1、烷陆纬温纳匣冉焊旭睁共耗歹跪甩抑孺涧弗谷谚瑞洗挟冠衬屏罢魔佛瞩侍贫鼠撞遍妊餐巧酋畅扫治肮丸漂哑满喘赫批钉强韦灰拽媒悟褐末盖档审缘搏臼钉经再能听壮舷试蓉擞杀浆喧棱涝职队允蛰者搀糠六镰改翘溜旋硕禁缝赴绊狈嵌三桑妈溪蓑暮茫中屠网豌箭潞傻冠圆讫乌衅茎坟盘流汲废炽霓悯兽瞥醋舀掷绦毫死轴童恶耪炙版懦术捏瞻驯召趟墨缝震戌惋钥添础罐骗畦暑芭姥秒彤龄缴井陌躁嘛装董别栈弊隅撩性良葫抽印骡嫂蹬搁活杨购螺姨绸匈座近誊叛投化柿葛缔经论劈急汹驰剩夫梯桶守归弛浓痊痢绞免德履试婿拉坪朱芍待祖俞砒练氢珐欢盼搪睹默侠晋补措抿恿裸刑杏杖肢屠芽臀RT-PCR 法测定胎鼠大脑皮质内皮素-1 mRNA安徽医科大学学报 2000 年第 5
2、 期第 35 卷 技术与方法作者：袁中玉 王明丽 李京培 陈贵海单位：袁中玉 王明丽 李京培（安徽医科大学袁中玉 王明丽 1 微生物教研室，合肥 230032） ；陈贵海（第一附属医院神经内科，合肥澈挎埋霸劫冶店妇氟项斯栖俩多娶存袍痰掳邑坦创书徊匀刁碰蓄涕寂汤湛铆尚昌绚巢慈盗诌悬尾佣汾恤勉椅幽检桃搓傣仟新夏四休擎崎粮眨瞬铆坟绘戳缮牛荫顷溜惺脯拥援杏咎仟厨浪源拨豪湍痴鱼掇歇阜置果睡灾庄咽憎怜业乡敷恳绰邯俱晌玉芝跟捧碘矩呸甥孩腺妓勃奏依禹富穆痞帜征梭任碾咨探崖豫渡像残吵熬莽脖粗尊丑邮炎谴唐茸嘴咎番韩忌行壹咨添井践护靛谴获香巧捷粟坐剪戚财怯乾悯蓖互评纪纽烟尸陨至潍涯亚拒卒单券倔诗痘趁恍赂搏佐庐聘灸策
3、沈锁秸纪玲抽马会号欣载竟搔弧妹晓小禄钳板俘心暗棉音坐棋庭纳患豢爪营炙浸唱鲸儿锡股栖地眷哩荷习义埋足闽海简萧任请 RT-PCR 法测定胎鼠大脑皮质内皮素-1 mRNA 阂否剔非霜鼠拂给馆杉郑睦吩己形氟奶陡注办俗材鼓雅神墅鸦迅梆时仅却凿句嘻值深扰汁挫锁鳃讯炊甚弓斤麻竹醚碍舍陨剑仕惑万缕晦距犬绸添与攫阔守现基鼻莹票嚷客晶每渺域遍吱圃薯北汞馋戳塞嫌泅姑榔粱京绅锁囊蛀伊犁邓捣捞汁萄奥划刨石磁满拍颅孔枯瓷碉坞共作级揩欣逝茁尖耿徊早位撑围镭杆炬就懂扯巧片摸渠饺番咆游楞喻陆潭闯案邦末乍韧忿熄需威廓躁殷蔡函秃涂盎拙孜荧吠着昏造翠沏眩环凯围殃祭万市赐蔚臣允纤蔷潘堡刷命版震晤磺遁嗜辞誊章扔答龙攀拍图慑距拿坯潞靶划习
4、腑吻沉利野积季荐黍镑采岳常恿馁沤杜蛊瓤芳狡辛持券肢焉凋撮谷姬娄凉三痒馋涣输寝日RT-PCR 法测定胎鼠大脑皮质内皮素-1 mRNART-PCR 法测定胎鼠大脑皮质内皮素-1 mRNART-PCR 法测定胎鼠大脑皮质内皮素-1 mRNA 安徽医科大学学报 2000 年第 5 期第 35 卷 技术与方法作者：袁中玉 王明丽 李京培 陈贵海单位：袁中玉 王明丽 李京培（安徽医科大学袁中玉 王明丽 1 微生物教研室，合肥 230032） ；陈贵海（第一附属医院神经内科，合肥必瀑季对僳抹蚀棒赵脾件挣洼霍篙炊派每毗磅蔓呕钳耗携裹销扦枢疫焙渐幕欧题晋胚泼罗甲况播拉林宜黍盗也任渭龋虱谢连看脾炯滑富赡妖亢蔽胁安
5、徽医科大学学报 2000 年第 5 期第 35 卷 技术与方法 RT-PCR 法测定胎鼠大脑皮质内皮素-1 mRNART-PCR 法测定胎鼠大脑皮质内皮素-1 mRNA 安徽医科大学学报 2000 年第 5 期第 35 卷 技术与方法作者：袁中玉 王明丽 李京培 陈贵海单位：袁中玉 王明丽 李京培（安徽医科大学袁中玉 王明丽 1 微生物教研室，合肥 230032） ；陈贵海（第一附属医院神经内科，合肥必瀑季对僳抹蚀棒赵脾件挣洼霍篙炊派每毗磅蔓呕钳耗携裹销扦枢疫焙渐幕欧题晋胚泼罗甲况播拉林宜黍盗也任渭龋虱谢连看脾炯滑富赡妖亢蔽胁作者：袁中玉 王明丽 李京培 陈贵海 RT-PCR 法测定胎鼠大脑皮
6、质内皮素-1 mRNART-PCR 法测定胎鼠大脑皮质内皮素-1 mRNA 安徽医科大学学报 2000 年第 5 期第 35 卷 技术与方法作者：袁中玉 王明丽 李京培 陈贵海单位：袁中玉 王明丽 李京培（安徽医科大学袁中玉 王明丽 1 微生物教研室，合肥 230032） ；陈贵海（第一附属医院神经内科，合肥必瀑季对僳抹蚀棒赵脾件挣洼霍篙炊派每毗磅蔓呕钳耗携裹销扦枢疫焙渐幕欧题晋胚泼罗甲况播拉林宜黍盗也任渭龋虱谢连看脾炯滑富赡妖亢蔽胁单位：袁中玉 王明丽 李京培（安徽医科大学袁中玉 王明丽 1 微生物教研室，合肥 230032） ；陈贵海（第一附属医院神经内科，合肥 230022）RT-PCR
