MHC细胞型配型.doc

1、 实验十二 MHC 细胞学配型实验 一、目的要求 1. 了解单向 MLC 法的原理。 2. 掌握单向 MLC 法的实验方法。 二、实验原理 1.细胞学分型法是以混合淋巴细胞培养（MLC）或称混合淋巴细胞反应（MLR）为基本技术的 HLA 分型法。能用本法分型的抗原称为 LD 抗原，包括 HLA-D、DP。2.同种间或异种间两个不同个体的淋巴细胞在体外混合培养时，由于二者细胞上的 MHC 抗原不同，能够互相刺激而发生增殖反应，称为双向混合淋巴细胞反应（mixed lymphocyte reaction, MLR）或混合淋巴细胞培养（ mixed lymphocyte culture, MLC）

2、。主要组织相容性复合物（major histocompatibility complex, MHC） 。HLA 抗原是人类主要组织相容性复合物抗原。3.将两个不同个体之一的淋巴细胞经 1%戊二醛处理抑制其增殖能力而保持其 MHC 分子的天然活性（免疫原性） ，以这些细胞作为刺激细胞，另一个体的淋巴细胞不经过处理作为反应细胞，两者进行混合培养，刺激细胞引起反应细胞转化而成淋巴母细胞，此反应称为单向 MLR。根据细胞的增殖程度来判断反应细胞上 MHC 抗原的匹配程度，如二者的 MHC 抗原相配，则刺激作用很小，细胞无明显增殖；如果两者的 MHC 抗原不相匹配，则刺激作用大，细胞被活化并增殖，形态上

3、呈现细胞转化和分裂现象，可通过形态法计数转化细胞百分比。4. 单向 MLC 又分为阴性分型法和阳性分型法两种。阴性分型法：又称为纯合子分型细胞试验（HTC） 。纯合子是指细胞内一对同源染色体上两个 HLA 单倍型完全相同，只表达一种抗原，可从近亲婚配的子代中寻找。阳性分型法：又称为预致敏淋巴细胞分型法（PLT） ，预备：选择只有一个单倍型不同的两个个体，ab 和 ac，刺激细胞 ab 加反应细胞 ac 共育作单向 MLC，得到针对 b 特异免疫应答能力的 PLT.依此类推，可得到一系列识别各种已知 LD 抗原的一套PLT。5.遗传型不同的两个个体淋巴细胞在体外混合培养时，由于两者 HLA 不同

4、，能相互刺激导致对方淋巴细胞分裂增殖和分化，称为双向混合淋巴细胞培养。.三、应用 1、 在器官移植配型中，通过双向 MLR 检测确定了两个个体的 MHC 相符合，为了检测由于两个个体 MHC 所具有的微小差异而引起的排斥反应强度，使用单向 MLR 来确定受体使用免疫抑制剂的剂量大小。 2、 检验后备疫苗抗原是否适用于广泛的群体。已知的 MHC 类型对某抗原表位具有很好的提呈作用， 如果待测个体的细胞不与已知 MHC 类型细胞反应或反应程度很低，则证明该个体的抗原提呈细胞可以很好地提呈此抗原。 四、材料 1、健康的不同系小鼠（昆明小鼠和 BALB/c 小鼠均可） 2、试剂 1%戊二醛、RPMI-

5、1640 完全培养基、瑞氏染液、Hanks 液 3、12 孔培养板（若反应液体积小于 1ml，可用 24 孔培养板） 、注射器、平皿、离心管 4、仪器 超净工作台、CO2 恒温培养箱、离心机 五、实验方法 1、脾细胞悬液的制备 将小鼠拉颈处死，75%乙醇浸泡消毒（纱布吸干） ，在无菌超净台中取出脾脏，用 Hanks 液漂洗一次后，放入含有 3ml Hanks 液的平皿中将脾脏的两端分别剪开，用 1ml 注射器将脾脏中的细胞吹出，收集细胞于离心管中 3000r/min，离心 3min，上清弃去后重悬细胞，加入 1ml 蒸馏水轻摇离心管作用 20s 后加入等体积 1.8%NaCl 使红细胞裂解，3

6、000r/min，离心 3min 弃上清用 Hanks 液洗一遍，离心去弃上清后用 Hanks 液调整细胞数为 1106个/ml。 2、 反应细胞和刺激细胞的制备 于两个离心管中各取 1ml 制备好的脾细胞悬液，3000r/min，离心 3min 弃上清，细胞重悬后，其中一管加入 1ml RPMI-1640 完全培养基作为反应细胞；第二管加入 500ul 1%戊二醛作用 5min 后 3000r/min，离心 3min，弃上清，将细胞悬起用 Hanks 液洗一遍，加入 1ml RPMI-1640 完全培养基作为刺激细胞。3、 于 12 孔板中加入 500ul 反应细胞每组各加两孔， 两孔中再分

7、别加入 500ul 同种异体刺激细胞和自体刺激细胞作为实验组和对照组。培养板置 CO2恒温培养箱中培养 6d。定期观察培养液颜色，按需补加培养基。 4、 培养结束后，将 12 孔板中的细胞悬液吹匀移至离心管中，3000r/min，离心 3min。 5、 弃上清， 取沉淀细胞加一小滴于载坡片上自然风干后， 滴加数滴瑞氏染液盖满标本，2-3min 后，加入 PBS 倍染 3-5min，倾去染液，蒸馏水洗，上镜观察。 六、镜检结果 淋巴母细胞：细胞体积增大，直径约 20-30m, 形态不整齐，常有小突起，核变大，有核仁 1-2 个，胞浆增多，常出现胞浆空泡。 未转化的淋巴细胞：直径一般为 6-8m，

8、核染色致密，一般无核仁。 计数 200 个淋巴细胞， 按公式计算出转化率淋巴细胞转化率 （转化的淋巴细胞数200）100% 七、注意事项： 1、因实验的培养时间长达 6 天，实验中必须须严格无菌操作，防止污染。 2、细胞培养液的 pH 应控制在 7.2-7.4，否则，淋巴细胞不能生长和转化。 八、注：1.RPMI-1640 完全培养基 60.0 元/袋 北京九州天瑞科技有限公司 保存条件 4保存 电话：13521504759 ；010-69755261, QQ：4078269272.瑞士染液 40ml/瓶 40 元/瓶 青岛高科技工业园海博生物技术有限公司庄同建 电话：86-0532-81935169 传真：86-0532-819350803、Hanks 液 10ml/瓶 150元/瓶 合肥博美生物科技有限责任公司刘翠平 13075516996 安徽-合肥市庐阳区 阜阳北路与荷塘路交汇处云顶广场2号楼1701室