1、一、杂交前准备 （一）DEPC 水是经 DEPC 处理过的灭菌蒸馏水。DEPC 即二乙基焦碳酸酯（diethylprocarbonate），可灭活各种蛋白质，是RNA 酶的强抑制剂。原位杂交在杂交及其以前的各步处理中，所有液体试剂都应经 DEPC 处理。方法是：取市售 DEPc 1ml，加入 1L 待处理水（蒸馏水等）中，经猛烈振摇后，于室温静止数小时，然后高压灭菌，以除去降解 DEPC（DEPC 分解为 CO2 和乙醇）。有些试剂可直接加入 DEPC，终浓度一般为 0.1%0.4% ，原则上在杂交及其以前的步骤中，所有液体试剂均需用 DEPC 处理，或用 DEPC 水配制，包括乙醇的稀释。此
2、外，接触标本以及标本有关的空中的洗涤也需 DEPC 水洗涤。注意：DEPC 是一种潜在的致癌物质，在操作中应尽量在通风的条件下进行，并避免接触皮肤。含有 Tris 缓冲液的溶液中，不能加入 DEPC。（二）载玻片的处理组织原位杂交，常在载玻片上进行，故载玻片的洗涤至关重要，必须保持清洁，并且不能有任何核酸的污染。处理方法如下：（1）先经洗衣粉浸泡过夜，次日自来水冲洗后，泡酸数小时以上，取出后再用流水冲洗，双蒸水冲洗 23 次，置 160以上烤箱中烧烤 4h 以上，或经 15 磅高压灭菌 20min。经以上处理可清除载片上的核酸酶。（2）HCl 处理法（三）硅化【方法】 （1）将一扎新的盖玻片散
3、开，在通风条件下于 0.1mol/L 的 HCI 中煮 20min,等其冷却后,倒掉盐酸。（2）用去离子水沉漂洗玻片，竖放在架子上自然干燥。（3）硅化盖玻片：通风条件下，将单块的盖玻片在二甲二氯硅浣（dimethyldichorsilane,DMDC）液中浸几下，竖入在架子上干燥。（4）收集干燥的盖玻片于一可耐热的 petri 氏盘（或培养皿）中，用去离子水漂洗数次，彻底清洗。（5）用铝箔将装有盖玻片的培养皿包好，于 180烘烤 4h 过夜。取出待冷至室温后，即可进行后续处理。附：2%DMDC配制：按比例两者充分混匀，静止待气泡消失即可使用。用途：硅化玻片（载片、盖片均可） 。【方法 2】将经
4、过洗净的玻璃盖片分散开放在一金属网中，并将该网放入一接有真空泵的干燥器中。同时，在干燥器中放一盛有约 1m 二甲二氯硅浣（dimethyldiorosilane,DMDC）的小烧杯。盖好干燥器（确保密闭） ，抽真空约5min，然后让空气冲入。取出盛有盖片的金属网架，用锡箔纸包埋，于 250以上烘烤 4h 以上，最好过夜。冷却后备用。 医学.全. 在线 .网. 站.提供本法可用于玻璃及塑料器皿的硅化。塑料器皿只能于 60烧干。【方法 3】APES（氨丙基三乙氧基硅浣）法【方法 4】（1）49ml 氯仿与 1mg 二甲二氯硅浣（DMDC）配液；（2）倒入每个拟硅化的试管或离心管中，浸泡 5min
5、后用乙醇或重蒸水冲洗；（3）玻璃器皿使用前位于 180以上烘烤 2h 以上，塑料器皿应于 60烘烤过夜。注意：DMDC 有毒且高度挥发，应于通风环境操作并戴口罩、手套，避免接触皮肤或吸入。（四）载片的包被（粘贴）沾附剂（1）多聚赖氨酸(poly-L-Lycine,PLL)储备液（05% ）按上述剂量充分混合，即为浓度为 5mg/ml(0.5%)的 PLL 液。常分装成 1ml 的包装，-20存放。该液为储备液，可反复冻融，无明显影响。用前充分混合。工作液（0.01%）：充分混合，静止待气泡消失。（2）明胶液配法：先称取明胶溶于 500800ml DEPC 水中，加热搅拌助溶，待明胶完全溶解以后
