1、细胞破碎技术高压匀浆法班级：10 生 物技术学号：1002021012姓名：_程学军_细胞破碎技术高压匀浆法班级：10 生物技术 姓名：程学军 学号：1002021022 摘要：细胞破碎技术是指利用外力破坏细胞膜和细胞壁，使细胞内容物包括目的产物成分释放出来的技术，是分离纯化细胞内合成的非分泌型生化物质（产品）的基础。目前已发展了多种细胞破碎方法，以便适应不同用途和不同类型的细胞壁破碎。 破碎方法可规纳为机械法和非机械法两大类。机械破碎主要的方法有珠磨法、高压匀浆法、撞击破碎法和超声波等方法。本文主要介绍高压匀浆法，高压匀浆法的应用以及高压匀浆机的介绍和使用。关键词：细胞破碎 高压匀浆法 高压
2、匀浆机 影响因素 应用1、高压匀浆法破碎细胞原理高压匀浆法是大规模破碎细胞的常用方法，作用机理是液体剪切作用，利用高压使细胞悬浮液通过针形阀，由于突然减压和高速冲击撞击环使细胞破碎，细胞悬浮液自高压室针形阀喷出时，每秒速度高达几百米，高速喷出的浆液又射到静止的撞击环上，被迫改变方向从出口管流出。细胞在这一系列高速运动过程中经历了剪切、碰撞及由高压到常压的变化，从而造成细胞破碎。破碎属于一级反应速度过程，被破碎的细胞分率符合如下公式：ln1/(1-R)=KNP 式中 R 破碎率，为 N 次循环后，蛋白质的释放量 Rn 与最大释放量 Rm 之比；K 与温度有关的速度常数；N 悬浮液通过匀浆器的次数
3、；P 操作压力， MPa； 与微生物种类有关的常数。2、高压匀浆机2.1 高压匀浆机工作原理及工作示意图高压匀浆器是常用的设备，它由可产生高压的正向排代泵和排出阀组成，排出阀具有狭窄的小孔，其大小可以调节。细胞浆液通过止逆阀进入泵体内，在高压下迫使其在排出阀的小孔中高速冲出，并射向撞击环上，由于突然减压和高速冲击，使细胞受到高的液相剪切力而破碎。在操作方式上，可以采用单次通过匀浆器或多次循环通过等方式，也可连续操作。为了控制温度的升高，可在进口处用干冰调节温度，使出口温度调节在 20左右。在工业规模的细胞破碎中，对于酵母等难破碎的及浓度高或处于生长静止期的细胞，常采用多次循环的操作方法。2.2
4、 高压匀浆机性能特点凡与物料相接触的零部件材料都具有极高的耐磨性和良好的耐腐蚀性、对物料不会产生不良的影响，高压均质机与其它均质设备相比，具有占地面积小、效率高、能量大、反应时间快、运转费用低等优点。高压均质机品种、规格齐全，完全能满足各个领域用户的需要。均质功率从 1KW-200KW，压力从 15MPa-100MPa，从 0.2 升物料能做实验的台式小型均质机到 3 万升/小时超大型均质机，各种规格达一百多种，为全国同行业之最。机器的均质系统分别由一级阀和二级阀组成双级均质系统，两者的均质压力可以在其额定的压力范围内任意选择，两者可同时使用，也可单独使用。均质阀的结构可分为平型和 W 型两种
5、，平型阀能承受高压冲击，具有耐磨性好、使用寿命长等优点。 W 型阀是一种能在一组阀件内产生多次均质过程结构的阀，大大的提高了其均质效果。泵休阀的结构分球型阀和碟型阀二种，球型具有耐高压、使用寿命长等优点。碟型具有结构简单、容积效率高等优点。 主要特点：（1）一级匀质阀，可选二级匀质阀 （2）乳剂和脂质体研究生产单位中得到广泛使用。 （3）意大利 GEA Niro Soavi 公司的高压匀浆机匀质阀材料为陶瓷，陶瓷阀的使用寿命是高密度硬质合金或碳化钨的使用寿命 3 倍以上。 （4）采用电机驱动，而非气动方式，避免了空气经压缩产生的水份进入高压泵，而导致高压匀浆机无法正常运行。 （5）样品经高压匀
6、浆后，最终平均粒径可以达到 100 纳米以下，且粒径分布均匀。 （6）可进行在线清洗（CIP ）和在线蒸汽灭菌（SIP ） ，完全符合 FDA 要求。 （7）框架式系统按照 ASME BPE 标准装配。高压匀浆机按照 ISO9001 质量体系标准生产。 （8）可进行在位清洗和在线灭菌技术参数：（1）最大工作压力 1500 Bar 适合生物工程（酵母细胞破碎、大肠杆菌破碎、丝状真菌破碎、动物细胞及动物组织细胞破碎） 、分子生物学、药剂、乳业、食品研发及中试等行业使用 （2）产量 10L/hr （3）电源要求：三相电源，1.1KW /380V /50Hz /3phase （4）尺寸(mm): W
