介苗膀胱灌注预防肿瘤复发的疗效，为临床上治疗膀胱癌尤其在肿瘤复发方面提供一种新思路，具有十分重要的意义。国内外研究现状：膀胱癌是泌尿系统常见的恶性肿瘤之一，临床上可分为浅表型、侵袭型和转移型，每种类型的治疗方法完全不同。其中浅表型膀胱癌占70
2、 80 ，大多采用手术切除或经尿道电切术治疗，可以获得较好的近期疗效。但是术后35年内复发率高达60 90，且多在术后1年内复发 。膀胱内灌注是预防术后复发的最常用的手段，理想的膀胱内灌注药，应具有对肿瘤细胞敏感性高，能在膀胱粘膜上皮迅速达到有效药物浓度，毒副作用较轻的特点。目前，常用的灌注药物有羟基喜树碱、吡柔比星 、盐酸米托蒽醌、卡介苗等。羟基喜树碱、吡柔比星价格昂贵，而盐酸米托蒽醌与卡介苗价格低廉，适合我国大多数人群的经济状况。结合本实验的目的，即探讨盐酸米托蒽醌与卡介苗这两种膀胱灌注药物在预防膀胱癌复发疗效中的比较，看哪一种灌注药物更具有临床使用价值。存在的问题：目前市场上卡介苗主要是
3、一种用来预防儿童结核病的预防接种疫苗，接种后可使儿童产生对结核病的特殊抵抗力。目前国内外实验研究表明其在肿瘤治疗中也有一定良好的疗效。相关实验表明，相对分子质量超过 200 的物质易保留在膀胱内，盐酸米托蒽醌的相对分子质量为 44449，大分子量的盐酸米托蒽醌从膀胱吸收极少，减少了心脏毒性、骨髓抑制等副作用。但目前对于二者在预防膀胱癌复发疗效方面的效果比较还未见大量资料证明。解决问题的思路：用物理化学的方法对雌性 C57BL/6 小鼠膀胱粘膜表面进行处理,简便高效地建立小鼠正位表浅膀胱癌模型。对膀胱癌动物进行手术切除肿瘤之后分别行盐酸米托蒽醌与卡介苗膀胱灌注治疗，比较二者的疗效。 参考文献：1
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10、ntravesical therapy using bacillus CalmetteGuerin for superficial bladder cancerJ3Hinyokika Kiyo，2008，54(2)：127129二、实验设计方案（实验设计目标,拟解决的主要问题, 实验动物设计,实验专业设计，实验统计设计,实验方法设计，可行性分析,预期结果，实验设计工作时间安排） 。（一）实验设计目标，拟解决的关键问题设计目标：探讨盐酸米托蒽醌与卡介苗膀胱灌注预防肿瘤复发的疗效，为临床上治疗膀胱癌尤其在肿瘤复发方面提供一种新思路，从而探讨二者能否在临床治疗中成为较为理想的预防膀胱癌复发的膀胱灌注
11、药物。拟解决的关键问题：实验模型的制备、对不同试验药物进行灌注的分组与实验结果分析。（二）实验设计1、实验动物设计本实验选用雌性 C57BL/6 小鼠作为实验动物。选用小鼠作为实验动物，有以下优点：（1）小鼠生长速度快，繁殖能力高，大多用于安全性实验及营养与生长发育有关的研究。 （2）广泛用于药理，毒理药校等实验。 （3）小鼠平时表现温顺，其体积适中便于观察和解剖。 （4）C57BL/6 小鼠是肿瘤学、生理学、免疫学、遗传学研究中常用的品系，符合实验设计。2、实验专业设计选用雌性 C57BL/6 小鼠作为实验动物，手术切除肿瘤后分别给予盐酸米托蒽醌与卡介苗膀胱灌注，观察二者在预防膀胱癌复发中的
12、疗效。观察小鼠白细胞介素一2(IL 一 2)、肿瘤坏死因子(TNF)水平、膀胱癌复发情况等实验指标。3、实验统计设计实验统计设计中应始终贯彻随机、对照、重复三大原则。（1）随机：选取正常成年健康体重相近的雌性 C57BL/6 小鼠 90 只，将 90 只小组鼠按体重由小变大依次编号。具体方法：动物编号为 190 号，每实验小组30 只。三个实验小组分别设为 A、B、C 三组，其中 A 组膀胱灌注卡介苗，B 组膀胱灌注盐酸米托蒽醌，C 组为空白对照组不作处理。（2）对照：本组实验做了空白对照和实验对照，在前面的专业设计里已经提及。（3）重复：本实验采用的是每实验小组有 30 只小鼠，具有一定的重
