灌木辣椒种质鉴定技术规程SSR分子标记法.doc

1、ICS 点击此处添加中国标准文献分类号DB 江 西 省 地 方 标 准DB 36/ XXXXXXXXX灌木辣椒种质鉴定技术规程SSR 分子标记法Identification of Capsicum frutescens germplasmSSR marker method点击此处添加与国际标准一致性程度的标识（送审稿）（本稿完成日期：2019-1-22）XXXX - XX - XX 发布 XXXX - XX - XX 实施江 西 省 质 量 技 术 监 督 局 发 布DB36/ XXXXXXXXX1目 次前言 .21 范围 32 规范性引用文件 33 术语和定义 34 原理 45 仪器设备与主

2、要试剂耗材 46 溶液配制 47 核心引物 48 参照种质 49 操作程序 410 指纹比对 .711 结果判定 .7附 录 A8附 录 B.11附 录 C.13附 录 D.14DB36/ XXXXXXXXX2前 言本标准编写规则符合 GB/T 1.1-2009标准化工作导则 第 1 部分：标准的结构和编写的规定。本标准由江西省农业厅提出并归口。本标准起草单位：江西省农业科学院蔬菜花卉研究所。本标准主要起草人：周坤华、方荣、陈学军、袁欣捷、郭丽虹、罗海平、黄国东、袁青云、涂年生。DB36/ XXXXXXXXX3灌木辣椒种质鉴定技术规程 SSR 分子标记法1 范围本标准规定了利用简单重复序列（S

3、imple sequence repeats，SSR）分子标记法快速鉴定灌木辣椒（Capsicum frutescens L.）种质技术有关的术语和定义、仪器设备与主要试剂耗材、溶液配制、核心引物、参照种质、操作步骤、指纹比对和结果判定。本标准适用于灌木辣椒（Capsicum frutescens L.）种质的 SSR 分子指纹比对鉴定。2 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本规程，凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T 3543.2 农作物种子检验规程。3 术语和定

4、义下列术语和定义适用于本标准。3.1 待测种质待鉴定的疑似灌木辣椒种质，由送检人提供。3.2 参照种质用于与待测种质进行指纹比对的若干标准灌木辣椒种质和一年生辣椒种质。3.3 核心引物多态性好、PCR 扩增稳定的一套 SSR 引物。3.4 指纹图谱采用 SSR 核心引物（或相当于核心引物）扩增出的待测种质和参照种质的 DNA 片段，通过变性聚丙烯酰胺电泳，得到不同大小的 DNA 片段图谱。DB36/ XXXXXXXXX43.5 指纹比对将待测种质与参照种质的 SSR 指纹图谱进行比对，分析待测种质与参照种质的 SSR 指纹是否有差异，并确定其大小。4 原理SSR 分子标记，广泛分布于辣椒基因组

5、中。不同种质间每个 SSR 位点重复单位的数量可能不同，因而形成 SSR 标记多态性。由于每个 SSR 位点两侧的序列一般是相对保守的单拷贝序列，因此可根据其两侧的序列设计一对特异引物，利用 PCR 技术对两条引物间的 DNA 序列进行扩增。通过电泳分离得到大小不同的扩增产物片段，经硝酸银染色加以区分。因此，根据 SSR 位点的多态性，利用 PCR扩增和电泳技术可以鉴定灌木辣椒品种。5 仪器设备与主要试剂耗材仪器设备及试剂、耗材参见附录 A。6 溶液配制溶液配制方法参见附录 B。7 核心引物核心引物相关信息见附录 C。8 参照种质参照种质参见附录 D。在进行等位变异检测时，应同时包括相应参照品

6、种。9 操作步骤9.1 样品准备种子样品的扦样和保存，按照 GB/T 3543.2 的规定执行。取待测种质和参照种质的新鲜、幼嫩、健康叶片 1 片，每个种质取 10 个个体，混合制样并做好标DB36/ XXXXXXXXX5记，用纱布包好并置于液氮罐中。9.2 DNA 提取9.2.1 待测种质和参照种质采用改良 CTAB 法提取 DNA，步骤如下：a）将混合样品放入研钵中用液氮磨成粉末，然后迅速用 2 ml 离心管将粉末勺进管的 2/5 处，迅速加入预热至 65的 CTAB 提取液 1 ml（加入前先加入 1%的 -巯基乙醇） ，充分混匀后将 2 ml 离心管放入 65水浴锅中，水浴 60 mi

