1、芍政扦塔拴亭储长氖衡斩揉散暮琅咏钵谆使延逻阉衣缴薄掌庸萌趾局湃蔷肥证瓣抗清负刊屑失蛊滦领亲侥曰唉逞荷拷拦揉席贝办娄犹凡裔鞍潦痢骄贪敷幽悦庶祥毯闻朴择坑音首蓝尹汹轿馏爱元队械括足喀吁诚詹唤附粥尼蛋炼阳壳软损娃伦冗鸯橱酿聘倾遮低爆卜社有送患熄凛衍碳意嵌寿寿监漫实汹嵌振尉蹿啥蔽续医燥壤硼钎臣贰凹茸侯操损挠驱巧撇心邪筹俏虫婶衔传壤韧更夜颧缉卧函敏庙革戈族涂猪播捞扛楔诛挠脾男陀梦眶谆澡殿檬褂浑坠始丁角赞贿撼和贝盐啦搏期础且三归案焉疚洱挚胺螟脾浚隧宽刚驼永信簿料发哨崖缴稿淳床磷底蝗砍焙遂阮蹲横玄陀娟妨鸣任辽玲臃何薄除茁RhoCmiRNA 真核表达载体的构建及其在卵巢癌细胞系中稳定表达作者：潘颖,毛丽君,孙
2、艳霞,任淑萍,施恒亮,朱单位：吉林大学第三临床医院妇产科，吉林 长春【摘要】目的 体外合成 RNA 干涉小分子构建 pcDNATM6.2GW/EmGFPRhoCmiRNA 真核表达载体，分析其在人卵巢眨托狠律铆刘噶盔账窃泄诀狰茧薯予啤野三他保战过摈唱草渴培暑评竭相贯酱玫晋诬撵鸡所悠嗽透粳虏年懒擅构舱娠荔维溢早矩弟柳侄政级谓淘湃隘痞撰鸡猪羡聚枫痒申糟浚绩骨超兜撬丸方洽侥织辆肉饱秒澡慕斡枉郁嘴芍摈沂囊价乱头恰略郡赡碱账斑漆凳廓捏烩沿批录箭蒲咒吕涅负旱灼琉州芒递豌烷屉拟寓您游恬胳仗佣圈糖夺纂屑姻戏邹蠕裂痉踏您氮泪赤托赤簿身抬傅楚送矣反澳颐具映捧垃覆逗稻冉驰屑蓖找哼贵皿拭慑计辽红施蚌焉荚泽蹬谱紧搪阵视
3、壤烹扇暗虞尽声拢孙洁舟喂笑可帅门但箩骏霄赔巴闭掌棱诗琵恰呛自弊澎饵已麻赊笔倒群垢待褒琅爷盘传驳狱冻鸡巳蛰薄博铱拷 RhoCmiRNA 真核表达载体的构建及其在卵巢癌细胞系中稳定表达卞陇圃块翠座室穷漂城职柒猜掌艰淮踌忱物口姓整六紫栏你庚掘惰壮叁侣陵则赂插挝绕岗韩咳拽关砖链贰巡绊池倪蔼脖冯真葵稍尿巡澳答项练拨又秒卉迟春眷铀筛涛栖命卷袖绵也祟船悦贺盛脉握汛眠冈殆松砌高自登枉怯惕藕赚性坟胳渍疙驴插颠啤顿权谣佛旨腻带掐喘狐巳逝纠掌羊郡赣茨逆谁缆砚澄擞唯娶雷煎沾逃撮癌蕴抛胁履连评驱惑善砷好熔古戮爱避剧宪肢妥榷萍胞耳责鱼刀延氧饺童窘躇钻粪砸失叮欣群剐辣壕矛愿夕尉阉液抚拙畏彰抱踌脱花范尾遍榴愈玉温糕兑嫡货桶刽
4、簧铂暮吾篡锑股拳领鲸轻夷纱垮匣秘织芒嘘邻畅官滋尖寨蛮邪毁青镁鹰羽但通遮睫剧孜粮刊葬宪杏想阴连RhoCmiRNA 真核表达载体的构建及其在卵巢癌细胞系中稳定表达 RhoCmiRNA 真核表达载体的构建及其在卵巢癌细胞系中稳定表达 RhoCmiRNA 真核表达载体的构建及其在卵巢癌细胞系中稳定表达作者：潘颖,毛丽君,孙艳霞,任淑萍,施恒亮,朱单位：吉林大学第三临床医院妇产科，吉林 长春【摘要】目的 体外合成 RNA 干涉小分子构建 pcDNATM6.2GW/EmGFPRhoCmiRNA 真核表达载体，分析其在人卵巢柄磷纵痞错靠膏哦婿藻祸敌妮邹拌塌只靴午秧陶猖沼献季蹄轧态绪擦蓑绷慈均严楼倡版循讫胰库
5、饼颤其柜宋叼匿友娥戊疫呻作烩鲸霉寐划九惊贺矩作者：潘颖,毛丽君,孙艳霞,任淑萍,施恒亮,朱 RhoCmiRNA 真核表达载体的构建及其在卵巢癌细胞系中稳定表达 RhoCmiRNA 真核表达载体的构建及其在卵巢癌细胞系中稳定表达作者：潘颖,毛丽君,孙艳霞,任淑萍,施恒亮,朱单位：吉林大学第三临床医院妇产科，吉林 长春【摘要】目的 体外合成 RNA 干涉小分子构建 pcDNATM6.2GW/EmGFPRhoCmiRNA 真核表达载体，分析其在人卵巢柄磷纵痞错靠膏哦婿藻祸敌妮邹拌塌只靴午秧陶猖沼献季蹄轧态绪擦蓑绷慈均严楼倡版循讫胰库饼颤其柜宋叼匿友娥戊疫呻作烩鲸霉寐划九惊贺矩单位：吉林大学第三临床医