7、460 x H 420 x L 800 （5）匀质阀材质：陶瓷 （6）压缩头采用高质量、高强度和耐腐蚀的 SAF2507 特种双相不锈钢制造，能够在极高的操作压力稳定持久地工作，不会产生裂纹，有效抵抗腐蚀和机械损伤 （7）设备自重: 85 kg （8）按照 ISO9001 质量体系标准生产3、影响高压匀浆法破碎细胞的主要因素 4本部分以高压匀浆破碎重组大肠杆菌为例子介绍影响高压匀浆法破碎细胞的主要因素3.1 匀浆操作压力对细胞破碎过程的影响右图是匀浆一次时，细胞破碎率及包含体中 rhIL-6 含量随匀浆压力变化曲线当压力在 2040MPa 时，细胞破碎率迅速增加，当压力大于 60MPa 后 其
8、增加势头减弱压力达 80MPa 后，D 值趋于不变 而压力大于 70MPa 后离心所得包含体的纯度显著提高。可见，操作压力对细胞破碎及释放包含体都至关重要 综合破碎动力学和破碎工艺效果，匀浆压力选择为80MPa 为宜。3.2 匀浆次数对细胞破碎过程的影响右图是在 80MPa 下，匀浆次数与细胞破碎率及包含体中目标蛋白含量的关系。匀浆三次 D 值上升迅速，而 rhIL-6 含量达最大值匀浆三次后 D 值上升缓慢，再增加匀浆次数 D 变化不大， 而目标蛋白含量下降，可见匀浆次数存在一个最佳值。若次数过多 会造成细胞碎片尺寸太小 不利于后续分离 同时 包含体中目标蛋白也会在匀浆作用下裂解成小分子，使
9、其纯度下降。综合考虑匀浆三次 基本能使细胞破碎完全 ，又能满足提取包含体的工艺效果。3.3 菌体浓度对细胞破碎过程的影响图是匀浆压力 80MPa T=20C 进料菌体浓度为 100g L -1 和 150g L-1(湿重)时细胞破碎及目标蛋白释放情况。在两种菌体浓度下，三次匀浆后，D 值匀能达到90%以上，说明菌体浓度对细胞破碎影响不大，而菌体浓度为 150g L -1 时，离心后沉淀中 rhIL-6 纯度比 100g L -1 下rhIL-6 纯度略高。考虑工艺因素 , 认为进料菌体浓度高些(150g L-1) 为宜3.4 悬浮体系对细胞破碎过程的影响将菌体分别悬浮于去离子水、缓冲液A 中，
10、通过匀浆器匀浆，匀浆压力 80MPa 。考察不同悬浮体系对匀浆过程的影响。如图所示，两种悬浮体系对 D 值影响差别不大而用去离子水悬浮，匀浆所得的 rhIL-6 纯度比用缓冲液 A 获得的 rhIL-6 纯度高出近十个百分点。这可能是因为在去离子水中，细胞内外的渗透压突然变化，细胞壁容易胀裂,在匀浆作用下更容易释放包含体另一方面在去离子水中，某些杂蛋白在匀浆作用下更容易裂解成小分子物质离心出去。4、高压匀浆法破碎细胞的应用4.1 高压匀浆破碎螺旋藻细胞释放藻蛋白的研究螺旋藻是丝状的多细胞蓝藻，因含有多种对人体有益的营养物质而受到广泛的关注 1。螺旋藻可通过大面积的海水养殖而得，其含量丰富的藻蛋
11、白(藻胆蛋白藻蓝蛋白)，在化妆品制造业、食品加工等行业中有着巨大的应用潜力，近期的研究还发现藻蛋白对某些疾病有治疗作用。从海藻中提取分离藻胆蛋白目前仍是获得藻胆蛋白的主要途径，由于藻蛋白为螺旋藻的胞内产物，因此，提取纯化藻蛋白采用何种细胞破碎技术是直接影响蛋白提取率的关键因素之一。目前用于螺旋藻藻蛋白提取分离过程中的细胞破碎方法主要有超声波破碎法、高压匀浆法、反复冻融法、酶溶法和化学试剂法5等。但由于超声破碎，反复冻融，酶融法只适用于实验室中小规模的细胞破碎，在某种程度上限制了螺旋藻藻蛋白的大规模分离纯化。高压匀浆法是工业上常用的细胞破碎的方法。采用高压匀浆法破碎螺旋藻进行细胞破碎，释放藻蛋白
12、过程中的物理和化学因素，包括均浆次数、均浆压力、藻细胞密度、缓冲液 pH 值、悬浮液体系等进行系统研究，并结合该过程的动力学规律，初步确定了大规模破碎螺旋藻细胞，提取藻蛋白的匀浆工艺，为螺旋藻蛋白工业化生产奠定基础。在螺旋藻蛋白产品的生产由实验室规模扩大到中试规模的过程中，藻细胞的大规模破碎是必须的。只有高压匀浆破碎或珠磨法才能满足产业化的要求。经过多次实验在考察了高压匀浆对破碎细胞过程的各种影响因素后初步得出高压匀浆破碎螺旋藻细胞的工艺为：进料藻液密度为 150g/L 左右，用磷酸缓冲液悬浮，在 80MPa 压力下连续高压匀浆三次，每次通过匀浆机的裂解液用冰浴冷却使得匀浆器出口温度不超过 4
