1、双向电泳操作步骤及相关溶液配置一、实验原理：2-DE 的第一向电泳等电聚焦是基于等电点不同而将蛋白粗步分离，第二向 SDS-PAGE 是基于蛋白质分子量不同，而将一向分离后的蛋白进一步分离。这样就可以得到蛋白质等电点和分子量的信息。二、实验步骤：1. 样品的溶解取纯化后的晶体蛋白 3.0mg，加入 300ul 裂解液（1mg 蛋白：100ul 裂解液）振荡器上振荡 10min左右，共处理一个小时。其中每隔 1015 分钟振荡一次，然后 13200rpm 离心 15min 除杂质，取上清分装，每管 70ul，-80 保存。2. Bradford 法测蛋白含量取 0.001g BSA（牛血清白蛋白
2、）用 1ml 超纯水溶解，测定 BSA 标准曲线及样品蛋白含量。取 7 个 10ml 的离心管，首先在 5 个离心管中按次序加入 0ul，5ul，10ul ，15ul，20ul 的 BSA 溶解液，另 2 管中分别加入 2 ul 的待测样品溶液，再在每管中加入相应体积的双蒸水（总体积为 80ul），然后，各管中分别加入 4ml 的 Bradford 液（原来配好的 Bradford 液使用前需再取需要的剂量过滤一遍方能使用），摇匀，2min 在 595nm 下，按由低到高的浓度顺序测定各浓度 BSA 的 OD 值，再测样品 OD 值。（测量过程要在一个小时内完成）。3. 双向电泳第一向IEF
3、（双向电泳中一律使用超纯水）3.1 水化液的制备称取 2.0mg 的 DTT，用 700ul 水化液储液溶解后，加入 8ul 0.05% 的溴酚兰，3.5ul （0.5%v/v ）IPG buffer （pH 3-10）振荡混匀，13200rpm 离心 15min 除杂质，取上清。在含 300ug 蛋白（经验值）的样品溶解液中加入水化液，至终体积为 340ul，振荡器上振荡混合，13200rpm 离心 15min 除杂质，取上清。3.2 点样，上胶分两次吸取样品，每次 170ul, 按从正极到负极的顺序加入点样槽两侧，再用镊子拨开 Immobiline DryStrip gels （18cm
4、，pH 3-10）胶条，从正极到负极将胶条压入槽中，胶面接触加入的样品。注意：胶条使用前，要在室温中平衡 30 分钟；加样时，正极要多加样，以防气泡的产生；压胶时不能产生气泡；酸性端对应正极，碱性端对应负极；样品加好后，加同样多的覆盖油（Bio-Rad），两个上样槽必须与底线齐平。3.3 IPG 聚焦系统跑胶程序的设定（跑胶温度为 20）S1 （30v, 12hr, 360vhs, step）S2 （500v, 1hr, 500vhs, step）S3 （1000v, 1hr, 1000vhs, step）S4 （8000v, 0.5hr, 2250vhs, Grad）S5 （8000v, 5
5、hr, 40000vhs, step） 共计 44110vhs, 19.5 小时其中 S1 用于泡胀水化胶条， S2 和 S3 用于去小离子，S4 和 S5 用于聚焦3.4 平衡用镊子夹出胶条，超纯水冲洗后，在滤纸上吸干（胶面，即接触样品那一面不能接触滤纸，如果为18cm 的胶条要将两头剪去），再以超纯水冲洗，滤纸吸干（再次冲洗过程也可省略），然后用镊子夹住胶条以正极端（即酸性端）向下，负极端（即碱性端）向上，放入用来平衡的试管中（镊子所夹的是碱性端，酸性端留有溴酚兰作为标记），用平衡液 A,平衡液 B 先后平衡 15min. 注：平衡时要注意保持胶面始终向上，不能接触平衡管壁。平衡第二次时，
6、在沸水中煮 Marker 3min,剪两个同样大小的小纸片，长度与一向胶条的宽度等同，然后吸取煮好的 Marker,转入 SDS-PAGE 胶面上，保持紧密贴合；同样在第二次平衡时，煮 5%的琼脂糖10ml.4. 双向电泳第二向SDS-PAGE4.1 配胶（两根胶条所用剂量）分离胶：（T=8% 80 ml）：溶液于真空机中抽气后再加 APS 和 TEMED30 % 丙烯酰胺储液 21.28ml分离胶 buffer 20ml 10%APS 220ul TEMED 44 ul双蒸水 38.72ml浓缩胶：（T=4.8% 10ml）30 % 丙烯酰胺储液 1.6ml浓缩胶 buffer 2.5ml