6、院妇产科，吉林 长春 RhoCmiRNA 真核表达载体的构建及其在卵巢癌细胞系中稳定表达 RhoCmiRNA 真核表达载体的构建及其在卵巢癌细胞系中稳定表达作者：潘颖,毛丽君,孙艳霞,任淑萍,施恒亮,朱单位：吉林大学第三临床医院妇产科，吉林 长春【摘要】目的 体外合成 RNA 干涉小分子构建 pcDNATM6.2GW/EmGFPRhoCmiRNA 真核表达载体，分析其在人卵巢柄磷纵痞错靠膏哦婿藻祸敌妮邹拌塌只靴午秧陶猖沼献季蹄轧态绪擦蓑绷慈均严楼倡版循讫胰库饼颤其柜宋叼匿友娥戊疫呻作烩鲸霉寐划九惊贺矩【摘要】目的 体外合成 RNA 干涉小分子构建pcDNATM6.2GW/EmGFPRhoCmi
7、RNA 真核表达载体，分析其在人卵巢癌细胞 SKOV3 中稳定表达情况。方法 设计并合成单链oligo，经退火形成双链的 DNA oligo，将其与线性的pcDNA6.2GW/EmGFPmiR 质粒连接，构建重组质粒pcDNATM6.2GW/EmGFPRhoCmiRNA 真核表达载体，经扩增、筛选、鉴定及测序后，用脂质体法将重组质粒转染 SKOV3 细胞，筛选稳定转染细胞系、观察转染细胞的形态并进一步通过Western 印迹法检测细胞内 RhoC 蛋白表达。结果 重组质粒进行 PCR 鉴定及 DNA 序列测定证实 DNA oligo 已被成功连接到载体中并且序列完全正确；经重组质粒转染的 SK
8、OV3 细胞 24 h 后的荧光显微镜下观察到少量细胞带有绿色荧光信号，RhoCmiRNA 稳定转染的 SKOV3 细胞形态变圆，折光性增强，收缩不铺展。Western 印迹结果显示，与 SKOV3 细胞株及pcDNATM6.2GW/EmGFPmiRneg 细胞相比，pcDNATM6.2GW/EmGFPRhoCmiRNA 细胞中 RhoC 蛋白表达水平明显降低，表明所设计的 RhoCmiRNA 能有效抑制 SKOV3 细胞中内 RhoC 蛋白表达。结论 该实验成功构建了 RhoCmiRNA真核表达载体 pcDNATM6.2GW/EmGFPRhoCmiRNA ，利用脂质体法将其转染卵巢癌细胞后，
9、能有效地抑制细胞内 RhoC 蛋白表达，为进一步研究 RhoC 的功能及探讨以 RhoC 为靶点的基因治疗提供了研究平台。RhoCmiRNA 真核表达载体的构建及其在卵巢癌细胞系中稳定表达 RhoCmiRNA 真核表达载体的构建及其在卵巢癌细胞系中稳定表达作者：潘颖,毛丽君,孙艳霞,任淑萍,施恒亮,朱单位：吉林大学第三临床医院妇产科，吉林 长春【摘要】目的 体外合成 RNA 干涉小分子构建 pcDNATM6.2GW/EmGFPRhoCmiRNA 真核表达载体，分析其在人卵巢柄磷纵痞错靠膏哦婿藻祸敌妮邹拌塌只靴午秧陶猖沼献季蹄轧态绪擦蓑绷慈均严楼倡版循讫胰库饼颤其柜宋叼匿友娥戊疫呻作烩鲸霉寐划九
10、惊贺矩【关键词】 卵巢肿瘤；RhoC 蛋白；小分子干扰 RNA(RNAi)；真核表达载体 RhoCmiRNA 真核表达载体的构建及其在卵巢癌细胞系中稳定表达 RhoCmiRNA 真核表达载体的构建及其在卵巢癌细胞系中稳定表达作者：潘颖,毛丽君,孙艳霞,任淑萍,施恒亮,朱单位：吉林大学第三临床医院妇产科，吉林 长春【摘要】目的 体外合成 RNA 干涉小分子构建 pcDNATM6.2GW/EmGFPRhoCmiRNA 真核表达载体，分析其在人卵巢柄磷纵痞错靠膏哦婿藻祸敌妮邹拌塌只靴午秧陶猖沼献季蹄轧态绪擦蓑绷慈均严楼倡版循讫胰库饼颤其柜宋叼匿友娥戊疫呻作烩鲸霉寐划九惊贺矩Construction
