1、兰州百合的组织培养技术一、实验目的1、学习并掌握植物组织培养技术2、应用植物组织培养技术快速繁殖兰州百合3、通过以百合鳞片为外植体进行组培，掌握对试验材料的消毒、接种方法，初步掌握外植体愈伤组织诱导的方法。二、实验原理植物组织培养再生植物的理论基础是细胞全能性，是指在多细胞生物中每个体细胞的细胞核具有个体发育的全部基因，具有发育成完整个体的潜力。离体的植物组织在一定条件下，可发生“脱分化” ，即已经分化了的植物细胞重新分裂生长，形成均一的无组织结构的细胞团，即愈伤组织。这种愈伤组织在一定条件下，又能“ 再分化” 出根和芽等器官。在该过程中，植物生长调节物质起着决定作用，调控愈伤组织的芽或根的分
2、化。三、材料1、试剂：NH 4NO3, KNO3, CaCl22H2O, MgSO47H2O, KH2PO4, KI, H2BO3， MnSO44H2O, ZnSO47H2O, Na2MoO42H2O, CuSO45H2O, CoCl26H2O, Na2EDTA2H2O，FeSO 47H2O，烟酸，甘氨酸, 盐酸硫胺素, 肌醇, 盐酸吡哆醇；琼脂，蔗糖，蒸馏水，NAA，6-BA，1mol/LHCl，1mol/LNaOH；升汞。2、仪器: 冰箱，天平，酸度计或 pH 试纸， 电炉，微波炉，高压灭菌锅，烘箱，超净工作台，光照培养箱等3、基本工具：三角锥瓶、容量瓶、吸量管、量筒、移液器、烧杯、培养皿
3、、滤纸、牛皮纸、封瓶膜、玻璃棒、镊子、剪刀等。4、生物材料：市售兰州百合。四、方法（一）MS 培养基的配制1.配制 MS 培养基母液的配制方法如下：(1)大量元素的配制（10）：按母液配制表1上的量依次称取KNO319g、NH 4NO3 16.5g、MgSO 47H2O 3.7g、KH 2PO4 1.7g ,分别用少量的蒸馏水彻底溶解，然后再将它们混溶，以防互相发生反应，最后用容量瓶定容至1L（如需求量不大可按比例减少）,转入棕色试剂瓶中，贴上标签，置冰箱冷藏保存。(2)钙盐的配制：称取 CaCl22H2O 4.4g，用少量的蒸馏水充分溶解，最后用容量瓶定容至1L（如需求量不大可按比例减少）,
4、转入棕色试剂瓶中，贴上标签，置冰箱冷藏保存。(3)微量元素的配制：依次称取 MnSO44H2O22.3g、ZnSO 47H2O 8.6g、H 3BO3 6.2g、KI0.83g、Na 2MoO42H2O 0.25g、CuSO 45H2O 0.025g、CoCl 26H2O 0.025g ,分别用少量的蒸馏水彻底溶解，再将它们混溶，最后用容量瓶定容至1L（如需求量不大可按比例减少）,转入棕色试剂瓶中，贴上标签，置冰箱冷藏保存。(4)铁盐的配制：将称好的 FeSO44H20和 Na2EDTA 分别放到450ml 蒸馏水中，边加热边不断搅拌使它们溶解，然后将两种溶液混合，并将 pH 调至5.5 ，最
5、后用容量瓶定容至1 L（如需求量不大可按比例减少）,保存在棕色玻璃瓶中,贴上标签，置冰箱冷藏保存。 表 培养基母液的配制母液种类编号种类药品成分 规定量（mg ）扩大倍数称取量（mg）母液体积（ml)配 1L 培养液吸取量（ml）NH4NO3 1900 19000KNO3 1650 16500MgSO47H2O 370 37001 大量元素KH2PO4 1701017001000 1002 钙盐 CaCl22H2O 440 10 4400 1000 100MnSO44H2O 22.3 2230ZnSO47H2O 8.6 860H3BO3 6.2 620KI 0.83 83Na2MoO42H20
6、 0.25 25CuSO45H2O 0.025 2.53微量元素CoCl26H2O 0.0251002.51000 10Na2EDTA 37.30 37304 铁盐FeSO44H20 27.8010027801000 10甘氨酸 2.00 100盐酸硫胺素 0.10 55 有机成分盐酸吡哆醇 0.55025500 10(5)有机成分的配制 : 依次称取甘氨酸 2.00g、盐酸硫胺素 0.10g、盐酸吡哆醇0.5g、烟酸 0.5g,肌醇 100g，用少量蒸馏水充分溶解，最后定容至 1L（如需求量不大可按比例减少）,转入棕色试剂瓶中，贴上标签，置冰箱冷藏保存。2.激素溶液的配制分别称取6-BA、N