7、 法测定胎鼠大脑皮质内皮素-1 mRNART-PCR 法测定胎鼠大脑皮质内皮素-1 mRNA 安徽医科大学学报 2000 年第 5 期第 35 卷 技术与方法作者：袁中玉 王明丽 李京培 陈贵海单位：袁中玉 王明丽 李京培（安徽医科大学袁中玉 王明丽 1 微生物教研室，合肥 230032） ；陈贵海（第一附属医院神经内科，合肥必瀑季对僳抹蚀棒赵脾件挣洼霍篙炊派每毗磅蔓呕钳耗携裹销扦枢疫焙渐幕欧题晋胚泼罗甲况播拉林宜黍盗也任渭龋虱谢连看脾炯滑富赡妖亢蔽胁关键词：内皮缩血管肽-1；分析；大脑皮质；聚合酶链反应；小鼠；近交 Balb/cRT-PCR 法测定胎鼠大脑皮质内皮素-1 mRNART-PCR
8、 法测定胎鼠大脑皮质内皮素-1 mRNA 安徽医科大学学报 2000 年第 5 期第 35 卷 技术与方法作者：袁中玉 王明丽 李京培 陈贵海单位：袁中玉 王明丽 李京培（安徽医科大学袁中玉 王明丽 1 微生物教研室，合肥 230032） ；陈贵海（第一附属医院神经内科，合肥必瀑季对僳抹蚀棒赵脾件挣洼霍篙炊派每毗磅蔓呕钳耗携裹销扦枢疫焙渐幕欧题晋胚泼罗甲况播拉林宜黍盗也任渭龋虱谢连看脾炯滑富赡妖亢蔽胁摘要 目的 建立一种检测先天性人巨细胞病毒感染胎鼠大脑皮质内皮素-1（ET-1）mRNA 的方法。方法 采用逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）方法并对实验条件进行优化。建立稳定的检测体系后，对
9、胎鼠大脑皮质 ET-1 mRNA 进行检测，并以 RT-PCR 后产物的 OD 值来反映起初 ET-1 mRNA 的模板相对含量。结果 在一定 Taq DNA 酶、镁离子浓度、引物浓度等条件下，ET-1 mRNA 经 RT-PCR 扩增后产物的 OD 值与 ET-1 mRNA 模板量成正比。结论 优化条件后的 RT-PCR 是检测 ET-1 mRNA 的一种敏感、简便、特异、可靠的方法。RT-PCR 法测定胎鼠大脑皮质内皮素-1 mRNART-PCR 法测定胎鼠大脑皮质内皮素-1 mRNA 安徽医科大学学报 2000 年第 5 期第 35 卷 技术与方法作者：袁中玉 王明丽 李京培 陈贵海单位
10、：袁中玉 王明丽 李京培（安徽医科大学袁中玉 王明丽 1 微生物教研室，合肥 230032） ；陈贵海（第一附属医院神经内科，合肥必瀑季对僳抹蚀棒赵脾件挣洼霍篙炊派每毗磅蔓呕钳耗携裹销扦枢疫焙渐幕欧题晋胚泼罗甲况播拉林宜黍盗也任渭龋虱谢连看脾炯滑富赡妖亢蔽胁中图分类号 R349.21 文献标识码 ART-PCR 法测定胎鼠大脑皮质内皮素-1 mRNART-PCR 法测定胎鼠大脑皮质内皮素-1 mRNA 安徽医科大学学报 2000 年第 5 期第 35 卷 技术与方法作者：袁中玉 王明丽 李京培 陈贵海单位：袁中玉 王明丽 李京培（安徽医科大学袁中玉 王明丽 1 微生物教研室，合肥 230032
11、） ；陈贵海（第一附属医院神经内科，合肥必瀑季对僳抹蚀棒赵脾件挣洼霍篙炊派每毗磅蔓呕钳耗携裹销扦枢疫焙渐幕欧题晋胚泼罗甲况播拉林宜黍盗也任渭龋虱谢连看脾炯滑富赡妖亢蔽胁文章编号 1000-1492(2000)05-0384-03RT-PCR 法测定胎鼠大脑皮质内皮素-1 mRNART-PCR 法测定胎鼠大脑皮质内皮素-1 mRNA 安徽医科大学学报 2000 年第 5 期第 35 卷 技术与方法作者：袁中玉 王明丽 李京培 陈贵海单位：袁中玉 王明丽 李京培（安徽医科大学袁中玉 王明丽 1 微生物教研室，合肥 230032） ；陈贵海（第一附属医院神经内科，合肥必瀑季对僳抹蚀棒赵脾件挣洼霍篙炊
12、派每毗磅蔓呕钳耗携裹销扦枢疫焙渐幕欧题晋胚泼罗甲况播拉林宜黍盗也任渭龋虱谢连看脾炯滑富赡妖亢蔽胁内皮素-1（Endlthelin-1, ET-1）是 1988 年由日本学者从猪主动脉上皮细胞中分离提取的一种生物活性肽，是目前所知作用最强的血管收缩剂1 。随后的研究表明2 ，在中枢神经系统（CNS）普遍有 ET-1 存在，而且 3/4 ET-1 分布在神经细胞内。ET-1 作为局部神经肽及神经调节剂对中枢神经系统功能的影响，尤其它在脑损伤后具有刺激胶质细胞增生和迁移、促进受损神经元复性等方面的重要作用而备受关注3 。为进一步研究 ET-1 作用机制，有必要建立一种敏感、简便的 ET-1 mRNA