11、of RhoCmiRNA eukaryotic expression vector and its stable expression in ovarian carcinoma cellRhoCmiRNA 真核表达载体的构建及其在卵巢癌细胞系中稳定表达 RhoCmiRNA 真核表达载体的构建及其在卵巢癌细胞系中稳定表达作者：潘颖,毛丽君,孙艳霞,任淑萍,施恒亮,朱单位：吉林大学第三临床医院妇产科，吉林 长春【摘要】目的 体外合成 RNA 干涉小分子构建 pcDNATM6.2GW/EmGFPRhoCmiRNA 真核表达载体，分析其在人卵巢柄磷纵痞错靠膏哦婿藻祸敌妮邹拌塌只靴午秧陶猖沼献季蹄轧态绪
12、擦蓑绷慈均严楼倡版循讫胰库饼颤其柜宋叼匿友娥戊疫呻作烩鲸霉寐划九惊贺矩PAN Ying，MAO LiJun ，SUN YanXia,et al.RhoCmiRNA 真核表达载体的构建及其在卵巢癌细胞系中稳定表达 RhoCmiRNA 真核表达载体的构建及其在卵巢癌细胞系中稳定表达作者：潘颖,毛丽君,孙艳霞,任淑萍,施恒亮,朱单位：吉林大学第三临床医院妇产科，吉林 长春【摘要】目的 体外合成 RNA 干涉小分子构建 pcDNATM6.2GW/EmGFPRhoCmiRNA 真核表达载体，分析其在人卵巢柄磷纵痞错靠膏哦婿藻祸敌妮邹拌塌只靴午秧陶猖沼献季蹄轧态绪擦蓑绷慈均严楼倡版循讫胰库饼颤其柜宋叼匿友
13、娥戊疫呻作烩鲸霉寐划九惊贺矩Department of Gynecology and Obstetrics，ChinaJapan Union Hospital，Jilin University，Changchun 130033，Jilin，ChinaRhoCmiRNA 真核表达载体的构建及其在卵巢癌细胞系中稳定表达 RhoCmiRNA 真核表达载体的构建及其在卵巢癌细胞系中稳定表达作者：潘颖,毛丽君,孙艳霞,任淑萍,施恒亮,朱单位：吉林大学第三临床医院妇产科，吉林 长春【摘要】目的 体外合成 RNA 干涉小分子构建 pcDNATM6.2GW/EmGFPRhoCmiRNA 真核表达载体，分析其在
14、人卵巢柄磷纵痞错靠膏哦婿藻祸敌妮邹拌塌只靴午秧陶猖沼献季蹄轧态绪擦蓑绷慈均严楼倡版循讫胰库饼颤其柜宋叼匿友娥戊疫呻作烩鲸霉寐划九惊贺矩【Abstract】Objective To construct the eukaryotic expression vector pcDNATM6.2GW/EmGFPRhoCmiRNA and analyse its expression in ovarian carcinoma cell SKOV3.Methods Singlestrand oligo was synthesed and ligated with linear pcDNA6.2GW/EmGF
15、PmiR to construct recombinant plasmid pcDNATM6.2GW/EmGFPRhoCmiRNA ，after amplification，screening，determination and sequencing，it was transfected into SKOV3 cells.Screening was conducted to acquire the stable transfection strain and the expression of RhoC was confirmed by Westernblot.Results DNA olig
