1、学 科 名 称肿 瘤 学 实验 研 究 学 科 代 码 3206010学 科 类 别 5 1.数 理 2.电 子 信 息 3.化 学 化 工 4.材 料 工 程5.医 疗 卫 生 6.生 物 农 林 7.其 他河 南 省 基 础 与 前 沿 技 术 研 究 计 划 项 目申 请 书项目名称：RNA 干扰沉默 DNA pol 基因对乳腺癌生物学行为的影响 申 请 者： 王志举 申请单位（签章）： 郑州大学 协作单位： 推荐部门（签章）： 河南省教育厅 联系电话： 13937163192 电子信箱： 通讯地址： 郑州市科学大道 100 号 邮政编码： 450001 填报日期： 2011 年 08
2、 月 31 日河 南 省 科 学 技 术 厅 制填 报 说 明1 根 据 河 南 省 基 础 与 前 沿 技 术 研 究 计 划 管 理 办 法 ， 申 报 河 南 省 基 础 与 前 沿技 术 研 究 计 划 项 目 必 须 填 报 河 南 省 基 础 与 前 沿 技 术 研 究 计 划 项 目 申 请 书 。2 “申 请 书 ”的 各 项 内 容 应 认 真 填 写 ， 表 述 准 确 ， 实 事 求 是 。 其 中 引 用 的 名 称 、数 据 等 内 容 均 应 标 明 出 处 ， 外 来 语 要 同 时 用 原 文 和 中 文 表 达 ， 第 一 次 出 现 的 缩 写 词须 注 明
3、 全 称 。3 封 面 右 上 角 “项 目 类 别 ”栏 由 申 请 者 填 写 ,“学 科 名 称 ”及 “学 科 代 码 ”请根 据 申 报 项 目 所 属 学 科 ， 按 最 新 国 家 标 准 “学 科 分 类 与 代 码 表 ”， 填 至 三 级 学 科 分支 。 若 为 省 级 及 以 上 重 点 实 验 室 须 注 明 重 点 实 验 室 名 称 。4 基 础 研 究 是 指 以 认 识 自 然 现 象 、 探 索 自 然 规 律 为 目 的 ， 不 直 接 考 虑 应 用 目 标的 研 究 活 动 ； 应 用 基 础 研 究 是 指 有 广 泛 应 用 前 景 ， 但 以 获
4、 取 新 原 理 、 新 知 识 、 新 方法 为 主 要 目 的 的 研 究 ； 前 沿 技 术 是 指 有 产 业 化 前 景 ， 以 获 取 具 有 当 代 国 际 国 内 前 沿的 新 工 艺 、 新 技 术 、 新 方 法 为 主 要 目 的 研 究 。 “项 目 名 称 ”应 确 切 反 映 研 究 内 容 和范 围 ， 最 多 不 超 过 25 个 汉 字 （ 包 括 标 点 符 号 ） ； “申 请 者 ”是 指 申 请 项 目 实 际 主 持人 。5 在 读 （ 含 在 职 ） 研 究 生 和 申 请 单 位 的 兼 职 科 研 人 员 不 得 作 为 申 请 者 提 出 申
5、 请 ，但 可 作 为 项 目 组 成 员 参 加 研 究 。6 不 具 有 副 高 以 上 专 业 技 术 职 务 或 硕 士 以 上 学 位 的 申 请 者 ， 须 有 两 名 具 有 正 高专 业 技 术 职 务 的 同 行 专 家 推 荐 。7. 若 项 目 申 请 者 有 协 作 单 位 ， 请 填 协 作 单 位 概 况 ， 且 必 须 在 本 项 目 “申 请 书 ”后 附 合 作 协 议 （ 合 同 ） 。8 “申 请 书 ”打 印 规 格 统 一 使 用 A4 纸 ， 4 号 宋 体 字 ， 于 左 侧 装 订 成 册 。 纸 质 材料 一 式 五 份 与 电 子 文 档 一
6、 并 报 送 。一、项目概况项目名称 RNA 干扰沉默 DNA pol 基因对乳腺癌生物学行为的影响起止年限 2012 年 01 月 至 2014 年 12 月单位名称 郑州大学单位性质 3 1、企业 2、科研院所 3、高等学校 9、其他企 业 登 记注 册 类 型 1 、 国 有 企 业 2、 集 体 企 业 3、 股 份 合 作 企 业 4、 联 营 企 业 5、 有 限 公 司6、 股 份 有 限 公 司 7、 私 营 企 业 8、 港 澳 台 投 资 企 业 9、 外 商 投 资 企 业地 址 郑州市科学大道 100 号郑州大学基础医学院所在省级产业集聚区联 系 人 庄东刚 电话(手机