6、，加入甲明矾溶解后即可使用。注意，包被玻片时，明胶液温度最好保持在 60左右，效果最佳。方法同 PLL 包被玻片。2多聚赖氨酸包被玻片的制备方法（其它包被剂相同）（1）将事先准备好的经 160以上烘烤，并冷却至室温的玻片（载片或盖片） ，在 0.05%（也有用 0.1%）的 PLL 液中上下浸蘸几下，分散开竖放在架子上，于空气中自然干燥，4备用。注意：浸蘸时，务必使整个玻片完全浸于液体中，否则，包被不完全会产生标本脱落现象；干燥过程中注意避免尘埃污染；按上法处理的玻片通常可存放在一定时间（室温 1 月以上，4 更长） ，但仍建议尽早使用。（2）多聚赖氨酸 1mg 溶于 10ml 灭菌的去离子水
7、或 1mmol/L 的 Tris-HCl缓冲液中（pH7.0） ，将其涂布于玻片上，待干燥后即可使用。该法包被的玻片可用于细胞涂片和切片。（3）将 PLL 工作液滴至盖玻片上 5l/片，用另一盖玻片以推血涂片方法推片，或用另一盖玻片紧贴于其上，相互磨擦以使两盖玻片相对的一面涂布上PLL。该法制备的玻片，只有一面是包被有 PLL，故制备时，待其晾干后，应作好记号，然后保存后备用。多聚赖氨酸可用于多种核酸杂交，方法简单，结果可靠，有许多其它方法不可比拟的优点。配制好的液体可存放于 4或室温，但时间过长会解聚而失效，故建议使用时尽量新鲜配制。（4）Vectabond 粘附剂该试剂是 Vector 公
8、司新近推出的一种新型粘附剂。它与其它粘附剂的主要区别是：一般的粘附剂是通过物理性覆盖在玻片表面，天长日久，可能由于包被不完全或局部脱落而致切片等标本易于脱落。而 Vectabond 试剂是通过化学性作用，改变玻璃表面的分子结构，使标本贴附牢固，不易脱落，且保持时间长久，耗量小，价格便宜，一个包装 7ml 可配成 350ml 工作液使用。操作程序：标本（铺片、切片等）丙酮（5min）Vectabond 试剂工作液（5min ）dH2O(25min)干燥（温箱，数小时过夜） 用铝箔包好，室温备用。注意：制备和保存过程中避免污染。经上述处理的载玻片一般可存放半年以上（4可更长） 。（五）硅鱼精子 D
9、NA 的制备（1）在 50ml 灭菌聚乙烯管中加入 1g 鲑精 DNA，加入 15ml DEPC 水使其浸泡 5min 至 2h；（2）加入 2.5ml 2mol/L HCl，室温放置，DNA 形成白色沉淀，充分振摇至沉淀物相互缠绕在一起，用吸头尖端使之形成一球团状（23min） ；（3）加入 5.0ml 2mol/L 的 NaOH。摇动小管使 DNA 悬浮、溶解，将小管置 5015min 助溶；（4）用 DEPC 水将混合物稀释至 175ml（总体积） ，充分混合，注意确保管内已无颗粒状；（5）加入 20ml/l 1mol/L 的 Tris-HCl 缓冲液（pH7.4） ；（6）用 2mol
10、/L 的 HCl 滴定至 DNA 溶解 pH 为 7.07.5；（7）用无菌微孔滤膜过滤液体，去除颗粒。260nm 测定溶液的 OD 值，方法是：取 20l DNA 液混合于 980l 水中，混匀后测定，吸收值乘以 50 即为DNA 浓度（ g/ml） ；（8）制备好的 DNA 液储于-20备用，用前取出冻融后煮沸二、关于探针的标记（一）cRNA 探针的同位素标记1标记液（转录标记）2转录缓冲液：用地高辛或生物素标记时，用 UTP 替代。3标记终止液4标记探针水解液先用 dH2O 悬浮探针，再加入后两种试剂，轻轻振摇混合，于 60条件下反应。5探针水解时间注：LO探针初始长度（kb）Lf探针的
11、终长度（ kb）K0.11kb/min6探针水解终止液每次加入充分混合，临用前配。7探针沉淀液每次加入，充分混合，新鲜配制。（二）寡聚核苷酸 3端标记（cRNA 探针）1标记反应液2终止液：0.2mol/L EDTA3.探针沉淀液（三）cRNA 探针非同位素标记（地高辛及生物素）1标记液：生物素标记时为 10mmol/L 的生物素-11-UTP：为检测标记率而加。2转录标记终止液（1）0.2mol/L EDTA：用于地高辛标记法（2）生物素标记终止液（四）DNA 探针标记常用试剂的配制（1）10 缺口平移缓冲液：200mmol/l Tris-HCl,pH7.4 含 50mmol/L MgCl2