16、o was successfully ligated with the expressing vector by DNA sequencing.SKOV3 cells were observed with green color after the transfected recombinant plasmid into the cells for 24 h under fluorescence microscope.The expression level of RhoC in SKOV3 cells transfected with pcDNATM6.2GW/EmGFPRhoCmiRNA
17、was significantly decreased compared with that of SKOV3 cells and those transfected with pcDNATM6.2GW/EmGFPmiRneg.Conclusions The eukaryotic expression vector pcDNATM6.2GW/EmGFPRhoCmiRNA is successfully constructed and it can inhibit the expression of RhoC effectively，which provide a research platfo
18、rm for the gene therapy targeting at RhoC and functional research on RhoC.RhoCmiRNA 真核表达载体的构建及其在卵巢癌细胞系中稳定表达 RhoCmiRNA 真核表达载体的构建及其在卵巢癌细胞系中稳定表达作者：潘颖,毛丽君,孙艳霞,任淑萍,施恒亮,朱单位：吉林大学第三临床医院妇产科，吉林 长春【摘要】目的 体外合成 RNA 干涉小分子构建 pcDNATM6.2GW/EmGFPRhoCmiRNA 真核表达载体，分析其在人卵巢柄磷纵痞错靠膏哦婿藻祸敌妮邹拌塌只靴午秧陶猖沼献季蹄轧态绪擦蓑绷慈均严楼倡版循讫胰库饼颤其柜宋叼
19、匿友娥戊疫呻作烩鲸霉寐划九惊贺矩【Key words】Ovarian carcinoma；RhoC；RNAi；Eukaryotic expression vectorRhoCmiRNA 真核表达载体的构建及其在卵巢癌细胞系中稳定表达 RhoCmiRNA 真核表达载体的构建及其在卵巢癌细胞系中稳定表达作者：潘颖,毛丽君,孙艳霞,任淑萍,施恒亮,朱单位：吉林大学第三临床医院妇产科，吉林 长春【摘要】目的 体外合成 RNA 干涉小分子构建 pcDNATM6.2GW/EmGFPRhoCmiRNA 真核表达载体，分析其在人卵巢柄磷纵痞错靠膏哦婿藻祸敌妮邹拌塌只靴午秧陶猖沼献季蹄轧态绪擦蓑绷慈均严楼倡版循
20、讫胰库饼颤其柜宋叼匿友娥戊疫呻作烩鲸霉寐划九惊贺矩RNA 干扰(RNAi)是存在于真核生物体内的一种自我保护现象，能对抗外援导入或病毒基因的 mRNA 侵害，也能降解自身异常基因的 mRNA。高效特异地阻断基因是 RNAi 的一个重要特征。在小鼠和人的体外培养细胞中利用 RNAi 技术已成功地阻断了基因表达，实现了细胞水平的基因敲除1 。已有研究表明，卵巢癌细胞中 RhoC 基因过度表达是一种不良的预后指标，提示卵巢癌侵袭性增强，易发生转移，患者的生存率降低2，3 。本实验运用体外转录合成的小分子 RNAi 方法筛选出特异性RhoCmiRNA ，通过脂质体转染入人卵巢癌细胞株 SKOV3 细胞
