1、第三章 基因工程的载体,前言 载体通论 第一节 质粒载体 第二节 噬菌体载体 第三节 单链丝状噬菌体载体,本课件是在网络资源基础上改进而成，在此对有关人士特致感谢！,前言 载体通论,一、基本概念利用重组DNA技术分离目的基因，称之为基因克隆(gene cloning)。 克隆(clone)：作物动词时是指从单一祖先产生同一的DNA分子群体或细胞群体的过程，作名词时指从一个共同祖先无性繁殖下来的一群遗传上同一的DNA分子、细胞或个体所组成的特殊群体。 基因文库(gene library)：由大量的含有基因组DNA的不同DNA片段的克隆所构成的群体。 载体(vector)：在基因工程中，携带着目的
2、基因或DNA片段进入宿主细胞进行扩增或表达的工具DNA分子。,二、分类克隆载体表达载体质粒载体噬菌体载体人工染色体,按载体功能分,按载体性质分,三、基因工程载体必须具备的条件：（1）有复制起点（2）具有若干个限制性内切酶的单一识别位点（3）具备合适的筛选标记（4）具备合适的拷贝数目（5）分子量要相对较小（6）在细胞内稳定性要高（7）易分离纯化 表示载体必须具备的条件,第一节 质粒载体,一、质粒(plasmid)的基本特性Plasmid 独立于细菌染色体外的双链环DNA分子。,质粒是细菌染色体外能自主复制的环形双链DNA分子。质粒DNA多呈超螺旋的共价闭合环状DNA (covalently cl
3、osed circular, cccDNA)，大小为1-200kb，可以持续稳定地处于游离状态，但一定条件下又会可逆地整合到寄主染色体上，随染色体复制而复制。 编码抗菌素抗性基因的质粒叫R质粒。质粒DNA在添加真核复制信号和启动子后，可以构建出能在原核和真核细胞中均可复制的穿梭质粒，并在真核细胞中表达，因此应用广泛。 1、质粒的复制：由复制子(ori，复制起始区及与此相关的顺式作用元件)决定。质粒复制的机理请见教材。 2、质粒的拷贝数：根据每个寄主细胞中质粒拷贝数的多少，把质粒分为严紧型复制质粒（拷贝数少，为1-5个）与松弛型复制质粒（拷贝数多，可达10-200个拷贝）。作为载体的质粒一般应该
4、是松弛型的。拷贝数是由复制起始点的类型决定的，如pMB1或ColE1。pUC系列载体中的突变型pMB1复制子可达500-700个拷贝。,3、质粒的不亲和性(incompatibility)：两种亲缘关系密切的不同质粒，不能够在同一个寄主细胞系中稳定地共存的现象。涉及细胞分裂过程中的竞争性选择。不相容群。 4、质粒的转移性：自然条件下质粒可通过细菌的接合(conjugation)的作用而转移到新的宿主细胞中。三亲杂交法。 质粒载体应具备的条件： 1 有特定的复制起始子。 2 有多种限制性内切酶切点，但每种切口最好只有 1个； 3 有选择标记，例如抗药性标记，蓝白斑试验； 4 有一定容量； 5 有
5、相当的拷贝数， 即每个宿主菌可能容纳的最多数。,2019/4/23,西南大学生物技术专业 基因工程,9,二、标记基因 1、选择标记基因：用于鉴别目的DNA的存在，将成功转化了载体的宿主挑选出来。 Ampr（氨苄青霉素抗性基因）：水解-内酰胺环。 Tetr（四环素抗性基因）：阻止四环素进入细胞。 Cmr（氯霉素抗性基因）：编码氯霉素乙酰转移酶。 Kanr（卡那霉素抗性基因）：编码氨基糖苷磷酸转移酶。 supF（琥珀突变抑制基因）：编码细菌抑制性tRNA，可翻译UAG为酪氨酸。赭石突变（UAA），乳白突变（UGA）。 正向选择标记：蔗糖致死基因sacB。,2019/4/23,西南大学生物技术专业
6、基因工程,10,2、筛选标记基因：用于将重组子与非重子区别开来。 -互补 ( complementation)：人工突变使大肠杆菌的-半乳糖苷酶基因(lacZ)缺失N-端的第11-41位氨基酸，而载体则携带有LacZ基因的N-端140个氨基酸和编码区段(lacZ)，二者单独存在时均无功能，但共存于一个大肠杆菌细胞时则发生功能互补，形成具有完全活性的LacZ酶。 多克隆位点(multiple cloning site)：载体上的一段人工设计和人工合成的DNA序列，含有多个在该载体唯一的限制性内切酶的切点，以方便载体与外源片段的重组。 插入失活(insretional inactivation)：