12、;100mmol/L-巯基乙醇、1mg/ml BSA。（2）缺口平移反应终止液：200mmol/L NaCl;10mmol/l Tris-HCl,pH7.4; 11mmol/L EDTA; 0.5% SDS。（3）DNase:干粉状 DNase(20003000u/mg)溶于 20mmol/l Tris-HCl, pH7.5 中（1mg/ml）,10l 分装，-20保存一年。（4）10DNA 聚合酶（Klenow 片段）缓冲液：500mmol/l Tris-HCl,pH6.6;100mmol/L MgCl 2;10mmol/L DTT;0.5mg BSA。（5）10激酶缓冲液：500mmol/
13、L Tris-HCl,pH7.4,50mmol/L MgCl2;20mmol/L DTT; 1.0mmol/L 亚精胺。（6）10随机引物标记缓冲液；500mmol/l Tris-HCl,pH6.6;100mmol/L MgCl2;10mmol/L -巯基乙醇；500g/ml BSA。（7）1加尾缓冲液：100mmol/L 二甲胂化钾，pH7.0,1mmol/l CoCl 2 0.2mmol/L DTT。（8）1mol/L MgCl 2:MgCl2 47.60g 溶于 500ml 水中，100ml 分装，高压灭菌，室温保存。（9）0.25mol/L EDTA(Ph8.0):EDTA 52.02
14、g 溶于 400ml 水中，调 pH 至8.0，加水至 500ml，100ml 分装，高压灭菌，室温保存。（10）4mol/L 醋酸钠：取无水醋酸钠 82g 溶于 200ml 水中，用醋酸调 pH至 6.5，加水至 250ml，高压灭菌，或 0.45m 膜过滤，室温保存。（11）10% SDS：10g SDS（十二烷基硫酸钠）溶于 50ml 水中，加水至100ml，分装后室温保存。（12）20SSC：取 NaCl 175.3g;柠檬酸钠 88.2g;加水至 1000ml，用10mol/l NaOH 调 pH 至 7.0；高压灭菌，室温保存。（13）无菌水：100ml 去离子水或双蒸水，分装，高
15、压灭菌，室温保存，开瓶后仅限一周使用。（14）10激酶缓冲液：500mmol/L Tris-HCl,pH7.4;100mmol/L MgCl2;50mmol/l DTT;10mmol/L 亚精胺（非必需）。（15）T 4多聚核苷酸激酶：10u/l，保存在甘油中，-20。（16）TE 缓冲液（Tris/EDTA）：Tris,10mmol/l pH7.4(0.5ml 2mol/L 贮存液)，1.0mmol/l EDTA,pH8.0(20l 0.5mol/L)贮存液，加水至 100ml，室温保存。（17）2mol/L Tris-HCl pH7.4:Tris242.2g 溶于 850ml，加浓 HCl
16、 75ml ,边加边缓慢搅动，至 pH7.4,于加水至 1000ml。（18）1mol/L DTT(二硫苏糖醇)：3.0g DTT 溶于 20ml 水中，分装，于-20贮存。（19）0.5mol/L EDTA（乙二胺四乙酸二钠盐）：在烧杯中先加入 300ml水，加入 93.5g EDTANa 22H2O,充分混匀，加 10mol/l NaOH 调 pH 至 8.0,加水至 500ml。（20）10mol/L NaOH：200g NaOH 溶于 450ml 水中，混匀，再加水至500ml。（21）5mol/L NaCl：292.25g NaCl,加水至 1000ml。（22）1mol/L HCl