7、) 67781103 传真 67781696 邮编 450000职工总数 6000 技术人员 4500 中高级技术人员 3220主要参加人员（含主持人）姓名 性别 出生年月 学历 从事专业职称（职务）王志举 男 1970.10 博士研究生 生理学 副教授赵文超 男 1973.08 博士研究生 生理学 讲师申请单位概况樊红琨 女 1974.09 硕士研究生 生理学 讲师单位名称 单位性质 1、企业 2、科研院所 3、高等学校 9、其他企业登记注册类型 1 、 国 有 企 业 2、 集 体 企 业 3、 股 份 合 作 企 业 4、 联 营 企 业 5、 有 限 公 司6、 股 份 有 限 公 司
8、 7、 私 营 企 业 8、 港 澳 台 投 资 企 业 9、 外 商 投 资 企 业所在省级产业集聚区地 址联 系 人 电话 传真 邮编职工总数 技术人员 中高级技术人员主要参加人员姓名 性别 出生年月 学历 从事专业职称（职务）协作单位概况二、项目的立项依据、研究内容和研究目标1本项目研究的意义及同类研究工作国内外研究现状与存在的问题，并列出主要参考文献：乳腺癌是妇女常见的恶性肿瘤，全世界每年有一百万妇女患病，自 20 世纪 70 年代末开始，我国乳腺癌的发病率在女性肿瘤中一直居首位，从 5 年前的十万分之十七增加到去年的十万分之五十二，呈快速上升趋势，而且 发病年龄也越来越年轻化。乳腺癌
9、是一种多基因异常疾病，涉及癌基因的过表达和抑癌基因的突变、缺失等多环节。其相关的分子机制尚不十分明确 1。目前手术仍是治疗乳腺癌最主要而有效的手段，但 5 年生存率一直未有明显提高。随着分子生物学的发展， 肿瘤的基因治疗取得了明显的进展，通过将目的基因导入肿瘤细胞内来修正或封闭体内异常基因的表达，或表达某种特定蛋白质，以达到抑制肿瘤生长或逆转、 杀死肿瘤细胞的目的。研究表明，DNA 修复基因 发生突变、功能异常以及表达水平的改 变均可以引起癌基因、抑癌基因突变的积累从而导致肿瘤的发生 2。正常细胞具有一系列完整的 DNA 损伤修复系统，但肿瘤细胞 DNA 损伤后的修复能力会 发生变异。DNA
10、聚合酶 （DNA pol ）广泛存在于哺乳动物细 胞核内，是单条肽链小分子蛋白质，相对分子量 39 kd，为真核细胞中最小的 DNA 聚合酶。人 DNA pol 基因全 长 33 kb，位于第 8 号染色体，是单拷贝基因，有 14 个外显子和 13 个内含子，是一种看家基因，在从酵母到哺乳 类细胞中高度保守。其生物学功能主要表现在参与 DNA 碱基切割修复和 错配修复及跨损伤 DNA合成，是 DNA 修复的主要聚合 酶之一，但它没有 35的校读功能，在 DNA 合成中复制保真度最低 3。在正常情况下，DNA pol 的表达保持着持续的低水平，其作用被限制在碱基切割修复（BER ）的修复合成中，
11、以保持基因 组稳定。Srivastava 等 4,5采用定量免疫印记法检测人肿瘤细胞中 DNA pol 基因表达，发现在结肠癌、乳腺癌和前列腺癌组织中 DNA pol表达水平高于正常粘膜组织。在高表达的情况下，DNA pol 活力和 BER 的能力明显提高，干扰 了其它高特异性 DNA 聚合酶的功能，在修复、复制、重组等过程中产生了DNA pol 催化的缺口填 补，由于 pol 的低保真度，从而掺入了不正确的脱氧核糖核苷酸或突变的碱基类似物，因此可造成自发突变的增加，导致肿瘤的发生。另外，高表达的 DNA pol 能与 pol 、 相竞争，参与 DNA 的复制中的后随链的合成，由于 DNA p
12、ol 较低的复制保真度，导致遗传的不稳定性和细 胞的自发突变率升高 6,7,8，成为介导肿瘤发生及肿瘤化疗中一些抗癌药物耐受产生的重要分子机制 9,10。因此寻求有效干预DNA pol 过 表达并使其呈现适宜水平表达的线索和途径，对于肿瘤的有效干预防治具有重要理论和实用意义。随着分子生物学技术的发展，基因治疗这一新型的治疗技术引起人们广泛的关注。目前使用基因治疗抑制异常基因或病毒癌基因表达的方法主要有核酶、反义核酸和 RNA干扰。RNA 干扰(RNA interference, RNAi)是指将外源双链 RNA (double-stranded RNA, dsRNA)导入细胞后引起与其序列同源