7、当一段足够长的外源DNA片段插入到一个功能基因的编码区后，导致ORF移码或提前终止，严重破坏原基因的编码能力而使该基因失活。 蓝白斑筛选(white-blue screening)：空载体转化子经IPTG诱导表达后，由于-互补而形成的功能性的LacZ蛋白，能够转化无色底物X-gal而形成深蓝色的产物，使菌落或噬菌斑显蓝色(蓝斑)；重组载体的转化子中，由于lacZ基因的插入失活而不能形成-互补，在IPTG+X-gal条件下菌落或噬菌斑不显蓝色(白斑) ；通过菌落或噬菌斑的蓝/白色差异而达到筛选鉴定出重组子与非重组子的目的。,三、质粒载体的种类 质粒的发展阶段第一阶段（1977年前）：天然质粒和重
8、组质粒的利用，如pSC101、ColE1、pCR、pBR313和pBR322。第二阶段：增大载体容量（降低载体长度），建立多克隆位点区和新的遗传标记基因。如pUC系 列载体。第三阶段：完善载体功能以满足基因工程克隆中的不同要求，如M13mp系列载体，含T3、T7、SP6启动子载体，表达型载体及各种探针型载体。,1、克隆载体 1）pBR322pBR322为4.36kb的环状双链DNA，其碱基序列已经全部清楚。是最早应用于基因工程的载体之一。把pBR322用限制性内切酶切去某片段，换上合用的表达组件，就可以构建成工作所需的新载体。许多实用的质粒载体都是在pBR322的基础上改建而成。可见其原型质粒
9、在使用上有优点。有过百个限制性内切酶切点，一种限制性内切酶只有单一切口的位点也多达数十个，几乎具备了所有常用限制酶都能切开并插入目的基因的优越条件。有两个抗药性基因（Ampr和Tetr）.此外，pBR322 DNA被限制性内切酶消化后产生的片段大小均已知道，可以作为核酸电泳的分子质量标准。,普通型载体pBR322的结构图,插入失活法,以pBR322为基础的重组子筛选方法,2）pUC18/pUC19质粒系列pUC质粒系列是在pBR322基础上改建成的。它含有pBR322的大部分，包括完整的Ampr基因和复制起始点。去除了pBR322的 tetr区段，换用了M13噬菌体的476bp片段，含LacZ
10、基因及其启动子的操纵基因、M13的多聚接头polylinker。pUC18与pUC19只是多克隆位点的排列方向相反，其余一致。,476bp片段含有E. coli的LacZ基 因的 5序列，表达半乳糖苷酶的片段。LacZ的上游包括乳糖操纵子上的启动子Plac和操纵基因O。LacZ之内是M13的克隆位点。,三个显著特点：（1）分子量更小，仅为2.7 kB，容纳外源DNA量增大；具有更高的拷贝数（每个细胞含500-700个拷贝）。（2）含易于检测是否有外源DNA插入的标记基因LacZ ，可利用-互补原理进行蓝白斑筛选。（3）多克隆位点区（multiple cloning site, MCS）由人工合
11、成的多个单一酶切位点构成。其MCS区与M13mp噬菌体载体的相同，可使pUC上克隆的目的基因直接转移到M13mp载体，进行DNA测序和体外突变等研究。,2019/4/23,西南大学生物技术专业 基因工程,21,3）pUC118/pUC119质粒系列 在pUC18/pUC19质粒基础上，增加了带有M13噬菌体DNA合成的起始和终止以及包装进入噬菌体颗粒所必需的顺式序列，也称为噬菌粒。 4）pGEM-3Z/4Z质粒系列 在pUC18/pUC19质粒基础上，在多克隆位点两端添加了噬菌体的转录启动子，可用于体外转录和翻译。 5）多功能质粒载体 典型的为pBluescript KS()、pBluescr
12、ipt SK ()，具有多克隆位点、-互补、噬菌体启动子、单链噬体的复制与包装信号等。K = Kpn，S = Sac,2019/4/23,西南大学生物技术专业 基因工程,22,2、表达载体 一般是在克隆的载体上添加和完善了用于外源基因表达的一些基本元件，如强启动子、蛋白纯化标签、信号肽、诱导表达元件等。 如Novagen的pET系列、Qiagen的pQE系列。 以后有详讲解。,第二节 噬菌体载体,一、噬菌体的分子生物学 噬菌体的组成结构和用途噬菌体是比细菌还小得多的微生物，和病毒侵犯真核细胞一样，噬菌体侵犯细菌，也可以认为它是细菌里的“寄生虫”。它本身是一种核蛋白，核心是一段DNA，结构上有一