7、n，每隔 5 min 摇荡一次，使之充分反应。b）取出离心管静置至数分钟后放入 4高速低温离心机中，13000 rpm 离心 15 min。取上清液至另一离心管，加入等体积的酚/ 氯仿/ 异戊醇（25：24：1）后，充分混匀，静置 10 min。13000 rpm 离心 10 min。c）取上清液 800 l 置于新的 1.5 ml 离心管中。加入 2/3 体积冷的异丙醇，轻晃，置于-20冰箱30 min 或者过夜。d）取出步骤 c 的离心管在 4下条件下，13000 rpm 离心 10 min，弃上清。用 75%乙醇洗涤 DNA两次，放在桌面自然晾干。e）向 1.5 ml 离心管中加入 20

8、0 l ddH2O 将 DNA 溶解，再加 5l 10mg/ml RNase A 37 水浴 60 min。加入等体积 200 l 预冷的氯仿：异戊醇（24:1）混匀，静置 10 min，12000 rpm 离心 10 min。f）取上清加入 1/10(总) 体积的 NaAc（3 mol/L） ，2 倍体积冷的无水乙醇。-20 放置 30 min 或更长时间，在 4下 13000 rpm，离心 15 min。用冷的 75%乙醇洗涤沉淀两次，放至桌面自然晾干。g）加 200 l 灭菌 1TE 溶解 DNA，并用核酸测定仪检测 DNA 浓度，将 DNA 稀释到 20 ng/l 最后将离心管放入-2

9、0冰箱保存备用。9.2.2 若采用试剂盒法提取 DNA，需按照试剂盒的说明进行提取，并按照 9.2.1 步骤 g）的方法存放。9.3 PCR 扩增9.3.1 PCR 反应体系PCR 反应体系为：总体积 10 l ，其中 1 l Buffer（10） ，0.8l Mg2+（25 mM） ，0.2 l dNTPs（10mM） ，0.4 l 上游引物（ 10mM） ，0.4 l 下游引物（ 10mM） ，0.1l Taq 酶（5U/l） ，2l DNA 模板（20ng/l ） ，5.1 l ddH 2O。9.3.2 PCR 反应程序所述 PCR 反应程序：(1)94预变性 4 min；(2)94 变

10、性 45 s；(3)按附录 C 推荐的引物退火温度DB36/ XXXXXXXXX6退火 45 s；(3)72 延伸 45 s； (5)重复步骤(2)-(4)，共 35 个循环；(6) 72延伸 10 min；(7) 4保存。9.4 PCR 扩增产物检测9.4.1 变性聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳9.4.1.1 玻璃板处理用自来水分别清洗长、短两块玻璃板洗净，晾干后用 95%的酒精淋洗玻璃板表面，晾干。用擦镜纸（或质量好的卫生纸）将 500 l 亲和硅烷工作液均匀涂在长玻璃板上，将 500 l 剥离硅烷也均匀涂在带有凹槽的短玻璃板上。等其完全反应后（约 4-5 min 后） ，用无水乙醇反复擦拭玻璃板

11、 2-3 次，除去玻璃板上多余的亲和硅烷和剥离硅烷。操作过程中防治两块玻璃板互相污染。9.4.1.2 组装玻璃板将长板平放，用厚度为 0.4 mm 干净的垫片放于玻璃板的左右两侧，将带有凹槽的短板板压于其上，并使两块玻璃底部和垫片对齐，然后用夹子夹紧两侧，用水平仪检测玻璃胶室是否水平。用样品梳反向插入，以梳子正好插入为适，不宜太紧也不宜太松，即可认为组装完好。9.4.1.3 制胶取 75 ml 6%工作胶溶液至烧杯中，加 500 l 10%过硫酸胺(APS)与 50 l TEMED 后，摇匀后迅速将胶液灌入玻璃胶室，注意防止灌入气泡。待胶室灌满后，在凹槽处鲨鱼齿朝外轻轻插入样品梳至适当位置，在