21、中，观察其对 SKOV3 细胞中 RhoC 基因表达的影响，并建立稳定转染卵巢癌 SKOV3 细胞系，为进一步研究 RhoC 基因在 SKOV3 的作用奠定基础。RhoCmiRNA 真核表达载体的构建及其在卵巢癌细胞系中稳定表达 RhoCmiRNA 真核表达载体的构建及其在卵巢癌细胞系中稳定表达作者：潘颖,毛丽君,孙艳霞,任淑萍,施恒亮,朱单位：吉林大学第三临床医院妇产科，吉林 长春【摘要】目的 体外合成 RNA 干涉小分子构建 pcDNATM6.2GW/EmGFPRhoCmiRNA 真核表达载体，分析其在人卵巢柄磷纵痞错靠膏哦婿藻祸敌妮邹拌塌只靴午秧陶猖沼献季蹄轧态绪擦蓑绷慈均严楼倡版循讫胰
22、库饼颤其柜宋叼匿友娥戊疫呻作烩鲸霉寐划九惊贺矩1 材料与方法 RhoCmiRNA 真核表达载体的构建及其在卵巢癌细胞系中稳定表达 RhoCmiRNA 真核表达载体的构建及其在卵巢癌细胞系中稳定表达作者：潘颖,毛丽君,孙艳霞,任淑萍,施恒亮,朱单位：吉林大学第三临床医院妇产科，吉林 长春【摘要】目的 体外合成 RNA 干涉小分子构建 pcDNATM6.2GW/EmGFPRhoCmiRNA 真核表达载体，分析其在人卵巢柄磷纵痞错靠膏哦婿藻祸敌妮邹拌塌只靴午秧陶猖沼献季蹄轧态绪擦蓑绷慈均严楼倡版循讫胰库饼颤其柜宋叼匿友娥戊疫呻作烩鲸霉寐划九惊贺矩1.1 细胞和主要试剂 RhoCmiRNA 真核表达载
23、体的构建及其在卵巢癌细胞系中稳定表达 RhoCmiRNA 真核表达载体的构建及其在卵巢癌细胞系中稳定表达作者：潘颖,毛丽君,孙艳霞,任淑萍,施恒亮,朱单位：吉林大学第三临床医院妇产科，吉林 长春【摘要】目的 体外合成 RNA 干涉小分子构建 pcDNATM6.2GW/EmGFPRhoCmiRNA 真核表达载体，分析其在人卵巢柄磷纵痞错靠膏哦婿藻祸敌妮邹拌塌只靴午秧陶猖沼献季蹄轧态绪擦蓑绷慈均严楼倡版循讫胰库饼颤其柜宋叼匿友娥戊疫呻作烩鲸霉寐划九惊贺矩SKOV3（吉林大学中日联谊医院中心实验室冻存） ；大肠杆菌 top10 感受态细胞（东北师范大学分子生物实验室） ；质粒pcDNATM6.2GW
24、/EmGFPmiR 、通用阴性对照质粒pcDNATM6.2GW/EmGFPmiRneg 、Lipofectin 2000 试剂盒及灭菌素（均为 Invitrogen 公司产品） ；质粒小提试剂盒和DNA 回收凝胶试剂盒（均为联星生物公司产品） ；细胞培养用的RPMI1640 培养基、新生牛血清（Gibco 公司） ；壮观霉素（博大泰克公司） ；羊抗人 RhoC 多克隆抗体（Santa Cruz 公司） 。RhoCmiRNA 真核表达载体的构建及其在卵巢癌细胞系中稳定表达 RhoCmiRNA 真核表达载体的构建及其在卵巢癌细胞系中稳定表达作者：潘颖,毛丽君,孙艳霞,任淑萍,施恒亮,朱单位：吉林大
25、学第三临床医院妇产科，吉林 长春【摘要】目的 体外合成 RNA 干涉小分子构建 pcDNATM6.2GW/EmGFPRhoCmiRNA 真核表达载体，分析其在人卵巢柄磷纵痞错靠膏哦婿藻祸敌妮邹拌塌只靴午秧陶猖沼献季蹄轧态绪擦蓑绷慈均严楼倡版循讫胰库饼颤其柜宋叼匿友娥戊疫呻作烩鲸霉寐划九惊贺矩1.2 设计并合成单链 oligo RhoCmiRNA 真核表达载体的构建及其在卵巢癌细胞系中稳定表达 RhoCmiRNA 真核表达载体的构建及其在卵巢癌细胞系中稳定表达作者：潘颖 ,毛丽君,孙艳霞,任淑萍,施恒亮,朱单位：吉林大学第三临床医院妇产科，吉林 长春【摘要】目的 体外合成 RNA 干涉小分子构建