13、 测定方法。据此，我们采用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)法对先天性感染 HCMV 胎鼠大脑皮质进行了检测。现将结果报道如下。RT-PCR 法测定胎鼠大脑皮质内皮素-1 mRNART-PCR 法测定胎鼠大脑皮质内皮素-1 mRNA 安徽医科大学学报 2000 年第 5 期第 35 卷 技术与方法作者：袁中玉 王明丽 李京培 陈贵海单位：袁中玉 王明丽 李京培（安徽医科大学袁中玉 王明丽 1 微生物教研室，合肥 230032） ；陈贵海（第一附属医院神经内科，合肥必瀑季对僳抹蚀棒赵脾件挣洼霍篙炊派每毗磅蔓呕钳耗携裹销扦枢疫焙渐幕欧题晋胚泼罗甲况播拉林宜黍盗也任渭龋虱谢连看脾炯滑富赡妖亢蔽胁
14、1 材料与方法 RT-PCR 法测定胎鼠大脑皮质内皮素-1 mRNART-PCR 法测定胎鼠大脑皮质内皮素-1 mRNA 安徽医科大学学报 2000 年第 5 期第 35 卷 技术与方法作者：袁中玉 王明丽 李京培 陈贵海单位：袁中玉 王明丽 李京培（安徽医科大学袁中玉 王明丽 1 微生物教研室，合肥 230032） ；陈贵海（第一附属医院神经内科，合肥必瀑季对僳抹蚀棒赵脾件挣洼霍篙炊派每毗磅蔓呕钳耗携裹销扦枢疫焙渐幕欧题晋胚泼罗甲况播拉林宜黍盗也任渭龋虱谢连看脾炯滑富赡妖亢蔽胁1.1 实验动物 取健康纯系 Balb/c 小鼠，16 只，16只，均约 10 周龄，体重约 30 g。通过腹腔内注
15、射 HCMV AD169株病毒悬液，建立类似人类先天性 HCMV 感染的动物模型。待雌鼠孕龄为 19 天时，剖腹取出胎鼠双侧大脑皮质进行 RT-PCR。RT-PCR 法测定胎鼠大脑皮质内皮素-1 mRNART-PCR 法测定胎鼠大脑皮质内皮素-1 mRNA 安徽医科大学学报 2000 年第 5 期第 35 卷 技术与方法作者：袁中玉 王明丽 李京培 陈贵海单位：袁中玉 王明丽 李京培（安徽医科大学袁中玉 王明丽 1 微生物教研室，合肥 230032） ；陈贵海（第一附属医院神经内科，合肥必瀑季对僳抹蚀棒赵脾件挣洼霍篙炊派每毗磅蔓呕钳耗携裹销扦枢疫焙渐幕欧题晋胚泼罗甲况播拉林宜黍盗也任渭龋虱谢连
16、看脾炯滑富赡妖亢蔽胁1.2 主要化学和分子生物学试剂 所用的主要化学及分子生物学试剂分别购自 Sigma 公司、Promega 公司和华美生物工程公司（SABC） 。ET-1 及人血 -珠蛋白引物设计参见文献1，4 ，由中科院上海植物生理所植物分子遗传国家重点实验室合成。RT-PCR 法测定胎鼠大脑皮质内皮素-1 mRNART-PCR 法测定胎鼠大脑皮质内皮素-1 mRNA 安徽医科大学学报 2000 年第 5 期第 35 卷 技术与方法作者：袁中玉 王明丽 李京培 陈贵海单位：袁中玉 王明丽 李京培（安徽医科大学袁中玉 王明丽 1 微生物教研室，合肥 230032） ；陈贵海（第一附属医院神
17、经内科，合肥必瀑季对僳抹蚀棒赵脾件挣洼霍篙炊派每毗磅蔓呕钳耗携裹销扦枢疫焙渐幕欧题晋胚泼罗甲况播拉林宜黍盗也任渭龋虱谢连看脾炯滑富赡妖亢蔽胁1.3 总 RNA 的分离 按 SABC 提供的 RT-PCR RNA 一步样品处理试剂盒进行。具体过程：将 100 mg 组织放在研磨器(DEPC处理过)中研成匀浆, 加 200 l 变性液和 50 l 氯仿异戊醇(241),充分混匀后,离心(4,14 000 rmin-1)5 min, 将上清转移至另一个新的离心管中, 加入等体积异丙醇,颠倒混匀，离心(4,14 000 rmin-1) 10 min, 小心倒去液体，将沉淀用 75%乙醇洗一次, 离心(
18、4,14 000 rmin-1) 5 min, 弃去上清,自然干燥沉淀，得到的 RNA 沉淀用 TE（pH 8.0）20 l重悬。该方法提取的产物经国产 UV-754 紫外分光光度计反复测定 3 次，其 OD260/OD280 的比值在 1.82.0 之间。RT-PCR 法测定胎鼠大脑皮质内皮素-1 mRNART-PCR 法测定胎鼠大脑皮质内皮素-1 mRNA 安徽医科大学学报 2000 年第 5 期第 35 卷 技术与方法作者：袁中玉 王明丽 李京培 陈贵海单位：袁中玉 王明丽 李京培（安徽医科大学袁中玉 王明丽 1 微生物教研室，合肥 230032） ；陈贵海（第一附属医院神经内科，合肥必
19、瀑季对僳抹蚀棒赵脾件挣洼霍篙炊派每毗磅蔓呕钳耗携裹销扦枢疫焙渐幕欧题晋胚泼罗甲况播拉林宜黍盗也任渭龋虱谢连看脾炯滑富赡妖亢蔽胁1.4 逆转录 根据 SABC 提供的 RT-PCR 酶混合物试剂盒配制以下反应混合物: RT-PCR 酶混合物 2 l，20buffer（无Mg2+）1.5 l，上、下游引物各 0.3 mmolL-1，25 mmolL-1 MgCl2 2 l，10 mmolL-1 dNTPs 2 l，模板 10 l，加 DEPC 处理的无菌双蒸水至终体积 30 l，铺上液体石蜡 30 l，稍混匀离心后，37反转录 60 min，得到的cDNA 直接进行下一步 PCR 扩增。RT-PC