13、的特异基因 mRNA 的降解，从而导致靶基因的表达沉默，产生相应的功能表型缺失。这一现象属于转录后的基因沉默机制(Post transcriptional gene silencing, PTGS)11。外源或内源产生的 dsRNA 进入细胞后，被高度保守的 RNase-III 家族中的 Dice 的核酸内切酶识别并切割成 21-23nt 的小干扰 RNA (siRNA)（Dicer 是 Rnase 家族中特异识别双链 RNA 的一员，能以一种 ATP 依赖的方式逐步切割由外源导入，或由转基因、病毒感染等方式引入的双链 RNA），这些 siRNA 与RNAi 特异性酶结合，形成 RNA 诱导的
14、沉默复合体(RNA-induced silencing complex, RISC) 12，而后 RISC 在 siRNA 反义链的指导下与 siRNA 同源靶 RNA 相结合，并在距离 siRNA 3端 12 个碱基的位置切割 mRNA，达到抑制靶基因表达的作用 13。与其它方法相比，RNA 干扰具有抑制基因表达效率高、作用持续时间长，甚至可以持续到下一代，具有基因序列特异性、不受注射部位影响等优点 14。因此， 应用 RNA 干扰技术抑制目的基因的表达来进行恶性肿瘤的基因治疗具有广泛的应用前景。由于 RNA 干扰在基因组学研究方面具有类似基因敲除的作用，因此国外很多研究机构纷纷把研究重点投
15、向 RNAi 技术， RNAi 的技术方法包括 20：化学合成；体外转录；长片段 dsRNAs 经 RNase III 酶类降解；siRNA 表达载体或者病毒载体在细胞中表达 siRNA；PCR 制 备的 siRNA 表达框在细胞中表达。siRNA 表达载体法是众多方法中唯一可以进行长期研究的方法，带有抗生素标记的载体可以在细胞中持续抑制靶基因的表达 15,16。基此，本研究拟利用分子克隆技术，构建 DNA pol 靶向 siRNA 真核表达载体，观察其对乳腺癌细胞 DNA pol 高表达的沉默抑制作用，并探讨沉默抑制 DNA pol 对乳腺癌细胞生物学行为的影响，以期揭示 DNA pol 在
16、乳腺癌 细胞内的适宜功能状态，为乳腺癌的干预防治提供新的线索。此方面的研究国内外均未见报道，该研究拟为乳腺癌的治疗寻到突破性方法提供一种新的途径。参考文献：1. Teschendorff AE, Caldas C. The breast cancer somatic mutaome: tackling the complexity J. Breast Cancer Res, 2009, 11(2): 301-306.2. Neijenhuis S, Verwijs-Janssen M, van den Broek LJ, et al. Targeted radiosensitization o
17、f cells expressing truncated DNA polymerase beta.Cancer Res,2010,70(21):8706-14.3. Zhao GQ, Wang L, Dong ZM.Preliminary study of DNA polymerase beta gene silencing by small interfering RNA in human gastric cancer BGC-823 cells. Zhonghua Zhong Liu Za Zhi, 2008, (10):729-32. 4. Berquist BR, Singh DK,
18、Fan J, Kim D, et al.Functional capacity of XRCC1 protein variants identified in DNA repair-deficient Chinese hamster ovary cell lines and the human population. Nucleic Acids Res, 2010, 38(15):5023-35.5. Yu E, Gaucher SP, Hadi MZ，Probing conformational changes in Ape1 during the progression of base e