7、10%APS 30ul TEMED 5ul双蒸水 5.9ml4.2 灌胶将玻璃板洗净后，室温晾干，然后，将电泳槽平衡好，玻璃板夹好，再在玻璃板底部涂上凡士林以防漏胶，倒入正丁醇压胶，凝胶后（这时会出现三条线），用注射器吸去正丁醇，超纯水洗两次，再用滤纸除水后，倒入浓缩胶，正丁醇压胶，凝胶后，用注射器吸去正丁醇，超纯水洗两次，再加入超纯水，用保险膜封好。4.3 转移剪两个小的滤纸片，吸取 Marker 后，放入 SDS-PAGE 胶面的一端。然后，将平衡好的 IPG 胶条贴靠在玻璃板上，加少量的 5%的琼脂糖溶液在胶面上（琼脂糖凝胶在转移前十几分钟的时候配好，水浴加热溶解，并保持烧杯中水处于沸腾
8、状态，至用之前再拿出来），再将 IPG 胶条缓缓加入 SDS-PAGE 胶面，其中不断补加 5%的琼脂糖溶液，注意不能产生气泡。4.4 跑胶浓缩胶 13mA 分离胶 20mA 共约 5.5 个小时5. 银染（两根胶条所用剂量）（银染特别注意用超纯水）5.1 固定 30min 无水乙醇 200ml+乙酸 50ml,用超纯水定容至 500ml5.2 敏化 30min 无水乙醇 150mlNa2S2O35H2O 1.5688g无水乙酸钠 34g先用水溶解 Na2S2O35H2O 和乙酸钠，再加乙醇，最后定容至 500ml5.3 洗涤 5min 3 次5.4 银染 20min AgNO3 1.25g
9、用超纯水定容至 500ml5.5 洗涤 1min 2 次5.6 显影 无水 Na2CO3 12.5g 用超纯水定容至 500ml甲醛（37%）0.1ml ，临时加5.7 终止 10min EDTA-Na2?2H2O 7.3g 用超纯水定容至 500ml5.8 洗涤 5min 3 次注：整个双向电泳实验中全部使用超纯水，尽量减少离子的影响。实验相关试剂配制1.Bradford 工作液95%乙醇 25ml 先用乙醇溶解考马斯亮兰 G250,溶解完后再加磷85%磷酸 52ml 酸，最后超纯水定容至 500ml.过滤后置于棕色瓶考马斯亮兰 G250 0.035g 外加油皮纸保存（Bradford 不稳
10、定，一周内有效）2.裂解液尿素 8M硫脲 2MCHAPS 4%DTT 60 mMTris-base 40 mM（如果有条件可以添加 PMSF 0.5mM 和 5%的 Pharmalate）3. 水化液储液尿素 8M硫脲 2MCHAPS 4%Tris-base 40 mM4. 分离胶 buffer （pH8.8） 250mlSDS 0.4% 1gTris-HCl 1.5M 45.4275g5. 浓缩胶 buffer （pH6.8） 100mlSDS 0.4% 0.4gTris-HCl 0.5M 6.07g6.凝胶储存液（30%的丙烯酰胺） 250mlAcr 29.2% 73gBis 0.8% 2
11、g7. 电极缓冲液（跑一次要配制 2500ml）甘氨酸 43.2g 36gTris 9g 或 7.5gSDS 3g 2.5g超纯水定容至 3000ml 超纯水定容至 2500ml8. 0.5M Tris -HCl pH 6.8 储液6.1g Tris 先用 30ml 超纯水溶解，再用 46ml,3M HCl 调 pH6.8,再加水定容至 100ml9.平衡液储液脲（即尿素） 36g甘油 30% 30mlSDS 1% 1g0.5M Tris-HCl pH6.8 10ml 超纯水定容至 100ml10. 平衡液 A（一根胶条）DTT 20mg平衡液储液 10ml11.平衡液 B（一根胶条）碘乙酰氨 300mg平衡液储液 10ml0.05%溴酚兰 15ul （平衡液 A、B 均需临时配制）12.0.5%琼脂糖 10ml琼脂糖 0.05g电极缓冲液 10ml溴酚兰 25ul补：4 、 5、6 的溶液需过滤后储存于 4备用。