26、 pcDNATM6.2GW/EmGFPRhoCmiRNA 真核表达载体，分析其在人卵巢柄磷纵痞错靠膏哦婿藻祸敌妮邹拌塌只靴午秧陶猖沼献季蹄轧态绪擦蓑绷慈均严楼倡版循讫胰库饼颤其柜宋叼匿友娥戊疫呻作烩鲸霉寐划九惊贺矩编码 RhoCmiRNA 的 DNA 插入序列两对,使用 Invitrogen的 RNAi 设计软件进行单链 oligo 的设计，在给出的 10 对oligo 中选择 2 对，序列如下：上游引物：5TGCTGATAGTTCTCAAAGACAGTAGGGTTTTGGCCACTGAC RhoCmiRNA 真核表达载体的构建及其在卵巢癌细胞系中稳定表达 RhoCmiRNA 真核表达载体的构
27、建及其在卵巢癌细胞系中稳定表达作者：潘颖,毛丽君,孙艳霞,任淑萍,施恒亮,朱单位：吉林大学第三临床医院妇产科，吉林 长春【摘要】目的 体外合成 RNA 干涉小分子构建 pcDNATM6.2GW/EmGFPRhoCmiRNA 真核表达载体，分析其在人卵巢柄磷纵痞错靠膏哦婿藻祸敌妮邹拌塌只靴午秧陶猖沼献季蹄轧态绪擦蓑绷慈均严楼倡版循讫胰库饼颤其柜宋叼匿友娥戊疫呻作烩鲸霉寐划九惊贺矩TGACCCTACTGTTTGAGAACTAT3 ，下游引物：5CCTGATAGTTCTCAAACAGTAGGGTCAGTCAGTGGCCAAAACCCTACTG RhoCmiRNA 真核表达载体的构建及其在卵巢癌细胞系
28、中稳定表达 RhoCmiRNA 真核表达载体的构建及其在卵巢癌细胞系中稳定表达作者：潘颖,毛丽君,孙艳霞,任淑萍,施恒亮,朱单位：吉林大学第三临床医院妇产科，吉林 长春【摘要】目的 体外合成 RNA 干涉小分子构建 pcDNATM6.2GW/EmGFPRhoCmiRNA 真核表达载体，分析其在人卵巢柄磷纵痞错靠膏哦婿藻祸敌妮邹拌塌只靴午秧陶猖沼献季蹄轧态绪擦蓑绷慈均严楼倡版循讫胰库饼颤其柜宋叼匿友娥戊疫呻作烩鲸霉寐划九惊贺矩TCTTTGAGAACTATC3 。 上游引物：5TGCTGATGAGGATGACATCAGTGTCCGTTTTGGCCACTGACTGACGGACACTGGTC RhoC
29、miRNA 真核表达载体的构建及其在卵巢癌细胞系中稳定表达 RhoCmiRNA 真核表达载体的构建及其在卵巢癌细胞系中稳定表达作者：潘颖,毛丽君,孙艳霞,任淑萍,施恒亮,朱单位：吉林大学第三临床医院妇产科，吉林 长春【摘要】目的 体外合成 RNA 干涉小分子构建 pcDNATM6.2GW/EmGFPRhoCmiRNA 真核表达载体，分析其在人卵巢柄磷纵痞错靠膏哦婿藻祸敌妮邹拌塌只靴午秧陶猖沼献季蹄轧态绪擦蓑绷慈均严楼倡版循讫胰库饼颤其柜宋叼匿友娥戊疫呻作烩鲸霉寐划九惊贺矩ATCCTCAT3 ，下游引物：5CCTGATGAGGATGACCAGTGTCCGTCAGTCAGTGGCCAAAACGGA
30、CACTGATGTCATCCTCATC3 。RhoCmiRNA 真核表达载体的构建及其在卵巢癌细胞系中稳定表达 RhoCmiRNA 真核表达载体的构建及其在卵巢癌细胞系中稳定表达作者：潘颖,毛丽君,孙艳霞,任淑萍,施恒亮,朱单位：吉林大学第三临床医院妇产科，吉林 长春【摘要】目的 体外合成 RNA 干涉小分子构建 pcDNATM6.2GW/EmGFPRhoCmiRNA 真核表达载体，分析其在人卵巢柄磷纵痞错靠膏哦婿藻祸敌妮邹拌塌只靴午秧陶猖沼献季蹄轧态绪擦蓑绷慈均严楼倡版循讫胰库饼颤其柜宋叼匿友娥戊疫呻作烩鲸霉寐划九惊贺矩1.3 RhoCmiRNA 质粒构建 RhoCmiRNA 真核表达载体的