17、：加 86.2ml 浓盐酸至 913.8ml 水中。（23）1mol/L CaCl 2：147g CaCl 2：2H 2O,溶于 1000ml 水中,高压灭菌,室温保存。三、固定剂进行原位杂交的组织或细胞标本常需经固定处理。尽管许多化学物质对组织/细胞有固定作用，但核酸原位杂交的理想固定液应具备如下特点：能很好地保持组织细胞的状态；对核酸无抽提、修饰及降解作用；不改变被检核酸分子在组织细胞内的定位；对核酸及探针的杂交过程无阻碍作用；固定液本身对杂交信号无遮蔽、掩盖作用，如不使本底增加等；理化性质稳定、价格低廉。14%多聚甲醛（Paraformaldehyde,PFA）配法：称取 40g PFA
18、 溶于装有 500ml DEPC 水的玻璃容器（烧杯或烧瓶）中，持续加热磁力搅拌至 6065，使成乳白色悬液。用 1.0mol/L 的 NaOH 值至 7.0，使呈清亮状（滴加） ，再加入约 500ml 2PBS，充分混匀（在冰浴或冷水浴中） ，可再检测一下pH，过滤后定容至 1000ml，室温或 4保存备用。注意：配制时应在通风条件下操作，并避免接触皮肤和吸入（戴手套及口罩） ，因 PFA 有较强的固定作用及毒性，对粘膜及皮肤有固定及毒性，刺激作用；加热时，温度不宜过高，常为 6065，否则，PFA 降解失效；配制好的 PFA 虽可存放一定时间，但过久的液体，固定效果下降，建议尽早使用。附：
19、固定液用 PBS 的配制：配法：按上述比例称取试剂，溶于 DEPC 水（也可用蒸馏水加 DEPC）500800ml中，过滤后，加水定容至 1000ml，高压灭菌。通常配制成 10PBS 的储备液，2PBS 和1PBS 可用 DEPC 水稀释获得。除用 DEPC 水配制 PFA 外，也有用灭菌蒸馏水或经 DEPC 处理的 0.010.1mol/L的 PBS 配制的，方法及注意事项同上。4% PFA 是目前原位杂交组织化学技术中最常用的固定液，它能较好地保持组织及细胞内的 RNA，同时对形态保持也较好。通常组织块固定 412h，载片固定时间在1015min 以内，RNA 含量较为恒定。过度延长固定
20、时间会引起细胞内生物大分子的过度交联，影响探针的穿透力，降低杂交效率。2甲醛10%甲醛（Formaldehyde,FA）量取二者充分混合而可。较适于检测 RNA 的组织及细胞固定，也可用于新鲜冰片切片后固定。10%福尔马林试剂：较适于固定细胞。10%中性福尔马林市售甲醛 100mlNa2HPO4 4gNaH2PO4 6.5gDEPC 水 1000ml常用于石蜡样品切片的固定。10%的甲醛由于有促进 DNA 双链分子交联的作用，干扰 DNA 变性，故不适于DNA 杂交。在组织或细胞原位杂交中，可通过使用含 50%甲酰胺的杂交液使 DNA 变性解链而解决。这类固定液在 DNA/RNA 杂交中有较好
21、的效果。34%戊二醛效果较 40%差。40.1%戊二醛常用于固定组织，适于新鲜组织冰冻切片及石蜡切片的后固定，常用于检测 DNA 的原位组织杂交方法。5乙醇/醋酸（或冰醋酸）将乙醇与醋酸按 3：1 的体积比充分混合即可。该液较适于固定细胞的原位杂交，尤其检测 DNA 时。乙醇/醋酸虽广泛应用于原位杂交中，但 RNA 保留较差，可本底很低，即背景染色淡。6甲醇/醋酸（3：1）用前按体积比 3：1 比例充分混合即可。7甲醇/丙酮（1：1）适于培养细胞的原位杂交技术。84%多聚甲醇-0.5% 1%戊二醛溶液在 pH7.4 磷酸缓冲液中，用于免疫电镜样品固定。四、LB 培养基（一）液体 LB 培养基（