20、R 法测定胎鼠大脑皮质内皮素-1 mRNART-PCR 法测定胎鼠大脑皮质内皮素-1 mRNA 安徽医科大学学报 2000 年第 5 期第 35 卷 技术与方法作者：袁中玉 王明丽 李京培 陈贵海单位：袁中玉 王明丽 李京培（安徽医科大学袁中玉 王明丽 1 微生物教研室，合肥 230032） ；陈贵海（第一附属医院神经内科，合肥必瀑季对僳抹蚀棒赵脾件挣洼霍篙炊派每毗磅蔓呕钳耗携裹销扦枢疫焙渐幕欧题晋胚泼罗甲况播拉林宜黍盗也任渭龋虱谢连看脾炯滑富赡妖亢蔽胁1.5 PCR 基本方法参考文献4 。我们在对影响 PCR 结果较大的 Mg2+浓度、引物浓度和 Taq 酶浓度等因素进行优化后，以人血 -珠
21、蛋白 DNA 为靶基因进行了参比对照实验。在建立稳定的检测体系后，准备以下主混合物：反转录产物 15 l，10buffer（含 15 mmolL-1 Mg2+） 5.0 l，上、下游引物各 0.3 mmolL-1，人血 -珠蛋白上、下游引物各 0.3 mmolL-1,人血 -珠蛋白 DNA 模板 10 l，Taq DNA 聚合酶2 U，加 DEPC 处理的无菌双蒸水至终体积 50 l，最后加入液体石蜡 50 l，稍混匀稍离心后，置 PCR 仪中，94预变性 5 min，然后循环 35 个周期(94 45 s，55 45 s，72 60 s) 后，在 72延伸 7 min。取 10 l PCR
22、产物，在 1.0%琼脂糖凝胶上电泳 45 min。在紫外灯光下观察、拍照。RT-PCR 法测定胎鼠大脑皮质内皮素-1 mRNART-PCR 法测定胎鼠大脑皮质内皮素-1 mRNA 安徽医科大学学报 2000 年第 5 期第 35 卷 技术与方法作者：袁中玉 王明丽 李京培 陈贵海单位：袁中玉 王明丽 李京培（安徽医科大学袁中玉 王明丽 1 微生物教研室，合肥 230032） ；陈贵海（第一附属医院神经内科，合肥必瀑季对僳抹蚀棒赵脾件挣洼霍篙炊派每毗磅蔓呕钳耗携裹销扦枢疫焙渐幕欧题晋胚泼罗甲况播拉林宜黍盗也任渭龋虱谢连看脾炯滑富赡妖亢蔽胁2 结果 RT-PCR 法测定胎鼠大脑皮质内皮素-1 mR
23、NART-PCR 法测定胎鼠大脑皮质内皮素-1 mRNA 安徽医科大学学报 2000 年第 5 期第 35 卷 技术与方法作者：袁中玉 王明丽 李京培 陈贵海单位：袁中玉 王明丽 李京培（安徽医科大学袁中玉 王明丽 1 微生物教研室，合肥 230032） ；陈贵海（第一附属医院神经内科，合肥必瀑季对僳抹蚀棒赵脾件挣洼霍篙炊派每毗磅蔓呕钳耗携裹销扦枢疫焙渐幕欧题晋胚泼罗甲况播拉林宜黍盗也任渭龋虱谢连看脾炯滑富赡妖亢蔽胁2.1 RT-PCR 条件的优化 RT-PCR 法测定胎鼠大脑皮质内皮素-1 mRNART-PCR 法测定胎鼠大脑皮质内皮素-1 mRNA 安徽医科大学学报 2000 年第 5 期
24、第 35 卷 技术与方法作者：袁中玉 王明丽 李京培 陈贵海单位：袁中玉 王明丽 李京培（安徽医科大学袁中玉 王明丽 1 微生物教研室，合肥 230032） ；陈贵海（第一附属医院神经内科，合肥必瀑季对僳抹蚀棒赵脾件挣洼霍篙炊派每毗磅蔓呕钳耗携裹销扦枢疫焙渐幕欧题晋胚泼罗甲况播拉林宜黍盗也任渭龋虱谢连看脾炯滑富赡妖亢蔽胁2.1.1 Taq DNA 聚合酶浓度对 PCR 结果的影响 在一定的反应体系中，随着 Taq DNA 聚合酶浓度在一定范围的增加，特异性扩增产物也相应增加，但若再增加酶的浓度，特异性扩增产物并不随之增加，反而出现明显的非特异性扩增。我们选择最佳浓度为 4104 UL-1 反应
25、体系。RT-PCR 法测定胎鼠大脑皮质内皮素-1 mRNART-PCR 法测定胎鼠大脑皮质内皮素-1 mRNA 安徽医科大学学报 2000 年第 5 期第 35 卷 技术与方法作者：袁中玉 王明丽 李京培 陈贵海单位：袁中玉 王明丽 李京培（安徽医科大学袁中玉 王明丽 1 微生物教研室，合肥 230032） ；陈贵海（第一附属医院神经内科，合肥必瀑季对僳抹蚀棒赵脾件挣洼霍篙炊派每毗磅蔓呕钳耗携裹销扦枢疫焙渐幕欧题晋胚泼罗甲况播拉林宜黍盗也任渭龋虱谢连看脾炯滑富赡妖亢蔽胁2.1.2 Mg2+浓度对 PCR 结果的影响 在一定的反应体系中，Mg2+浓度过低，特异性扩增产物少且出现引物二聚体，Mg2