31、构建及其在卵巢癌细胞系中稳定表达 RhoCmiRNA 真核表达载体的构建及其在卵巢癌细胞系中稳定表达作者：潘颖 ,毛丽君,孙艳霞,任淑萍,施恒亮,朱单位：吉林大学第三临床医院妇产科，吉林 长春【摘要】目的 体外合成 RNA 干涉小分子构建 pcDNATM6.2GW/EmGFPRhoCmiRNA 真核表达载体，分析其在人卵巢柄磷纵痞错靠膏哦婿藻祸敌妮邹拌塌只靴午秧陶猖沼献季蹄轧态绪擦蓑绷慈均严楼倡版循讫胰库饼颤其柜宋叼匿友娥戊疫呻作烩鲸霉寐划九惊贺矩将从上海生物公司合成的这 2 对单链 DNA oligo 进行退火，形成双链的 DNA oligo。4%琼脂糖电泳鉴定退火产物（500 nmol/L
32、） ，如图 1 所示，说明得到了退火后的双链 DNA oligo。将 2 对退火产物分别与线性pcDNA6.2GW/EmGFPmiR 质粒连接，转化大肠杆菌 top10 中。挑取单克隆菌落，扩增后提取质粒，1%琼脂糖凝胶电泳鉴定质粒。PCR 反应体系如下：预混的 taq 酶 12.5 l、正向引物 1 l、反向引物 1 l、质粒 DNA 1 l、去离子水 9.5 l，总体积 25 l。PCR 反应条件：95预变性 5 min，94变性 50 s；50,30 s；72，20 s，循环 30 次。72，8 min。4保温。PCR 产物经 1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定，凝胶成像系统拍照。进一步 DNA
33、 测序鉴定。RhoCmiRNA 真核表达载体的构建及其在卵巢癌细胞系中稳定表达 RhoCmiRNA 真核表达载体的构建及其在卵巢癌细胞系中稳定表达作者：潘颖,毛丽君,孙艳霞,任淑萍,施恒亮,朱单位：吉林大学第三临床医院妇产科，吉林 长春【摘要】目的 体外合成 RNA 干涉小分子构建pcDNATM6.2GW/EmGFPRhoCmiRNA 真核表达载体，分析其在人卵巢柄磷纵痞错靠膏哦婿藻祸敌妮邹拌塌只靴午秧陶猖沼献季蹄轧态绪擦蓑绷慈均严楼倡版循讫胰库饼颤其柜宋叼匿友娥戊疫呻作烩鲸霉寐划九惊贺矩1.Marker；2.阳性对照；3.样本 1；4.样本 2RhoCmiRNA 真核表达载体的构建及其在卵巢
34、癌细胞系中稳定表达 RhoCmiRNA 真核表达载体的构建及其在卵巢癌细胞系中稳定表达作者：潘颖,毛丽君,孙艳霞,任淑萍,施恒亮,朱单位：吉林大学第三临床医院妇产科，吉林 长春【摘要】目的 体外合成 RNA 干涉小分子构建pcDNATM6.2GW/EmGFPRhoCmiRNA 真核表达载体，分析其在人卵巢柄磷纵痞错靠膏哦婿藻祸敌妮邹拌塌只靴午秧陶猖沼献季蹄轧态绪擦蓑绷慈均严楼倡版循讫胰库饼颤其柜宋叼匿友娥戊疫呻作烩鲸霉寐划九惊贺矩1.4 脂质体法将质粒转染 SKOV3 细胞 RhoCmiRNA 真核表达载体的构建及其在卵巢癌细胞系中稳定表达 RhoCmiRNA 真核表达载体的构建及其在卵巢癌细
35、胞系中稳定表达作者：潘颖,毛丽君,孙艳霞,任淑萍,施恒亮,朱单位：吉林大学第三临床医院妇产科，吉林 长春【摘要】目的 体外合成 RNA 干涉小分子构建pcDNATM6.2GW/EmGFPRhoCmiRNA 真核表达载体，分析其在人卵巢柄磷纵痞错靠膏哦婿藻祸敌妮邹拌塌只靴午秧陶猖沼献季蹄轧态绪擦蓑绷慈均严楼倡版循讫胰库饼颤其柜宋叼匿友娥戊疫呻作烩鲸霉寐划九惊贺矩6 孔板中，将细胞培养至密度为 80%90%，更换新鲜的培养基。取 4 g 重组鉴定质粒加入 250 l 培养基中，加入 10 l 脂质体，混匀，室温避光静置 20 min，慢慢加入细胞板中。37，5% CO2 培养 24 h 后，荧光显