19、xcision repair. Biochemistry, 2010, 49(18):3786-96.6. Tang JB, Goellner EM, Wang XH, et al. Bioenergetic metabolites regulate base excision repair-dependent cell death in response to DNA damage. Mol Cancer Res,2010,8(1):67-79.7. Balusu R, Jaiswal AS, Armas ML, et al. Structure/function analysis of t
20、he interaction of adenomatous polyposis coli with DNA polymerase beta and its implications for base excision repair. Biochemistry, 2007, 46(49):13961-74. 8. Jaiswal AS, Banerjee S, Aneja R, et al.DNA Polymerase as a Novel Target for Chemotherapeutic Intervention of Colorectal Cancer. PLoS One, 2011,
21、 6(2):e16691.9. Jaiswal AS, Banerjee S, Panda H, et al.A novel inhibitor of DNA polymerase beta enhances the ability of temozolomide to impair the growth of colon cancer cells. Mol Cancer Res, 2009, 7(12):1973-83.10. Sun P,Gao J,LiuYL, etal .RNA interference (RNAi)-mediated vascular endothelial grow
22、th factor-C (VEGF-C) reduction interferes with lymphangiogenesis and enhances epirubicin sensitivity of breast cancer cellsJ.Mol Cell Biochem, 2008, 308(1/2): 161-166.11. March JC, Bentley WE. RNAi-based tuning of cell cycling in Drosophila S2 cells effects on recombinant protein yield J.Appl Microb
23、iol Biotechnol, 2007, 73(5): 1 128-1134.12. Colombo R, Moll J.Target validation to biomarker development: focus on RNA interference. Mol Diagn Ther, 2008, 12(2):63-70.13. Tskeshita F, Ochiya T.Therapeutic potential of RNA interference against cancer. Cancer Sci, 2006, 97(8):689-696.14. Huang C, Li M
24、,Chen C,et al.Small interfering RNA therapy mechanism, Potential targets, and clinical applications. Expert Opin Ther Targets, 2008, 12(5):637-645.15. Zhang K, Chen D, Wang X,et al. RNA interference targeting slug increases cholangiocarcinoma cell sensitivity to cisplatin via upregulating PUMA. Int