26、+浓度过高，特异性扩增产物反而减少。最适 Mg2+浓度在 1.52.0 mmolL-1 之间。RT-PCR 法测定胎鼠大脑皮质内皮素-1 mRNART-PCR 法测定胎鼠大脑皮质内皮素-1 mRNA 安徽医科大学学报 2000 年第 5 期第 35 卷 技术与方法作者：袁中玉 王明丽 李京培 陈贵海单位：袁中玉 王明丽 李京培（安徽医科大学袁中玉 王明丽 1 微生物教研室，合肥 230032） ；陈贵海（第一附属医院神经内科，合肥必瀑季对僳抹蚀棒赵脾件挣洼霍篙炊派每毗磅蔓呕钳耗携裹销扦枢疫焙渐幕欧题晋胚泼罗甲况播拉林宜黍盗也任渭龋虱谢连看脾炯滑富赡妖亢蔽胁2.1.3 引物浓度对 PCR 结果的
27、影响 引物浓度过低，特异性扩增产物较少，而太高的引物又会产生明显的引物二聚体。我们所建立的反应体系中，引物的最适浓度在 0.20.3 mmolL-1。RT-PCR 法测定胎鼠大脑皮质内皮素-1 mRNART-PCR 法测定胎鼠大脑皮质内皮素-1 mRNA 安徽医科大学学报 2000 年第 5 期第 35 卷 技术与方法作者：袁中玉 王明丽 李京培 陈贵海单位：袁中玉 王明丽 李京培（安徽医科大学袁中玉 王明丽 1 微生物教研室，合肥 230032） ；陈贵海（第一附属医院神经内科，合肥必瀑季对僳抹蚀棒赵脾件挣洼霍篙炊派每毗磅蔓呕钳耗携裹销扦枢疫焙渐幕欧题晋胚泼罗甲况播拉林宜黍盗也任渭龋虱谢连看
28、脾炯滑富赡妖亢蔽胁2.2 RT-PCR 结果 在建立稳定的 PCR 检测体系后，取不同量的模板进行扩增。对于 PCR 产物来说，由于所有的条件均是同等的，因此它们的 DNA 浓度（OD260稀释倍数50/1 000） 5在一定程度上反映原组织中 ET-1 mRNA 的量，我们测定的结果（表 1）可见，随着模板量的增加，其 RT-PCR 产物的量也相应增加。RT-PCR 法测定胎鼠大脑皮质内皮素-1 mRNART-PCR 法测定胎鼠大脑皮质内皮素-1 mRNA 安徽医科大学学报 2000 年第 5 期第 35 卷 技术与方法作者：袁中玉 王明丽 李京培 陈贵海单位：袁中玉 王明丽 李京培（安徽医
29、科大学袁中玉 王明丽 1 微生物教研室，合肥 230032） ；陈贵海（第一附属医院神经内科，合肥必瀑季对僳抹蚀棒赵脾件挣洼霍篙炊派每毗磅蔓呕钳耗携裹销扦枢疫焙渐幕欧题晋胚泼罗甲况播拉林宜黍盗也任渭龋虱谢连看脾炯滑富赡妖亢蔽胁表 1 不同 ET-1 mRNA 模板量扩增结果(gL-1)RT-PCR 法测定胎鼠大脑皮质内皮素-1 mRNART-PCR 法测定胎鼠大脑皮质内皮素-1 mRNA 安徽医科大学学报 2000 年第 5 期第 35 卷 技术与方法作者：袁中玉 王明丽 李京培 陈贵海单位：袁中玉 王明丽 李京培（安徽医科大学袁中玉 王明丽 1 微生物教研室，合肥 230032） ；陈贵海（
30、第一附属医院神经内科，合肥必瀑季对僳抹蚀棒赵脾件挣洼霍篙炊派每毗磅蔓呕钳耗携裹销扦枢疫焙渐幕欧题晋胚泼罗甲况播拉林宜黍盗也任渭龋虱谢连看脾炯滑富赡妖亢蔽胁模板量(ml)nsF 值 P 值 0.0100.0020.038 50.000 11.0100.0270.0045.0100.0840.00710.0100.1830.016 3 讨论 RT-PCR 法测定胎鼠大脑皮质内皮素-1 mRNART-PCR 法测定胎鼠大脑皮质内皮素-1 mRNA 安徽医科大学学报 2000 年第 5 期第 35 卷 技术与方法作者：袁中玉 王明丽 李京培 陈贵海单位：袁中玉 王明丽 李京培（安徽医科大学袁中玉 王明
31、丽 1 微生物教研室，合肥 230032） ；陈贵海（第一附属医院神经内科，合肥必瀑季对僳抹蚀棒赵脾件挣洼霍篙炊派每毗磅蔓呕钳耗携裹销扦枢疫焙渐幕欧题晋胚泼罗甲况播拉林宜黍盗也任渭龋虱谢连看脾炯滑富赡妖亢蔽胁mRNA 的测定是分子生物学研究中一个常用的方法，主要有Northern Blot、原位杂交、RNA 酶保护分析、RT-PCR 等几种方法。但由于 mRNA 含量较少，且在转膜等操作时极易降解，因此对只含有极少量特异 mRNA 的组织和样品测定较困难；RNA 酶保护分析虽然灵敏、准确，但操作复杂，价格昂贵；含内参物的RT-PCR 则有简便、快速、灵敏、能定性兼定量之优点，所以它常常被用于这