13、复性。（4）统计数据收集：本实验搜集计量资料，初步确定对各组实验数据的比较分为实验值和基础值比较。表 1 尿液中 IL 一 2 和 TNF 水平比较( s) 灌 注 前 灌 注 后组别 IL-2(kU/L) TNF(ug/L)IL-2(kU/L)TNF(ug/L)A 组B 组C 组表 2 三组动物膀胱癌复发率和生存率比较n()组别 肿瘤复发率 小鼠生存率A 组（n30）B 组（n30）C 组（n30）（5）统计数据分析三组小鼠在年龄、性别、发育情况、健康状况等方面比较，差异无统计学意义(P005)，具有可比性。本实验也采用计量资料来测定各种指标的数值，所得数据采用平均数标准差（ s）表示，三组
14、间实验数据比较行完全随机单因素方差分析。四组间实验数据比较行完全随机单因素方差分析，如各组肺系数总体均值的比较，其方法如下：（1）建立检验假设H0： = = （各组肺系数总体均值相等） 。H1： 、 、 不等或123 123不全相等，0.05。（2）计算统计量统计学处理应用 SPSS 130 统计软件进行数据处理，计量资料采用 t 检验，计数资料采用 x2 检验，P005 为差异有统计学意义。( 3 ) 查 F 值表，确定 P 值，得出结论。 4、实验方法设计实验技术路线实验技术方法（1）随机抽样：随机选取雌性 C57BL/6 小鼠 90 只，并分别编号，再随机平分成三组，并称重。（2）实验分
15、组：实验分 A、B、C 三个小组。（3）模型复制：将雌性 C57BL/6 小鼠(6-8 周龄)经戊巴比妥钠麻醉后,用改造过的静脉留置针经小鼠尿道插入膀胱腔内,用酸(HCL)碱(NaOH)腐蚀的方法对小鼠膀胱粘膜预处理，用 PBS 冲洗 3 遍后将 0.1mLMB49(106 个)灌注入膀胱,留置导管 2 小时左右,构建小鼠正位表浅膀胱癌模型。（4）实验手术：所有小鼠观察一般情况(精神状态、饮食、体重等)和肿瘤生长情况(是否成瘤、肿瘤大小、有无血尿、远处转移等)。按计划切除小鼠膀胱内相A 组 C 组 雌性 C57BL/6 小鼠手术切除肿瘤卡介苗膀胱灌注 盐酸米托蒽醌膀胱灌注手术切除肿瘤 手术切除
16、肿瘤不作处理B 组酸碱腐蚀的方法处理膀胱粘膜，构建动物模型酸碱腐蚀的方法处理膀胱粘膜，构建动物模型酸碱腐蚀的方法处理膀胱粘膜，构建实验动物模型应肿瘤。（5）处理措施：对切除膀胱内肿瘤的小鼠分别进行盐酸米托蒽醌与卡介苗膀胱灌注，其中 A 组膀胱灌注卡介苗，B 组膀胱灌注盐酸米托蒽醌，C 组为空白对照组不作处理。术后 2d 起行膀胱灌注，每天 1 次，持续灌注 1 周。灌注前对小鼠禁水 12 h 并放置尿管，排尽尿液后进行灌注。盐酸米托蒽醌组：盐酸米托蒽醌 12 mg+生理盐水 4OmL，经导尿管注入膀胱。卡介苗组：每次生理盐水 50 mL+卡介苗120 mg。要求每 15 min 改变小鼠体位
17、1 次，按顺序仰卧位、左侧卧位、俯卧位、右侧卧位共 2 次 min；使药物和膀胱各壁充分接触，要求药液在膀胱内存留 2 h 以上方可拔出导尿管或排尿。（三）可行性分析:1 小鼠易得到，容易饲养，在科研工作中被广泛利用。且本实验中建立的动物模型其生物学特性与人的膀胱肿瘤生物学特性极为相似,是浅表性膀胱癌防治研究尤其是经尿道治疗和(或)免疫治疗研究中理想的动物模型。2、常用的灌注药物一般价格昂贵，而盐酸米托蒽醌与卡介苗价格低廉，可从市场上购买。3、手术器材和设备均为实验室常用，手术方法我们也相对熟练。（四）预期效果:1、盐酸米托蒽醌及卡介苗均能有效预防膀胱癌术后复发。2、盐酸米托蒽醌膀胱灌注较卡介苗操作简单，不良反应小，是一种安全有效的膀胱局部化疗药物。3、盐酸米托蒽醌可以考虑作为临床上膀胱癌手术切除后防止复发的首选药物。（五）实验设计工作时间安排:1、前期制模和手术及药物处理共计用时 10 天2、后期观察和数据整理共计用时 2 天3、总共实验耗时 12 天完成。三、完成实验的条件1、仪器设备情况：常用手术器械、注射器、导尿管、静脉留置针2、实验动物情况:健康的雌性 C57BL/6 小鼠 90 只。3、 药品试剂来源：盐酸米托蒽醌、卡介苗、生理盐水、HCL、NaOH、PBS、戊巴比妥钠