25、J Mol Sci, 2011, 12(1):385-400.16. De Frana NR, Mesquita D, Lima AB, et al. RNA interference: a new alternative for rheumatic diseases therapy.Rev Bras Reumatol, 2010, 50(6):695-702.2本项目的主要研究内容： 分别采用 实时荧光定量 PCR 法和 Western-blotting 法检测乳腺癌组织、癌旁乳腺正常组织及乳腺癌细胞系 MCF-7 中 DNA pol mRNA 的基因表达及 DNA pol蛋白表达，进一步明
26、确其高表达与淋巴结转移以及肿瘤分化程度的关系。 根据 Gene Bank 中 DNA pol 基因的全长序列，参考 siRNA 设计原则,利用以下网址(http:/ http:/www2.takara-bio.co.jp/sirna-d/top.php，设计、合成并筛选有效抑制人乳腺癌细胞 DNA pol 表达的 siRNA 序列，构建重组 Pslience 2.0-DNA pol siRNA 真核表达载体。 将靶向 Pslience 2.0-DNA pol siRNA 真核表达 载体转入乳腺癌细胞系 MCF-7，采用噻唑蓝法（MTT）和 Transwell 细胞迁移实验法，观察其对 MCF-
27、7 细胞的增殖能力及、迁移活性的调节作用，从 细胞水平探讨 DNA pol 对乳腺癌的生物学行为的影响。 将转染了靶向 Pslience 2.0-DNA pol siRNA 真核表达载体的乳腺癌细胞系MCF-7 接种到裸鼠腋下，通过观察靶向 Pslience 2.0-DNA pol siRNA 对人乳腺癌荷瘤裸鼠瘤体的治疗作用，在动物体内进一步证实 DNA pol 对乳腺癌的生物学行为的影响 3项目的预期研究结果或目标及提供形式。如系理论成果，应写明在理论上解决哪些问题及其科学意义；如系应用性成果或基础性资料，应写明其应用前景：预期研究结果：（1） 从细胞水平探明 DNA pol 对乳腺癌的生
28、物学行为的影响。（2） 探讨靶向 DNA pol siRNA 对人乳腺癌荷瘤裸鼠瘤体的治 疗作用。研究结果的提供形式（1）发表高质量的学术论文 2-3 篇。（2）培养 2-3 名研究生。研究结果的科学意义乳腺癌是一种多基因异常疾病，涉及癌基因的过表达和抑癌基因的突变及缺失，已成为威胁人类健康的主要疾病之一。目前手术仍是治疗乳腺癌最主要而有效的方法，但是 5 年生存率一直未有明显提高。DNA pol 主要参与 DNA 碱基切割修复、 错配修复和跨损伤 DNA 合成，但它没有35的校读功能，在 DNA 合成中复制保真度最低。资料显示，乳腺癌组织中 DNA pol 表达水平高于正常乳腺组织。本研究
29、拟采用实时荧 光定量 PCR 和 western blotting方法测定乳腺癌组织和细胞系中 DNA pol 的表达，进一步探明 DNA pol 高表达与乳腺癌的关系；通过构建重组靶向 DNA pol siRNA 真核表达载体，并分别将其导入乳腺癌细胞系 MCF-7 和注入乳腺癌荷瘤裸鼠中， 观 察靶向 DNA pol siRNA 对乳腺癌细胞生物学行为的影响，探 讨以小干扰 RNA（Small interference RNA, siRNA）介导的RNAi 用于乳腺癌治疗的可行性，期望能为乳腺癌的基因治疗找到新的靶点及方向。研究结果的应用前景在最近的几年中，RNAi 现象被广泛地发现于真菌
30、、水媳、 涡虫、锥虫、斑 马鱼等大多数真核生物中。这种存在揭示了 RNAi 很可能是出现于生命进化的早期阶段。自 RNAi技术诞生以来，作为基因沉默的一种新技术，不 仅用于基因功能分析，而且作 为一种基因治疗方法，已获得成功。人们形象地称用 RNAi 技术可使基因敲低或使基因静寂。一些科学家预测，这种 RNAi 技术比基因敲除技术更方便快捷地显示出基因的功能，有希望用于治疗某些由于特定基因表达过度引起的疾病，或者可抑制病毒或寄生病原性蛋白表达引起的疾病，尤其有希望用于抑制癌基因或突变基因引起的癌症的基因治疗之中。针对各种癌基因设计其特异性 siRNA，抑制其基因和蛋白表达，进而消除其在肿瘤中的