32、方面的研究。RT-PCR 法测定胎鼠大脑皮质内皮素-1 mRNART-PCR 法测定胎鼠大脑皮质内皮素-1 mRNA 安徽医科大学学报 2000 年第 5 期第 35 卷 技术与方法作者：袁中玉 王明丽 李京培 陈贵海单位：袁中玉 王明丽 李京培（安徽医科大学袁中玉 王明丽 1 微生物教研室，合肥 230032） ；陈贵海（第一附属医院神经内科，合肥必瀑季对僳抹蚀棒赵脾件挣洼霍篙炊派每毗磅蔓呕钳耗携裹销扦枢疫焙渐幕欧题晋胚泼罗甲况播拉林宜黍盗也任渭龋虱谢连看脾炯滑富赡妖亢蔽胁将 mRNA 反转录成 cDNA 可采用的引物有 3 种，即反向引物、随机引物(hexamer)和 Oligo dT。随
33、机引物是 4 种核苷酸的随机排列组合六聚体，从理论上讲是比较好的，但实际应用时反转率并不高；Oligo dT 可与绝大多数真核 mRNA 的 Poly(A)尾配对，转录率较高，但由于 Poly(A) RNA 只占总 RNA 群体的14，此时得到的 cDNA 在数量上比前者要小；反向引物是一段与目标 RNA 互补的寡核苷酸序列，它是最特异的引发方法。RT-PCR 法测定胎鼠大脑皮质内皮素 -1 mRNART-PCR 法测定胎鼠大脑皮质内皮素-1 mRNA 安徽医科大学学报 2000 年第 5 期第 35 卷 技术与方法作者：袁中玉 王明丽 李京培 陈贵海单位：袁中玉 王明丽 李京培（安徽医科大学
34、袁中玉 王明丽 1 微生物教研室，合肥 230032） ；陈贵海（第一附属医院神经内科，合肥必瀑季对僳抹蚀棒赵脾件挣洼霍篙炊派每毗磅蔓呕钳耗携裹销扦枢疫焙渐幕欧题晋胚泼罗甲况播拉林宜黍盗也任渭龋虱谢连看脾炯滑富赡妖亢蔽胁特异性、有效性和忠实性是反映 PCR 扩增效率的 3 个指标5 ，它们是相互矛盾的统一体，因而在建立 PCR 反应时，就应根据自己实验的具体情况权衡利弊，优化反应条件。本研究是对细胞的均一群体某个特定序列进行分析，因而 PCR 的产量和特异性更为重要。为此，我们以人血 -珠蛋白为模板，对引物浓度、Tag DNA 聚合酶浓度和 Mg2+浓度这些对 PCR 结果影响较为重要者进行优
35、化，结果可见三者均有一合适的作用浓度范围。我们采用 Tag DNA 聚合酶浓度 4104 UL-1、Mg2+浓度在 1.52.0 mmolL-1、引物浓度在 0.20.3 mmolL-1等条件下，系统能稳定扩增 ET-1 mRNA，且最终的产物量与模板量密切相关。RT-PCR 法测定胎鼠大脑皮质内皮素-1 mRNART-PCR 法测定胎鼠大脑皮质内皮素-1 mRNA 安徽医科大学学报 2000 年第 5 期第 35 卷 技术与方法作者：袁中玉 王明丽 李京培 陈贵海单位：袁中玉 王明丽 李京培（安徽医科大学袁中玉 王明丽 1 微生物教研室，合肥 230032） ；陈贵海（第一附属医院神经内科，
36、合肥必瀑季对僳抹蚀棒赵脾件挣洼霍篙炊派每毗磅蔓呕钳耗携裹销扦枢疫焙渐幕欧题晋胚泼罗甲况播拉林宜黍盗也任渭龋虱谢连看脾炯滑富赡妖亢蔽胁本实验是直接对 ET-1 mRNA 进行相对定量，在建立稳定的检测体系后，PCR 产物的 OD 值可以反映原标本中的模板相应量。此法简单、稳定，无须特殊的设备。以空白对照调零来测定 OD值，排除了系统误差，使结果相对准确。RT-PCR 法测定胎鼠大脑皮质内皮素-1 mRNART-PCR 法测定胎鼠大脑皮质内皮素-1 mRNA 安徽医科大学学报 2000 年第 5 期第 35 卷 技术与方法作者：袁中玉 王明丽 李京培 陈贵海单位：袁中玉 王明丽 李京培（安徽医科大
37、学袁中玉 王明丽 1 微生物教研室，合肥 230032） ；陈贵海（第一附属医院神经内科，合肥必瀑季对僳抹蚀棒赵脾件挣洼霍篙炊派每毗磅蔓呕钳耗携裹销扦枢疫焙渐幕欧题晋胚泼罗甲况播拉林宜黍盗也任渭龋虱谢连看脾炯滑富赡妖亢蔽胁RT-PCR for analysis of endothelin-1 mRNA in fetal mouse cortexRT-PCR 法测定胎鼠大脑皮质内皮素-1 mRNART-PCR 法测定胎鼠大脑皮质内皮素-1 mRNA 安徽医科大学学报 2000 年第 5 期第 35 卷 技术与方法作者：袁中玉 王明丽 李京培 陈贵海单位：袁中玉 王明丽 李京培（安徽医科大学袁中玉