13、个蛋白质外壳和尾巴，尾巴上的微丝可以把噬菌体的DNA注入细菌内。,噬菌体为线性双链DNA的细菌病毒，具有互补的12bp粘性末端，感染细菌后粘端互补成双链环状。全长48531bp，含50多个基因。,噬菌体基因大致分为4个区： 结构区：AJ 19个基因，编码头、尾部蛋白质为结构区。组区att(attachment)、int(intagrate)及xis(excission)。调控区启动子、终止子和N、CI基因。裂解区：Q-R。,2019/4/23,西南大学生物技术专业 基因工程,26,噬菌体可以容纳较大的目的基因。例如用置换法可去掉长达20kb的DNA，换入相应长度的目的基因。基因文库构建常使用载
14、体。不少先进的质粒应用组件进行构建。 二、载体的选择标记 1、基因组大小：原基因组的75-105%大小时可以包装，否则不能包装。 2、LacZ基因：象质粒一样进行蓝白斑筛选。 3、c基因失活：该基因表达时促进进入溶原状态，该基因失活后促进进入裂解状态。,三、代表性的载体 1、插入型载体：如gt10、gt11、gem-2/4、ZAP、ExCell等，一般采用单一切点将切开，插入外源DNA，容量只有0-11kb，主要用于cDNA文库构建、表达融合蛋白、合成探针等。 2、置换型载体：的中间裂解生长的非必须区段可以用外源DNA替代，形成填充区段，因此允许的外源DNA可达到9-23kb，代表性载体有EM
15、BL3/4、2001、DASH、FIX、GEM-11等，主要用于构建基因组DNA文库。,2019/4/23,西南大学生物技术专业 基因工程,28,四、载体的克隆原理和步骤 1、通过裂解过程增殖载体。 2、载体与外源DNA的酶切。载体一般要纯化左路、右臂，并进行去磷酸化处理。 3、外源DNA与载体的连接，形成的是多联体。 4、重组噬菌体的体外包装，需要单独制备衣壳蛋白，包装过程对DNA大小有选择性。 5、包装后的噬菌体颗粒感染大肠杆菌，经过的复制、包装和裂解过程，重组载体得到扩增，一个的感染和扩增会导致它周围一圈范围内的大肠杆菌被溶解，形成透明的溶菌圈/噬菌斑(plaque)。 6、筛选。每个噬
16、菌斑代表了一个重组，所有噬菌斑的集合就为一个文库。 pfu: plaque forming unit，噬菌斑形成单位，指每微克包装DNA感染大肠杆菌后形成的噬菌斑数，要求100万以上。,2019/4/23,西南大学生物技术专业 基因工程,29,第三节 单链丝状噬菌体载体,一、M13噬菌体载体M13噬菌体属丝状噬菌体，其基因组为闭合环状正链ssDNA，6407bp，其中90%的DNA都编码蛋白质，有10个基因，有两个较长的间隔区，是外源基因插入的部位。 M13噬菌体产生单双链DNA的机制。 1、以(+)链DNA为摸板，合成互补()链，该双链称复制型DNA（RFDNA）。 2、RFDNA在宿主细胞
17、内能快速增殖，达每个细胞约200个拷贝。 3、单链特异的DNA结合蛋白结合在(+)链上，从而阻断了其互补链，即()链的合成，这样，细胞就会不断的合成(+)链DNA 。,2019/4/23,西南大学生物技术专业 基因工程,30,+,+,-,+,-,+,-,+,-,+,-,+,-,单链结合蛋白,RF型DNA,复制约200拷贝,+,+,+,+,+,以-链DNA为模板合成+链DNA,2019/4/23,西南大学生物技术专业 基因工程,31,4、游离出来的(+)链DNA先与基因V的编码产物形成特异的DNA-蛋白质复合物，然后转移到寄主细胞膜，同时基因V的蛋白质从(+) DNA链上脱落下来，余下的M13
18、(+)链DNA则是从其感染的寄主细胞的细胞膜溢出的过程中，被外壳蛋白包装成病毒颗粒的。 二和三：略 四、丝状噬菌体载体的用途和问题 用途：制备单链DNA，用作探针、测序等。 问题：外源DNA的部分缺失、外源DNA的单方向插入等。,2019/4/23,西南大学生物技术专业 基因工程,32,五、噬菌粒 噬菌粒实际上是带有噬菌体大间隔区的质粒载体，是集质粒和丝状噬菌体的有利特征于一身的载体，具有ColE1复制起点及抗生素抗性选择标记，以及丝状噬菌体的间隔区。 可以象质粒一样增殖，而细菌被M13（f1）感染后质粒启动滚环复制，产生质粒DNA一条链的拷贝，最终包装在子代噬菌体颗粒中。 pUC118和pUC119，pBluescript SK()和pBluescript KS ()等。 特征：双链DNA稳定、高产，有常规质粒特征；克隆操作简单；可插入的外源DNA可长达10kb。 随着PCR技术的广泛应用，许多由丝状噬菌体载体完成的工作现在已由PCR可以取代。,