31、作用，不仅可在乳腺癌治疗中尝试，更可推广到其他肿瘤的基因治疗，有着广 阔的应用前景。siRNA 介导的 RNAi 用于哺乳动物细胞的基因抑制，效果显著，特异性强，作用迅速，未见不良反应，是一种特异性失活功能基因的好方法，将在基因功能的研究中得到广泛应用。三、研究方法和技术路线1拟采取的理论分析、计算、实验方法和步骤及其可行性：研究方法和步骤：本课题拟采用的实验方法涉及组织病理学、细胞生物学和分子生物学等前沿技术，包括细胞培养、免疫组织化学、质粒的构建和转染、 western blotting、FQ-PCR、和裸鼠荷瘤动物模型建立等技术。（1）采用实时荧光定量 PCR 和 Western-blo
32、tting 法检测 乳腺癌组织、癌旁乳腺正常组织及乳腺癌细胞系中 DNA pol 的表达（2）构建并筛选有效抑制人乳腺癌细胞靶向 DNA pol siRNA 真核表达载体（3） 观察靶向 DNA polsiRNA 真核表达载体对人乳腺癌细胞系 MCF-7 增殖、迁移活性的调节作用，从细胞水平探讨 DNA pol 对乳腺癌的生物学行为的影响。（4）观察靶向 Pslience 2.0-DNA polsiRNA 真核表达载体对人乳腺癌荷瘤裸鼠瘤体的治疗作用，在动物体内进一步证实 DNA pol 对乳腺癌的生物学行为的影响。可行性分析：1. 课题组在 DNA pol 与肿瘤癌变机制的研究领 域已有大量
33、工作积累， 为本项目的研究打下了良好的工作基础：先后完成与 DNA pol 相关课题两项，其中国家自然科学基金项目一项（30471952），省重点项目一项(2007310020)。并在国际上首次发现食管癌中存在 pol 的突变，已初步 总结出 pol 在食管癌中的突变特征和规律，发现了与其它癌中不同的 pol 变异点和大片段缺失 现象。同 时在胃癌、肺腺癌和前列腺癌等组织上均发现了 DNA pol 的高表达。2. 本课题的难点是靶向 DNA pol siRNA 重组载体的构建。在前期的研究工作中，我们成功构建了肺腺癌的靶向 DNA pol siRNA 重组载体，已 经积累了一定的经验，此外我们
34、还完成了野生型 DNA pol siRNA 质粒的构建，为完成本课题研究提供了坚实的基础。3. 课题组成员梯队合理，敬业负责，熟 练掌握蛋白、核酸分析等研究技 术。2研究工作的整体安排：（1）课题如获批准将立即组织实施计划用三年时间完成（2）年度计划安排： 2012.01-2012.06： 购买所需 试剂。 完成乳腺癌和癌旁正常乳腺组织标本的收集。 完 成 乳腺癌、癌旁正常乳腺 组织和乳腺癌细胞系 MCF-7 中 DNA pol 蛋白 表达的研究，并进行阶段性总结。 2012.07-2012.12： 建立稳定的 pol 基因 FQ-PCR 检测技术，完成进行乳腺癌、癌旁正常乳腺组织和乳腺癌细胞
35、系 MCF-7 中 DNA pol mRNA 基因表达的测定， 并进行阶段性总结。 完成 DNA pol 基因靶向的编码短发卡样 siRNA 的单链 DNA 模板的设计，合成 DNA pol 的小发卡 RNA。 完成 Pslience 2.0-DNA pol 基因靶向 siRNA 表达 载体的构建、 鉴定、筛选、大量包装与纯化，并进行阶段性总结。 2013.01- 2013.09： 完 成 Pslience 2.0-DNA pol siRNA 表达载体转染人乳腺癌 细胞 MCF-7，并检测转然后 MCF-7 细胞中 DNA pol mRNA 的基因表达。 完成转染后 各组 MCF-7 细胞中
36、DNA pol 的蛋白表达。 完成转然后各 组 MCF-7 细胞的增殖能力和 Transwell 细胞迁移实验研究，并进行阶段性总结。 2013.10- 2014.06： 建立人乳腺癌荷瘤裸鼠动物模型。 完成瘤体注射 Pslience 2.0-DNA pol siRNA 后，荷瘤鼠瘤体组织 DNA pol mRNA 基因表达研究。 完成瘤体注射 Pslience 2.0-DNA pol siRNA 后，荷瘤鼠瘤体组织 DNA pol蛋白表达研究。 2014.07- 2014.12：数据资 料分析、总结、论文撰写及成果鉴定四、实现本项目预期目标已具备的条件1实施本项目的工作基础及已有的主要仪器设