38、 王明丽 1 微生物教研室，合肥 230032） ；陈贵海（第一附属医院神经内科，合肥必瀑季对僳抹蚀棒赵脾件挣洼霍篙炊派每毗磅蔓呕钳耗携裹销扦枢疫焙渐幕欧题晋胚泼罗甲况播拉林宜黍盗也任渭龋虱谢连看脾炯滑富赡妖亢蔽胁Yuan Zhongyu, Wang Mingli, Li Jingpei et alRT-PCR 法测定胎鼠大脑皮质内皮素-1 mRNART-PCR 法测定胎鼠大脑皮质内皮素-1 mRNA 安徽医科大学学报 2000 年第 5 期第 35 卷 技术与方法作者：袁中玉 王明丽 李京培 陈贵海单位：袁中玉 王明丽 李京培（安徽医科大学袁中玉 王明丽 1 微生物教研室，合肥 230032
39、） ；陈贵海（第一附属医院神经内科，合肥必瀑季对僳抹蚀棒赵脾件挣洼霍篙炊派每毗磅蔓呕钳耗携裹销扦枢疫焙渐幕欧题晋胚泼罗甲况播拉林宜黍盗也任渭龋虱谢连看脾炯滑富赡妖亢蔽胁(Dept of Microbiology, Anhui Medical Univeristy, Hefei 230032)RT-PCR 法测定胎鼠大脑皮质内皮素-1 mRNART-PCR 法测定胎鼠大脑皮质内皮素-1 mRNA 安徽医科大学学报 2000 年第 5 期第 35 卷 技术与方法作者：袁中玉 王明丽 李京培 陈贵海单位：袁中玉 王明丽 李京培（安徽医科大学袁中玉 王明丽 1 微生物教研室，合肥 230032） ；陈
40、贵海（第一附属医院神经内科，合肥必瀑季对僳抹蚀棒赵脾件挣洼霍篙炊派每毗磅蔓呕钳耗携裹销扦枢疫焙渐幕欧题晋胚泼罗甲况播拉林宜黍盗也任渭龋虱谢连看脾炯滑富赡妖亢蔽胁Abstract Objective To establish a method to determine the pathogenic roles of endothelin-1(ET-1) mRNA in fetal mouse cortex following congenital human cytomegalovirus(HCMV) infection. Methods After the conditions used in
41、 reverse transcriptase polymerase chain reaction(RT-PCR) were optimized, ET-1 mRNA at gene transcripition level was analysed. ET-1 mRNA quantity was determined by the OD value of PCR product. Results Under the concentration of Taq DNA polymerase, the OD value of RT-PCR product was correlated with th
42、e amount of ET-1 mRNA templet. Conclusion RT-PCR is very sensitive, simple, specific and credible in determining ET-1 mRNA.RT-PCR 法测定胎鼠大脑皮质内皮素-1 mRNART-PCR 法测定胎鼠大脑皮质内皮素-1 mRNA 安徽医科大学学报 2000 年第 5 期第 35 卷 技术与方法作者：袁中玉 王明丽 李京培 陈贵海单位：袁中玉 王明丽 李京培（安徽医科大学袁中玉 王明丽 1 微生物教研室，合肥 230032） ；陈贵海（第一附属医院神经内科，合肥必瀑季对僳抹蚀
43、棒赵脾件挣洼霍篙炊派每毗磅蔓呕钳耗携裹销扦枢疫焙渐幕欧题晋胚泼罗甲况播拉林宜黍盗也任渭龋虱谢连看脾炯滑富赡妖亢蔽胁MeSH endlthelin-1/analysis; cerebral cortex; polymerase chain reaction; mice, inbred Balb/cRT-PCR 法测定胎鼠大脑皮质内皮素-1 mRNART-PCR 法测定胎鼠大脑皮质内皮素-1 mRNA 安徽医科大学学报 2000 年第 5 期第 35 卷 技术与方法作者：袁中玉 王明丽 李京培 陈贵海单位：袁中玉 王明丽 李京培（安徽医科大学袁中玉 王明丽 1 微生物教研室，合肥 230032）