12、室温下聚合 1 h 以上。凝胶聚合后，轻轻拔出样品梳，用水冲洗清洗掉凹槽处残留的凝胶，清洗干净备用。9.4.1.4 预电泳将胶板垂直固定于电泳槽上，上槽加入约 1200 ml 的 1TBE 电泳缓冲液，约高出凹槽板 2 cm 左右，下槽加入 500 ml 的 1TBE 电泳缓冲液。再次用胶头滴管将凹槽处剩余凝胶碎片冲出。恒功率100W，设定电压 2000V 条件下预电泳 20 min。9.4.1.5 样品制备在 10 l PCR 产物加入 4 l 上样缓冲液，混匀后，在 PCR 仪上 94变性 4 min 后，取出，立即放入碎冰中冷却 10 min。9.4.1.6 点样及电泳在预电泳结束后，用

13、胶头滴管把加样孔内的气泡冲出，把梳子正向插入凝胶，齿尖入胶深度以不超过 l mm 为宜，每个加样孔加入 5 l 扩增产物，在胶板两侧点入 DNA Marker。除待测样品外，还应同时加入参照种质的扩增产物。设恒功率 60W，电压 2000V 条件下电泳，在溴酚蓝指示剂接近胶板底DB36/ XXXXXXXXX7部时，结束电泳。在电泳过程中确保胶板温度不高于 55，以免玻璃板破裂。9.4.2 银染检测采用简单快速的 DNA 银染法：a)将长、短玻璃板分开：电泳结束后，小心地将长、短玻璃板分开，聚丙烯酰胺凝胶应粘在长玻璃板上。b)洗胶：在托盘 A 中用超纯水漂洗凝胶 2 次，每次 15 s，在将玻璃

14、板取出时，让玻板竖直滴干1020 s ，再进行下一次洗涤。c)染色：在托盘 B 中加入 1.2 L 染色液，将有胶的玻板放入托盘，在摇床轻摇 10 min。d)洗胶：将胶浸入装有超纯水中的托盘 A 清洗胶面约 5 s；取出沥水后，立即放入盛有预冷显影液的托盘 C 中。e)显色：把托盘 C 放在摇床轻摇 5-7 min 至条带清晰的呈现出来，不宜显色太久，否走背景太深，影响读带。f)洗胶：用自来水冲洗玻璃板 2 min，将胶上多余的 NaOH 溶液冲去，避免其造成玻璃模糊而影响读带。g)干胶：通过热对流或室温放置，使胶变干。10 指纹比对样品每个 SSR 位点的等位变异采用扩增片段大小的形式表示

15、。根据待测种质与参照种质的 SSR条带位置，确定是否有差异，并根据 DNA Marker 和待测样品条带的位置比较分析，确定待测种质和参照种质的片段大小。11 结果判定用附录 C 中引物进行检测，若待测种质能扩增出与参照种质中的标准灌木辣椒种质相同条带时，则判定待测种质为灌木辣椒（C. frutescens）种质；若待测种质不能扩增出与参照种质中的标准灌木辣椒种质相同条带时，则判定待测种质不是灌木辣椒（C. frutescens）种质” 。DB36/ XXXXXXXXX8附 录 A（资料性附录）主要仪器设备与试剂、耗材A.1 主要仪器设备A.1.1 PCR 扩增仪器。A.1.2 高压电泳仪。A

16、.1.3 垂直电泳槽及配套的制胶附件。 A.1.4 高速冷冻离心机。A.1.5 水平摇床。A.1.6 制冰机。A.1.7 电子天平。A.1.8 微量移液器。A.1.9 核酸测定仪。A.1.10 高压灭菌锅。A.1.11 纯水仪。A.1.12 恒温水浴锅。A.1.13 磁力搅拌器。A.1.14 PH 计。A.1.15 胶片观察灯。A.1.16 微波炉。A.1.17 冰箱。A.2 主要试剂在分析中均使用分析纯试剂。A.2.1 十六烷基三乙基溴化铵（CTAB） 。A.2.2 聚乙烯吡咯烷酮（PVPP） 。A.2.3 乙二铵四乙酸二钠（Na 2EDTA2H2O） 。A.2.4 氯化钠。A.2.5 三羟