13、0。经过这样的破碎可得到 86% 的藻细胞破碎率和 73% 的藻蛋白含量。 2.6 高压匀浆破碎螺旋藻细胞动力学分析高压匀浆破碎动力学方程为 ln1/(1D)=KNbpa 6，式中，D 为细胞破碎率；N 为匀浆次数；p 为匀浆压力；K、b、a 为匀浆过程参数；N=1 时以 ln1/1 D对压力 p 取双对数作图得一直线，由直线斜率可得出压力指数 a ，由直线截距可得K ，再作 D 与匀浆次数 N 、匀浆压力 p 的关联图，用最小二乘回归可求得参数 b。4.2 高压匀浆破碎释放重组大肠杆菌提取包含体过程的研究 44.2.1 高压匀浆破碎工艺的初步确定在基因工程药物的生产由实验室规模扩大到中试规模
14、中，大规模破碎重组大肠杆菌细胞必须用匀浆破碎或珠磨法才能满足产业化的要求。经过多次试验，在考察了高压匀浆对破碎细胞过程的各种影响因素后初步得出高压匀浆破碎含有 rhIL-6 包含体的重组大肠杆菌细胞的工艺：菌体浓度 150gL-1 左右(目标蛋白表达量为 20%) 用去离子水悬浮，在 80MPa 压力下，连续高压匀浆三次 每次通过匀浆机的裂解液用冰浴冷却 使得匀浆器出口温度不超过 40C 经过这样的破碎，表达量为 20%的菌种可得到纯度为 40%的包含体。4.2.2 高压匀浆破碎重组大肠杆菌动力学分析Middelberg5建立了大肠杆菌高压匀浆破碎动力学方程 ln1/(1-D)=KNbpa，其
15、中 D 为细胞破碎率，N 为匀浆次数，p 为匀浆压力， K、 b、 a 、为匀浆过程参数。N=1 时，以 ln1/1-D 对压力 p 取双对数作图，得一直线，由直线斜率可得出压力指数 a，由直线截距可得 K。再作 D 与匀浆次数 N，匀浆压力 p 的关联图，用最小二乘回归可求得参数 b。下表表为改变高压匀浆过程中压力、温度、浓度、pH 及悬浮体系得出的动力学参数总结表。从表可知，重组大肠杆菌细胞高压匀浆破碎的压力指数 a 为 1.0321 小于文献报道的酵母细胞匀浆压力指数 2.9，未重组大肠杆菌细胞压力指数 2.26 ，这说明经诱导的重组大肠杆菌细胞更易破碎，对参数 b 影响较大的是菌体的悬
16、浮体系 参数 k 受压力影响最大5、总结影响高压匀浆破碎的因素主要有压力、温度和通过匀浆器阀的次数，由分析可知，操作压力对细胞破碎的影响要比匀浆次数的影响大得多。从提高破碎效率的角度应选择尽可能高的压力；而从降低能耗及延长设备寿命的角度应避免很高的压力，因此，工业生产中常采用的压力为 5570Mpa。高压匀浆法操作参数少，且易于确定；且样品损失量少，在间歇处理少量样品方面效果好，在实验室和工业生产中都已得到应用，适用于酵母和大多数细胞的破碎。对于易造成堵塞的团状或丝状真菌以及一些易损伤匀浆阀，质地坚硬的亚细胞器一般不适用。参考文献：1 胡一兵, 胡鸿钧, 李夜光, 等. 从一种富含藻胆蛋白的螺
17、旋藻中大量提取和纯化藻蓝蛋白的研究J. 武汉植物学研究, 2002, 20(4): 299-302.2 Middelberg A P J. A novel technique of the measurement of disruption in high pressure homogenization: Studies on E.Colicontaining recombinant inclusion bodies J. Biotechnol Bioeng, 1991, 38: 363-370.3 Beiley S M. Improved homogenization of recombin
18、ant E.Coli following pretreament with guanidine HCl J. Biotechnol Prog , 1995 , 11: 533-539.4吴蕾, 洪建辉, 甘一如, 张瑛. 高压匀浆破碎释放重组大肠杆菌提取包含体过程的研究J. 高校化学工程学报 , 2001,(02)5吴蕾, 庞广昌, 陈庆森. 高压匀浆破碎螺旋藻细胞释放藻蛋白的研究J. 食品科学 , 2008,(03)6 MIDDELBERG A P J. A novel technique of the measurement of disrup-tion in high pressure homogenization: studies on E.coli containing recombinant inclusion bodies J. Biotechnol Bioeng, 1991, 38: 363-370.