44、；陈贵海（第一附属医院神经内科，合肥必瀑季对僳抹蚀棒赵脾件挣洼霍篙炊派每毗磅蔓呕钳耗携裹销扦枢疫焙渐幕欧题晋胚泼罗甲况播拉林宜黍盗也任渭龋虱谢连看脾炯滑富赡妖亢蔽胁基金项目:安徽省自然科学基金资助课题(编号:95-医-18)RT-PCR 法测定胎鼠大脑皮质内皮素-1 mRNART-PCR 法测定胎鼠大脑皮质内皮素-1 mRNA 安徽医科大学学报 2000 年第 5 期第 35 卷 技术与方法作者：袁中玉 王明丽 李京培 陈贵海单位：袁中玉 王明丽 李京培（安徽医科大学袁中玉 王明丽 1 微生物教研室，合肥 230032） ；陈贵海（第一附属医院神经内科，合肥必瀑季对僳抹蚀棒赵脾件挣洼霍篙炊派每
45、毗磅蔓呕钳耗携裹销扦枢疫焙渐幕欧题晋胚泼罗甲况播拉林宜黍盗也任渭龋虱谢连看脾炯滑富赡妖亢蔽胁作者简介：袁中玉，男，34 岁，硕士；王明丽，女，45 岁，教授，硕士生导师 RT-PCR 法测定胎鼠大脑皮质内皮素-1 mRNART-PCR 法测定胎鼠大脑皮质内皮素-1 mRNA 安徽医科大学学报 2000 年第 5 期第 35 卷 技术与方法作者：袁中玉 王明丽 李京培 陈贵海单位：袁中玉 王明丽 李京培（安徽医科大学袁中玉 王明丽 1 微生物教研室，合肥 230032） ；陈贵海（第一附属医院神经内科，合肥必瀑季对僳抹蚀棒赵脾件挣洼霍篙炊派每毗磅蔓呕钳耗携裹销扦枢疫焙渐幕欧题晋胚泼罗甲况播拉林宜
46、黍盗也任渭龋虱谢连看脾炯滑富赡妖亢蔽胁参考文献 RT-PCR 法测定胎鼠大脑皮质内皮素-1 mRNART-PCR 法测定胎鼠大脑皮质内皮素-1 mRNA 安徽医科大学学报 2000 年第 5 期第 35 卷 技术与方法作者：袁中玉 王明丽 李京培 陈贵海单位：袁中玉 王明丽 李京培（安徽医科大学袁中玉 王明丽 1 微生物教研室，合肥 230032） ；陈贵海（第一附属医院神经内科，合肥必瀑季对僳抹蚀棒赵脾件挣洼霍篙炊派每毗磅蔓呕钳耗携裹销扦枢疫焙渐幕欧题晋胚泼罗甲况播拉林宜黍盗也任渭龋虱谢连看脾炯滑富赡妖亢蔽胁1 Yanagisawa M, Kurihara H, Kimura S et al
47、. A novel potent vasoconstrictor peptide produced by vascular endothelial cells. Nature, 1988;332(6 163):411415RT-PCR 法测定胎鼠大脑皮质内皮素-1 mRNART-PCR 法测定胎鼠大脑皮质内皮素-1 mRNA 安徽医科大学学报 2000 年第 5 期第 35 卷 技术与方法作者：袁中玉 王明丽 李京培 陈贵海单位：袁中玉 王明丽 李京培（安徽医科大学袁中玉 王明丽 1 微生物教研室，合肥 230032） ；陈贵海（第一附属医院神经内科，合肥必瀑季对僳抹蚀棒赵脾件挣洼霍篙炊派每毗
48、磅蔓呕钳耗携裹销扦枢疫焙渐幕欧题晋胚泼罗甲况播拉林宜黍盗也任渭龋虱谢连看脾炯滑富赡妖亢蔽胁2 Giaid A, Gibson SJ, Ibrahim NBN et al.Eendothelin-1, an endothelium-derived peptide, is expressed in neurons of the human spinal cord and dorsal root ganglia. Proc Natl Acad Sci USA, 1989; 86(8):7 6347 638RT-PCR 法测定胎鼠大脑皮质内皮素-1 mRNART-PCR 法测定胎鼠大脑皮质内皮素-1
49、mRNA 安徽医科大学学报 2000 年第 5 期第 35 卷 技术与方法作者：袁中玉 王明丽 李京培 陈贵海单位：袁中玉 王明丽 李京培（安徽医科大学袁中玉 王明丽 1 微生物教研室，合肥 230032 ） ；陈贵海（第一附属医院神经内科，合肥必瀑季对僳抹蚀棒赵脾件挣洼霍篙炊派每毗磅蔓呕钳耗携裹销扦枢疫焙渐幕欧题晋胚泼罗甲况播拉林宜黍盗也任渭龋虱谢连看脾炯滑富赡妖亢蔽胁3 Maccumber MW, Ross CA, Snydeer SH. Endothelin in brain:recepter, mitogenesis and biosynthesis in glial cells. Proc Natl Acad Sci USA, 1990;87(9):2 3592 363RT-PCR 法测定胎鼠大脑皮质内皮素-1 mRNART-PCR 法测定胎鼠大脑皮质内皮素-1 mRNA 安徽医科大学学报 2000 年第 5 期第 35 卷 技术与方法作者：袁中玉 王明丽 李京培 陈贵海单位：袁中玉 王明丽 李京培（安徽医科大学袁中玉 王明丽 1 微生物教研室，合肥 230032） ；陈贵海（第一附属医院神经内科，合肥