17、甲基氨基甲烷（Tris 碱） 。A.2.6 浓 HCL。DB36/ XXXXXXXXX9A.2.7 Tris 饱和酚。A.2.8 RNase A。A.2.9 -巯基乙醇 。A.2.10 氯仿。A.2.11 异戊醇。A.2.12 无水醋酸钠。A.2.13 无水乙醇。A.2.14 丙烯酰胺。A.2.15 甲叉双丙烯酰胺。A.2.16 硼酸。A.2.17 尿素。A.2.18 亲和硅烷。A.2.19 剥离硅烷。A.2.20 过硫酸铵(APS)。A.2.21 四甲基乙二胺（TEMED） 。A.2.22 甲醛。A.2.23 硝酸银。A.2.24 氢氧化钠。A.2.25 无水碳酸钠。A.2.26 98%去离

18、子甲酰胺。A.2.27 溴酚蓝。A.2.28 二甲苯青 FF。A.2.29 DNA Marker（100bp ladder） 。A.2.30 矿物油。A.2.31 Taq DNA 聚合酶。A.2.32 SSR 引物。A.2.33 dNTPs。A.2.34 10Buffer 缓冲液。DB36/ XXXXXXXXX10A.2.35 Mg2+。A.2.36 液氮。A.2.37 ddH2O，超纯水。A.3 主要耗材A.3.1 离心管（1.5 ml，2 ml） 。A.3.2 移液器配套枪头。A.3.3 配套枪头盒。A.3.4 96 孔 PCR 板。A.3.5 长、短玻璃板。A.3.6 烧杯。A.3.7

19、研钵、研棒。A.3.8 乳胶手套。A.3.9 一次性手套离心管（1.5 ml，2 ml） 。A.3.10 量筒。A.3.11 胶头滴管。A.3.12 玻璃棒。A.3.13 滤纸。A.3.14 漏斗。A.3.15 托盘。DB36/ XXXXXXXXX11附 录 B（规范性附录）溶 液 配 制B.1 DNA 提取溶液的配制B.1.1 1 mol/L Tris-HCL 溶液（ PH=8.0）称取 24.22 g Tris 碱置于 250 ml 烧杯中，加入约 160 ml ddH2O，充分搅拌，加入约 8.4 ml HCL 调PH 值至 8.0，加 ddH2O 定容至 200 ml，121高温高压灭

20、菌 20min。B.1.2 0.5 mol/L EDTA 溶液（PH=8.0 ）称取 37.22 g Na2EDTA2H2O 置于 250 ml 烧杯中，加入约 160 ml ddH2O，充分搅拌，用固体NaOH 调 PH 值至 8.0，加 ddH2O 定容至 200 ml，121高温高压灭菌 20min。B.1.3 2% CTAB 溶液称取 CTAB 20 g，NaCL 81.9 g，PVPP 10 g 置于 1000 ml 烧杯中，加入约 500 ml ddH2O 搅拌，再加入 1 mol/L Tris-HCL（PH=8.0）溶液 100 ml，0.5 mol/L EDTA（PH=8.0）

21、溶液 40 ml，65水浴溶解，加 ddH2O 定容至 1000 ml，121高温高压灭菌 20min。B.1.4 酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）溶液量取 100 ml Tris 饱和酚的下层有机相，96 ml 氯仿，4 ml 异戊醇置于棕色瓶中，充分混匀。B.1.5 氯仿/异戊醇（24:1）溶液量取 240 ml 氯仿，10 ml 异戊醇置于玻璃瓶中，充分混匀。B.1.6 3 mol/L NaAc 溶液（ PH=5.2）称取 12.34 g 无水 NaAc 置于 100 ml 烧杯中，加入约 20 ml ddH2O，搅拌溶解，用冰醋酸调 PH 值至 5.2，加 ddH2O 定容至 200

