1、实验二 植物染色体组型分析一、实验目的1. 学习并掌握根尖处理、染色、压片及制片观察的方法。2. 观察有丝分裂各时期染色体的形态变化，了解有丝分裂全过程。3.观察分析植物细胞有丝分裂中期染色体的长短、臂比和随体等形态特征；学习染色体组型分析的方法。二、实验原理植物根尖的分生细胞的有丝分裂，每天都有分裂高峰时间，此时把根尖固定，经过染色和压片，再置放在显微镜下观察，可以看到大量处于有丝分裂各时期的细胞和染色体。各种生物染色体的形态、结构和数目都是相对稳定的。每一细胞内特定的染色体组成叫染色体组型。染色体组型分析就是研究一个物种细胞核内染色体的数目及各种染色体的形态特征，如对染色体的长度、着丝点位
2、置、臂比、随体有无等观测，从而描述和阐明该生物的染色体组成，为细胞遗传学、分类学和进化遗传学等研究提供实验依据。染色体组型分析大都采用植物根尖等分生组织的有丝分裂中期细胞，染色体制片要求分裂相为染色体分散，互不重叠，能清楚显示着丝点位置。然后通过显微摄影，测量放大照片上的每个染色体的长度和其它形态特征，依次配对排列，编号，并对各对染色体的形态特征作出描述。三、实验材料1.材料：大蒜2.用具：载玻片，盖玻片，50ml 烧杯，温度计，恒温水浴锅，试剂瓶，镊子，解剖针，吸水纸，剪刀，绘图，纸胶水等。3.药品：Carnoy 固定液，无水酒精，70酒精，1mol/L HCL 解离液，苯酚品红染液四、方法
3、与步骤（一）植物有丝分裂1、材料处理1）、大蒜发根 将大蒜鳞茎置于盛有清水的小烧杯口上发根，待根长到 1.5-2.0 cm左右时备用（在此过程注意换水）。2）、根尖预处理 在分裂高峰期前（大蒜根尖分裂高峰期为早上八点以及下午两点左右），剪下根尖，置于盛有少量蒸馏水的烧杯并放入冰箱(0 4 )中预处理 24h。预处理的作用，主要是阻碍纺锤丝的形成，使染色体缩短，改变细胞质的粘度，在压片时，有利于染色体的分散。2、材料固定经过预处理的根尖，再放到 Carnoy 液中固定 24h 以内。固定材料可以转入 70酒精中，在 4冰箱中保存，保存时间最好不超过 2 个月。固定的目的在于将细胞迅速杀死，使细胞
4、结构尽可能保持原来的状态。3、材料解离方法：从固定液中取出根尖，用蒸馏水漂洗，再放到：1mol/L HCl 中，在 60水浴中恒温解离 810min；解离完毕后，将根尖置于清水中漂洗 4-5 次，每次 1-2 分钟，最后一次漂洗时长为5 分钟。漂洗目的是将盐酸从根尖中置换出来，以免与后续制片染色的过程造成影响。4、制压、镜检切取根尖分生组织放在清洁的载玻片，剥取分生组织，滴加 1-2 滴苯酚品红染液，染色 812 min 后加上盖玻片，覆以吸水纸压片，45%醋酸分色，中性树胶封片。镜检。（二）核型分析1、显微照相、冲洗和放大选取 5 个前期末（或者中期）的细胞进行显微照相。要求染色体分散良好，
5、没有重叠，数目完整，随体和着丝点明显，没有断裂，着色鲜明，形态清晰，且各条染色体处于同一平面上。选定的符合要求的细胞在 1040 倍下进行显微照相（可用 10100 倍的油镜），然后冲洗，选取图像清晰的底片，放大、洗印出染色体形态清晰的照片。在显微照相的同时，对镜台测微尺进行同样倍数拍摄，放大，然后根据照片上的实际长度，计算放大倍数。2、测量：依次测量放大照片各染色体长臂和短臂的长度（随体是否计入臂长须注明）。根据测量、记录染色体形态测量数据计算：绝对长度（m）=放大的染色体长度 放大倍数染色体组总长度=该细胞单倍体全部染色体长度（包括性染色体）之和相对长度（%）=每个染色体长度染色体组总长度
6、100臂比=长臂长度短臂长度着丝粒指数=短臂该染色体长度1003、配对：根据测量数据，即染色体相对长度、臂率、着丝粒指数、次缢痕的有无及位置、随体的形状和大小等进行同源染色体的剪贴配对。4、排列：染色体对从大到小依次排列；等长染色体对，短臂长的在前；具随体染色体、性染色体可单独排在最后。异源的染色体要分别排列（如小麦的 A、B、D 染色体组）5、剪贴：把上述已经排列的同源染色体按先后顺序粘贴在绘图纸上。粘贴时，短臂向上、长臂向下，各染色体的着丝粒排在一条直线上。所得组型图。6、分类： 臂比是反应着丝点在染色体上的位置。根据此可确定染色体所属的形态类型。染色体形态类型：臂比（长臂/短臂） 形态类
7、型。11.7M 中着丝粒染色体；1.713.0SM 近中着丝粒染色体；3.017.0 ST 近端着丝粒染色体；7.01T 端着丝粒染色体；SAT 随体染色体。7、将结果整理汇入表格填表8、综合描述计数体细胞染色体数目：统计细胞数30，85%具有恒定一致的数目；以分裂中期、高质量的体细胞染色体图像作为形态描述，以 5 个以上的细胞染色体，测其平均值。核不对称系数（Ask）长臂总长全组染色体总长100%染色体的长短：按 Kuo 等的方法，以染色体相对长度系数（I.R.L）组成划分染色体的长短，即 I.R.L1.26 为长染色体（L）；1.01I.R.L1.25 为中长染色体（M 2）；0.76I.