37、备；尚缺的仪器设备及解决途径：工作基础：申请者所在的河南省分子生物学重点实验室，先后完成与 DNA pol 相关课题两项，其中国家自然科学基金项目一项（30471952），省重点项目一项(2007310020)。在 DNA pol 与肿瘤癌变机制的研究领域已有大量工作积累。（1）在国际上首次发现食管癌中存在 DNA pol 的突变，已初步 总结出 DNA pol 在食管癌中的突变特征和规律，发现了与其他癌中不同的 DNA pol 变异点和大片段缺失现象。（2）在胃癌、肺腺癌和前列腺癌等组织上发现了 DNA pol 的高表达。（3）完成了野生型 DNA pol siRNA 质粒的构建。（4）本课
38、题的难点是靶向 DNA pol siRNA 重组载体的构建。在前期的研究工作中，申请者成功构建了肺腺癌的靶向 DNA pol siRNA 重 组载体，已经积累了一定的经验。（5）完成了食管正常、癌前及癌变组织中 DNA 聚合 酶 mRNA 的检测:Journal of Zhengzhou University (Medical Sciences), 2005, 40(4)（6）完成了肺腺癌细胞系 A549 中 DNA 聚合酶 的表达：西安交通大学学 报(医学版),2007,28(4)；完成了 DNA 聚合酶 靶向 siRNA 真核表达载体的构建和鉴定:Journal of Zhengzhou
39、University (Medical Sciences), 2010, 45(6) （7）完成了卵巢癌组织中 DNA 聚合酶 检测：中国现代医学杂志,2008,18(11)主要仪器设备：申请者所在河南省分子生物学重点实验室包括一下设备：1.分子生物学实验室(200M 2)：可提取基因片段， PCR 扩增， 质粒转导和转染，DNA 序列分析，蛋白质纯化等各种分子生物学操作2.细胞生物治疗室(120M 2)：按国家 GMP 标准建造。用于细胞培养及生物治疗研究。3.免疫室(60M 2)：4.实验动物室（120M 2）： 可进行包括裸鼠在内的各种 动物的饲养和实验。5.仪器设备：荧光定量 PCR
40、仪、原位 PCR 、普通 PCR 仪：美国-80低温冰箱： 英国低温超速离心机： 日本低温高速离心机： 德国自动凝胶扫描分析系统： 美国流式细胞仪： 美国万能显微镜： 日本全自动紫外分光光度计： 日本液闪仪： 美国DNA 序列分析仪： 日本CO2 培养箱： 美国2申请者和项目组主要成员的主要学历和研究工作简历，近期发表的与本项目有关的主要论著和科研成果名称及获奖情况：王志举，生理学副教授，2007 年郑州大学病理与病理生理学专业博士毕业， 获得医学博士学位。博士期间参与国家自然科学基金项目 DNA 聚合酶 与食管癌癌变机理关系的研究（30471952）。2008.11-2009.2 在香港中文
41、大学上皮细胞研究中心学习， 2009.11-2010.5 在日本 Asahikawa medical university 生理教研室做 访问学者。自 1997 年以来一直从事肿瘤发病机制的研究，熟练掌握肿瘤细胞的培养和建系、PCR，Western blotting、质粒构建、转染以及动物实验等技术。 获得省部级成果二项， 厅局级成果二项。近期发表论文：1. Zhiju wang, min Li, Guoqiang Zhao, Ziming Dong. Establish of human multidrug resistant lung adenocarcinoma cell subline
42、s (A549/P). Cell Biology International, 2006 (30) S28 2. 王志举,樊红琨,李敏,赵国强,董子明.紫杉醇诱导人肺腺癌多药耐药细胞系的建立及DNA pol , mdr 1, mrp1, GST-, lrp 和 topo II 基因的表达.西安交通大学学报,2007,28(4):358-363 3. Zhiju wang, min Li, Guoqiang Zhao, Ziming Dong. Establishment and characterization of lung adenocarcinoma cell lines with mu