22、 ml，121高温高压灭菌 20min。B.1.7 1 TE buffer 溶液用移液器吸取 1 mol/L Tris-HCL（PH=8.0）溶液 1 ml，0.5 mol/L EDTA（PH=8.0）溶液 200 l，加 ddH2O 定容至 100 ml，121高温高压灭菌 20min。B.1.8 75% 酒精溶液量取 150ml 无水乙醇，50 ml ddH 2O 置于烧杯中，充分混匀。B.2 PCR 扩增溶液的配制B.2.1 SSR 引物稀释合成的引物（见附录 C）先在高速离心机中 5000 r/min 离心 30 s，根据引物的说明书稀释到工作DB36/ XXXXXXXXX12液浓度

23、10 mol/L。B.3 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳相关溶液的配制B.3.1 10TBE 缓冲液分别称取 Tris 碱 108 g，硼酸 55 g 置于 1000 ml 烧杯中，量取 0.5 mol/L EDTA（PH=8.0 ）溶液 40 ml，加超纯水定容至 1000 ml。B.3.2 40%丙烯酰胺凝胶溶液分别称取丙烯酰胺 380 g 和甲叉双丙烯酰胺 20 g 置于 1000 ml 烧杯中，加入 600 ml ddH2O 慢慢搅拌，37水浴溶解，定容至 1000ml，过滤，4 保存。B.3.3 6%变性聚丙烯酰胺溶液称取 420g 尿素置于 1000ml 烧杯中，再分别加入 100 ml

24、10 TBE 缓冲液和 40%丙烯酰胺凝胶溶液 150 ml，加入 600 ml ddH2O 慢慢搅拌，37水浴溶解，加超纯水定容至 1000 ml。B.3.4 10% APS 溶液称取 5g 过硫酸铵，加入 50ml ddH2O 溶解，4保存一周即更换。B.3.5 1TBE 缓冲液量取 10 TBE 缓冲液 100 ml，用超纯水定容至 1000 ml。B.3.6 上样缓冲液分别称取溴酚蓝 25 mg，二甲苯青 25 mg 置于玻璃瓶中，加入 98%去离子甲酰胺 98ml 和 0.5 mol/L EDTA（PH=8.0）溶液 2 ml，混匀。B.4 银染溶液的配制B.4.1 染色液称取硝酸银

25、 1.2 g，加超纯水定容至 1200 ml。B.4.2 显色液称取 NaOH 24 g，无水碳酸钠 0.48 g，加超纯水定容至 1200ml，4冰箱保存。显影前量取 5ml 甲醛倒入显色液中。DB36/ XXXXXXXXX13附 录 C（规范性附录）核 心 引 物核心引物见表 C.1表 C.1 核心引物编号 引物名称 引物序列(53) 退火温度 灌木辣椒扩增片段bp1 Hpms 1-106 F: TCCAAACTACAAGCCTGCCTAACCR: TTTTGCATTATTGAGTCCCACAGC 59 2003152 Hpms 1-274 F:TCCCAGACCCCTCGTGATAGR:

26、TCCTGCTCCTTCCACAACTG 60 1762523 HpmsE015 F: TTGTGAGGGTTTGACACTGGGAR: CCGAGCTCGATGAGGATGAACT 60 2103054 HpmsE100 F:AGCAGGAAACAATGACCGGAAAR: CCTACAGGAGCAATGCCTTTCG 58 320520DB36/ XXXXXXXXX14附 录 D （资料性附录）参 照 种 质参照种质名单见表D.1表 D.1 参照种质名单编号 样品名 分 类 来源编号 样品名 分 类 来 源1 定南米椒 C. frutescens 江西 10 同安小米椒 C. annuum

27、 福建2 高安小米椒 C. frutescens 江西 11 开江七星椒 C. annuum 四川3 信丰米椒 C. frutescens 江西 12 一撮椒 C. annuum 四川4 大米椒 C. frutescens 云南 13 武平甜椒 C. annuum 福建5 中 91-2 C. frutescens 云南 14 习水线椒 C. annuum 贵州6 中 92-1-1 C. frutescens 云南 15 大金条 C. annuum 四川7 中 96 C. frutescens 美国 16 梅花椒 C. annuum 辽宁8 中 97-1 C. frutescens 海南 17 特大牛角椒 C. annuum 黑龙江9 中 98-1 C. frutescens 海南 18 樱桃椒 C. annuum 云南_