7、AA各10mg，将6-BA用1ml的0.1mmol/L的NaOH溶液溶解，将NAA用1ml无水乙醇预溶，溶解过程用水浴锅加热，待溶解完全后，分别用容量瓶定容至100ml，即得到0.1mg/ml的母液（实验时按需要量取）。3. 完全培养基的制备（如需求量不大可按比例减少）。（1）取出母液并按添加顺序放好，将实验所需的量筒，移液枪，烧杯，移液管，吸耳球和玻璃棒等放在实验台上，以备实验所需。（2）取一干净的烧杯，加入 1/3 左右（配制培养基总量的 1/3 左右）的蒸馏水，按顺序加入各种母液，边加边搅拌。（3）然后按 3的含量称取蔗糖倒入并搅拌溶解。（4）初代培养基按 MS+0.5mg/L 6-BA
8、+0.8mg/L NAA。用移液枪精确量取所需激素母液，加入培养基中。（5）将上述溶液移入容量瓶中，加蒸馏水定溶。（6）将定容好的培养基倒入烧杯中，按 0.8称取琼脂粉，倒入上面配好的溶液中，放在电炉上加热，直到琼脂粉完全熔化溶液透明（不能一直放在电炉上加热，沸腾了就要取下来晃一晃，再放上去加热，如一直加热烧杯底部会糊且溶液易溢出量会减少） 。（7）用精密试纸调整 pH 至 5.8-6.0。用配制好的 0.1mol/L 的 HCl 和 0.1mol/L的 NaOH 溶液来调节 pH 值（不宜在加热前调节 pH，因为加热会使 pH 改变） 。（8）稍微冷却后，分装入以洗净的三角培养瓶中。再用透明
9、塑料封口膜以及牛皮纸封口，最后用绳子扎紧。（9）另取适量滤纸（2 张/组） 、培养皿（2 套/组） ，用牛皮纸包好扎紧；另取蒸馏水适量（至少 200ml/组/瓶）装入盐水瓶,盖好塞子并插上针头透气；另取大中小镊子和剪刀等包好（1 套/组） 。（10）将步骤 8、9 所准备的物品统一放入高压锅内，120KPa 灭菌 30min 左右。灭菌后从灭菌锅中取出培养基，平放在实验台上令其冷却凝固，将其他实验用具放入干燥箱烘干，放入超净台备用。 烟酸 0.5 25肌醇 100 5000（二）兰州百合外植体灭菌处理和初代培养将买来的新鲜兰州百合的鳞茎拨开，洗去上面的泥土，在用流动的自来水冲洗2h，用前再用蒸
10、馏水洗1-2遍（如买来的百合不能及时用应放到4度冰箱保存） 。在超净工作台上采用0.1%的升汞溶液侵泡15min，无菌水冲洗4-5次，进行外植体消毒处理。然后放在无菌滤纸上，无菌剪切成0.5cm1cm大小的小块，凹面向上，接种于培养基上。每组接种2瓶，每瓶接种3块外植体。培养条件：22-25; 光照12h/d，光照强度1800-2000lx。每隔两天进行观察和记录生长情况，两周左右鳞片的颜色会发生变化，由刚开始的白色慢慢有点变紫色，培养20天左右鳞片由淡绿色慢慢变为绿色，鳞片凹面的边缘处和中间会有很多突起，当突起慢慢变成0.5-2.0cm左右的绿色小芽时，进行继代培养。（三） 继代培养本实验的
11、继代培养基为MS+0.5mg/L6-BA+0.5mg/LNAA+30g/L蔗糖。操作方法如下：在无菌条件下取初代培养的不定芽，接种在已配制好的继代培养基内进行培养。每两天进行观察记录生长情况，培养10-20d后观察增殖情况，并对生长状况（判定标准：健壮：丛芽质量好，芽生长快；较壮：叶片较整齐，叶色翠绿；一般：丛芽过于紧密，生长慢；细弱：叶片卷曲，单芽质量很差）作出评价。（四） 生根培养本实验是以1/2MS+0.2mg/LNAA+0.5mg/L6-BA+50g/L蔗糖作为生根基础培养基进行试验。方法如下：在无菌条件下将高1cm以上的增殖芽从丛生芽块上切成单株作为生根苗(不要留愈伤组织)接种到配置好的生根培养基中进行培养。每隔两天进行观察记录生长情况，培养25-35d进行观察统计苗高和生长状态评价（判定标准：健壮：苗高均匀且生长状态好，抽出的新叶多，叶片展开；一般：生长状态比较好，但抽出新叶不多，叶片大多展开；较差：细长、生长不均匀且生长状态不理想；差：抽出新叶少，叶片卷曲） 。 五、实验结果1.兰州百合鳞片初代培养诱导生芽的结果 2不定芽继代培养的结果3. 生根培养的结果六、分析讨论七、结论