22、 Luria-Bertani 培养基）配制：取一 1000ml 的烧杯，将事先称取好的试剂加入杯内，加 H2O 约 500800ml 搅拌使其溶解完全。用 5N 的 NaOH 调 pH 至 7.0,加入 H2O 定容至 1000ml。15 磅高压灭20min。（二）琼脂糖平板培养基 细菌培养用琼脂（或琼脂糖） 15g液体培养基（如 LB） 1000ml按浓度比例，将琼脂加入液体培养基（如 LB）中，稍加搅拌，用纱布或纸封好瓶口，15 磅高压灭菌 20min。五、小量质粒提取主要液体1溶液2溶液3溶液（3mol/L 醋酸钠）加热溶解后，再用冰醋酸（约 40ml）调 pH 至 4.8，补足 H2O
23、 至 200ml。六、杂交前处理1蛋白酶（Proteinawe K, Pro.K） 蛋白酶 K 主要用于杂交前标本处理，其作用是使组织达到一定消化，利于检测分子的穿透，从而提高检测方法的敏感性，但各种组织在不同条件下消化程度不一，因此，具体应用时，应根据组织种类、温度确定反应时间及酶的浓度。过度消化可使组织形态结构遭到明显破坏，核酸分子也会受到影响。通常是将其配成储备液（1mg/ml） ，临用前，再配成工作液（约 0.025mg/ml） 。配制方法：该文章转载自医学全在线：http:/ 1：40 稀释，充分混合，即得约含 Pro.K 为 25mg/ml 的工作液。（3）关于 P-K 缓冲液的配
24、制：称取上述试剂，充分混合即可。1mol/L 的 Tris-HCl(pH8.0)：先将 Tris 于 800ml ddH2O 中溶解，用 HCl 将 pH 调至 8.0,ddH2O 定溶于 1000ml，高压灭菌，室温备用即可。0.5mol/L 的 EDTA该文章转载自医学全在线：http:/ EDTA 溶于约 600ml ddH2O 中，常需 60持续搅拌以助溶，滴加 NaOH 至 pH 接近 8.0 时，EDTA 才开始溶解。待完全溶解后，冷却至室温， NaOH 调 pH 至 8.0,ddH2O 定溶至 1000ml，高压灭菌，室温备用。2甘氨酸（1）1mol/L 甘氨酸：称取甘氨酸 75
25、g 溶于 ddH2O 或 DEPC 水中，最后补足 ddH2O 定容至 1000ml，高压灭菌备用。该液位储备液，-20 储存。（2）甘氨酸工作液（0.1mol/L）1mol/L 甘氨酸 100mlPBS 900ml将二者按 1：10 比例稀释，即得甘氨酸工作液。一般要求临用前新鲜配制。甘氨酸有终止蛋白酶 K 作用的作用，以防过度消化。30.25%醋酸-0.25% 醋酸酐配制：按上述配方，先以少许 DEPC 水溶解 NaCl，然后加入三乙醇胺及浓 HCl。DEPC水定容至约 1000ml(997.5ml)，临用前，一边摇动溶液一边加入醋酸酐，充分混合。注意操作时避免浓 HCl 溅出，最好在通风
26、条件下进行。生物体内有些组织，如神经组织中的蛋白质，对带负电荷的核酸探针较易吸附。经该液乙酰化处理后，可使切片标本表现带上负电荷，有排斥带负电的核酸探针，减少非特异吸附，降低反应背景的作用。4RNA 酶溶液取 RNA 酶 A 溶解于 100ml DEPC 水中，分装成小份（1ml,10mg/ml） ，-20储存。临用前，取 RNA 酶 A 储备液，用 2SSC 溶解配成工作液（0.01mg/ml）.5.0.2%取 2ml Triton X-100 加入 998ml PBS 中，充分振荡使其充分混合。七、杂交用液1SSC（Standard Saline Citrate, SSC）通常配成 10，