43、ltidrug resistance. Life science, 2007,4(1):13-16 4. 王志举, 李敏, 赵国强, 董子明.人肺腺癌紫杉醇耐药细胞系 DNA pol 的表达.山东医药,2007,47(1):19-20 5. 赵春临,王志举,樊红琨等.DNA 聚合酶 靶向 siRNA 真核表达载体的构建和鉴定. 郑州大学学报(医学版),2010,45(6):999-1001 通讯作者6. 方明珠, 王志举, 赵国 强, 董子明.卵巢癌组织中 DNA 聚合酶 检测.中国现代医学杂志. 2008,18(11):1493-14957. 李 敏, 王志举, 李文涛, 董子明.人食管癌顺
44、铂耐药细胞系 Ec9706/cDDP 的建立及其生物学特性. 世界华人消化杂志,2006,14(34):3257-32608. Zhiju wang, Wenchao Zhao, Ming Yan, Dongxiao Duan, Ying Xing. Effects of sleep deprivation on the plasma insulin and blood glucose. Cell biology international, 2005,29(10):S7 9. Zhao WC, Duan DX, Wang ZJ, Tang N, Yan M, Zhang GH, Xing Y
45、. The underlying cellular mechanism in the effect of tetramethylpyrazine on the anion secretion of colonic mucosa. Jpn J Physiol., 2005, 55(6):325-9.10. Wenchao Zhao, Zhiju wang, Ming Yan, Dongxiao Duan, Ying Xing. Effects of sleep deprivation on anion secretion by the colon in rats. Cell biology in
46、ternational, 2005,29(10):S10 11. 司金超,王志举,樊红琨.颈淋巴管阻塞对脑缺血 BBB 通透性和 MMP-9 表达的影响. 神经解剖学杂志,2010,26(2): 155-160著 作 ：1. 王 志 举 独 著 .生 理 学 . 光明日报出版社，2007 年，标 准 书 号 ：ISBN 978-7-80145-435-52. 章 茜 主 编 ，王 志 举 副 主 编 .Medical physiology.河 南 科 学 技 术 出 版 社 ，2009年 ，标 准 书 号 ：ISBN 978-7-5349-4202-03. 王 志 举 合 著 .临 床 生 理
47、 学 . 郑 州 大 学 出 版 社 ，2004 年 ，标 准 书 号 ：ISBN 7-81048-958-5/R.6 获 奖 ：邢莹、章茜、王书春、 乔鹏、梁平、孙保全、王雨若、王志 举： “一 氧 化 氮 合 成 抑 制 对 睡眠 的 影 响 ”2004 年 获 得 河 南 省 科 学 技 术 进 步 二 等 奖 。证 书 号 ： 2004-J-138-R08/08赵 文 超 ，生 理 学 讲 师 ，2010.10 在 香 港 中 文 大 学 获 得 医 学 博 士 学 位 。熟 练 掌 握 质粒 的 构 建 、转 染 、siRNA 的 设 计 合 成 等 分 子 生 物 学 技 术 。近
48、 期 发 表 的 文 章1. Zhao WC, Wu X, Xie H, Ke Y, Yung WH. Permissive role of insulin in the expression of long-term potentiation in the hippocampus of immature rats. Neurosignals, 2011 Feb 22. Epub ahead of print2. Cheng L, Chen H, Yao X, Qi G, Liu H, Lee K, Lee K, Zhang J, Chen S, Lin X, Zhao WC, Li J, Li M. A plant-derived remedy for repair of infarcted heart. PLoS One, 2009,4(2):4461-4465.3. Zhao WC, Duan DX, Wang Z