8、R.L 1.00 为中短染色体（M 1）；I.R.L0.76 为短染色体（S）。2n=24=8L+2M2+10M1+4S。相对长度系数（I.R.L）= 每条染色体的相对长度染色体的平均相对长度染色体组型分类：Stebbins(1971)核型分类表。染色体长度比 臂比值2 的染色体的百分比0.00 0.01-0.50 0.51-0.99 1.002 ：1 1A 2 A 3 A 4 A2：1-4：1 1B 2 B 3 B 4 B4：1 1C 2C 3C 4C染色体长度比最长染色体长度最短染色体长度染色体组型类型 1A 为最对称型， 4C 为最不对称型。染色体组型的公式：芍药 2n=2x=10=8M
9、(2Sat)+2SM=6M+2SAT+2SM染色体组型模式图：根据各染色体的相对长度平均值绘制一坐标图。横轴上标明各染色体序号，每一染色体与其序号相对应，纵轴表示相对长度值() ，零点绘在纵轴的中部，并与各染色体的着丝点相对应。此即为该细胞的染色体组型模式图。五、实验结果选择适宜的细胞，对其进行计数，大蒜染色体共八对 16 条1、光学显微镜放大总倍数（400x）下的细胞染色体状况：图 1 大蒜染色体根尖细胞2、染色体形态数目配对如下：图 2 大蒜根尖染色体核型图3、大蒜染色体核型模式图如下：图 3 染色体组型模式图 4、染色体测量数据如下表：染色体形态测量数据表染色体序号 项目长臂长度q短臂长
10、度p染色体全长q+p臂比 q/p 染色体类型实测值（mm） 5 4.1 9.2 绝对长度（um） 4.88 3.9 8.78 1相对长度（%） 8.55 6.83 15.391.25 M(SAT)实测值（mm） 4.5 4 8.5 绝对长度（um） 4.39 3.9 8.28 2相对长度（%） 7.69 6.83 14.511.125 M 实测值（mm） 4 4 8绝对长度（um） 3.9 3.9 7.8 3相对长度（%） 6.84 6.83 13.67 1 M 实测值（mm） 4.5 3 7.5 绝对长度（um） 4.38 2.92 7.31 4相对长度（%） 7.67 5.14 12.81
11、 1.5 M 实测值（mm） 3.5 3.5 7绝对长度（um） 3.41 3.41 6.835相对长度（%） 5.97 5.97 11.971 M实测值（mm） 3.5 3 6.5绝对长度（um） 3.41 2.93 6.346相对长度（%） 5.97 5.14 11.391.167 M实测值（mm） 4.3 2 6.3绝对长度（um） 4.19 1.95 6.147相对长度（%） 7.34 3.42. 10.762.15 SM实测值（mm） 3.5 2 5.5绝对长度（um） 3.41 1.95 5.368相对长度（%） 5.97 3.42 9.391.75 SM染色体组总长度：57.04
12、um 染色体平均长度：7.13um （注：由于一系列误差，40 um 对于 39mm，故此 1mm=0.975um）实验结果分析：大蒜是二倍体，染色体数目为 2n=16，大蒜染色体的核型公式为：2n=16=2X=12m+4sm，不具随体染色体，染色体组型为 2A 型，核不对称指数为 55.6%，大蒜染色体形态结构总体差异不大。此次实验为期一月，在该过程中或由于取材时间不准确，导致分裂相稀少和不符合要求；或解离过度，染色过程着色浅；或压片不到位，致使染色体未分开等等问题导致实验的拖沓，实验结果不如人意。实验室一门细微的工作，在实验过程中，理解了实验原理及其过程，在整个实验过程中要注意细节：1、对大蒜根尖预处理时间把握正确，其根尖分裂高峰期时间为早上八点或下午两点左右2、解离时间以及温度把握正确3、染色时间要足够，以免影响观察效果4、压片力度适宜，过大破坏细胞，不足细胞及染色体未分散