27、20，50的储备液，如下：配制：先称取上述两种试剂，溶于约 800ml ddH2O 中，滴加 10N 的 NaOH，将 pH 值调至 7.0，补足 ddH2O 至 1000ml，加入终浓度为 0.1% 0.2%的 DEPC，分装后高压灭菌，可室温保存。该液主要用于配制予杂交液及杂交后的各种洗脱液，以保持一定的离子强度。此外，在用于杂交的湿盒内也常用 5的 SSC 以保持一定湿度。2Denhardts 液通常配成 10，50或 100的储备液配制：称取上述试剂，溶于 800ml 左右灭菌 ddH2O 中，定容至 1000ml 后，过滤后于-20保存备用。该液用于配制杂交液及予杂交液等。3杂交液及
28、予杂交液：临用前加；予杂交液不加配制：先以去离子甲酰胺与 SSC 于室温混合，加入硫酸葡聚糖于 50促溶，依次加入其它成份。硫酸葡聚糖在室温常需数小时才能完全溶解。有时需旋涡振荡。定容后充分混合。根据使用方便可分装（最好用铝箔将瓶子包好）存于 4，可达数月。注意，杂交缓冲液在使用前切忌污染。变性被打断的无关 DNA（常为鲑精 DNA 或鲱精 DNA）可在予杂交及杂交前加入。此外，有许多物质如肝素、多聚腺甘酸、醋酸钠等多种成份，可根据需要加入杂交液中，上述配方所列只是不可缺少的基本成份。配制好的杂交液不宜反复冻融，否则易产生硫酸葡聚糖沉淀现象。使用前最好加热至50，使其充分溶解后再加入探针分子。
29、至于探针的浓度视实验目的、探针类型及标记方法而异。通常 RNA 探针分子浓度为 0.52g/ml，DNA 探针浓度为 1g/ml, 此外，如使用 35S 标记的探针，还需加入终浓度为 100mmol/L 的二硫苏糖醇（Dithiothreitol,DTT ）至杂交液及杂交后的洗脱液中。八、杂交后漂洗溶液无论用何种标记方法及何种信号显示方法，在杂交后洗脱则是大同小异。在此，归纳几种带有共同性及常用的洗脱液。该液常用于杂交后的初次洗脱，故离子强度（张力）较高。该液常用于杂交后的第二次洗脱，离子强度较低，经过上述两套洗脱液洗后，有的还可用2SSC，10%（0.1%）SDS 洗脱。主要是洗去残留的 R
30、NA，降低背景。用于以 RNA 为探针的原位杂交方法中。4Dig 标记探针杂交后处理液用 ddH2O 溶液并定容至 1000ml。用 ddH2O 溶解并定容至 1000ml。配制同上。左旋咪唑有消除内源性磷酸酶的作用。九、原位杂交信号显示目前应用原位杂交方法中，信号的显示主要有放射自显影，酶底物及免疫金银等方法，在此归纳有关的主要试剂。1A-B 显影液称取上述试剂，按配方分别溶于 50ml ddH2O 中，于显影前，在室温将两者（A 液及 B 液）按 1：1 混合，稍加摇动促进混合，即可将贴有切片标本的切片放入显影液，于室温避光（可暗室）反应 515min。显影时间和温度相关，需自己根据情况摸
31、索。终止反应只需将显影液倒出，自来水冲洗即可。倒出的 AB 显影液可暂时不扔，光镜下观察，若明显显影不够，还可重新或继续显影。AB 显影液要求临用前配制，在显影时才将 AB 二液混合。否则，A 液过久会产生黄色沉淀，增加背景。AB 液用于免疫金银法中，使金标记颗粒信号放大，形成棕黑色沉淀。2DAB-H2O 显色液配制方法见附录一。该液用于标本被标记上辣根过氧化物酶（HRP）的方法。产物为棕黄色。3NBT-BCIP 显色液配制方法，详见附录一。该液用于有碱性磷酸酶标记物的方法中。产物为紫蓝色。4Kodak D-19 显影液配制：先将 500ml 水中加温 50，按上述配方顺序加药，同时充分搅拌，每加一种药完全溶解后，再加另一种药品，否则，所配的显影液易产生混浊而效果差，最后补足水至1000ml 充分混合，室温或 4避光保存。最好包上纸。该液用于放射自显影时的显影。5Kodak F-5 定影液（酸性坚膜定影液）：28%醋酸为 3 份冰醋酸和 8 份水混合液。配制：同 Kodak D-19 显影液