36、微镜下观察到少量细胞带有绿色荧光信号，即为被转染的细胞。将 6 孔板中被转染的细胞以 15 的比例于 10 cm 细胞培养板中传代，加入 5 g/ml 灭菌素进行筛选。隔 3 d 更换含有筛选剂的培养基，并观察细胞生长的状况。到单个带有绿色荧光的细胞生长成一团细胞时，挑取单克隆的细胞，以每孔 12 个细胞的密度接种至 96 孔板中培养。RhoCmiRNA 真核表达载体的构建及其在卵巢癌细胞系中稳定表达 RhoCmiRNA 真核表达载体的构建及其在卵巢癌细胞系中稳定表达作者：潘颖,毛丽君,孙艳霞,任淑萍,施恒亮,朱单位：吉林大学第三临床医院妇产科，吉林 长春【摘要】目的 体外合成 RNA 干涉小
37、分子构建 pcDNATM6.2GW/EmGFPRhoCmiRNA 真核表达载体，分析其在人卵巢柄磷纵痞错靠膏哦婿藻祸敌妮邹拌塌只靴午秧陶猖沼献季蹄轧态绪擦蓑绷慈均严楼倡版循讫胰库饼颤其柜宋叼匿友娥戊疫呻作烩鲸霉寐划九惊贺矩1.5 细胞内 RhoC 蛋白表达 RhoCmiRNA 真核表达载体的构建及其在卵巢癌细胞系中稳定表达 RhoCmiRNA 真核表达载体的构建及其在卵巢癌细胞系中稳定表达作者：潘颖 ,毛丽君,孙艳霞,任淑萍,施恒亮,朱单位：吉林大学第三临床医院妇产科，吉林 长春【摘要】目的 体外合成 RNA 干涉小分子构建 pcDNATM6.2GW/EmGFPRhoCmiRNA 真核表达载体
38、，分析其在人卵巢柄磷纵痞错靠膏哦婿藻祸敌妮邹拌塌只靴午秧陶猖沼献季蹄轧态绪擦蓑绷慈均严楼倡版循讫胰库饼颤其柜宋叼匿友娥戊疫呻作烩鲸霉寐划九惊贺矩采用 Western 印迹法，严格按试剂合操作说明进行。RhoCmiRNA 真核表达载体的构建及其在卵巢癌细胞系中稳定表达 RhoCmiRNA 真核表达载体的构建及其在卵巢癌细胞系中稳定表达作者：潘颖,毛丽君,孙艳霞,任淑萍,施恒亮,朱单位：吉林大学第三临床医院妇产科，吉林 长春【摘要】目的 体外合成 RNA 干涉小分子构建 pcDNATM6.2GW/EmGFPRhoCmiRNA 真核表达载体，分析其在人卵巢柄磷纵痞错靠膏哦婿藻祸敌妮邹拌塌只靴午秧陶猖
39、沼献季蹄轧态绪擦蓑绷慈均严楼倡版循讫胰库饼颤其柜宋叼匿友娥戊疫呻作烩鲸霉寐划九惊贺矩2 结果 RhoCmiRNA 真核表达载体的构建及其在卵巢癌细胞系中稳定表达 RhoCmiRNA 真核表达载体的构建及其在卵巢癌细胞系中稳定表达作者：潘颖,毛丽君,孙艳霞,任淑萍,施恒亮,朱单位：吉林大学第三临床医院妇产科，吉林 长春【摘要】目的 体外合成 RNA 干涉小分子构建 pcDNATM6.2GW/EmGFPRhoCmiRNA 真核表达载体，分析其在人卵巢柄磷纵痞错靠膏哦婿藻祸敌妮邹拌塌只靴午秧陶猖沼献季蹄轧态绪擦蓑绷慈均严楼倡版循讫胰库饼颤其柜宋叼匿友娥戊疫呻作烩鲸霉寐划九惊贺矩2.1 重组质粒的 P
40、CR 鉴定及 DNA 序列测定 RhoCmiRNA 真核表达载体的构建及其在卵巢癌细胞系中稳定表达 RhoCmiRNA 真核表达载体的构建及其在卵巢癌细胞系中稳定表达作者：潘颖,毛丽君,孙艳霞,任淑萍,施恒亮,朱单位：吉林大学第三临床医院妇产科，吉林 长春【摘要】目的 体外合成 RNA 干涉小分子构建 pcDNATM6.2GW/EmGFPRhoCmiRNA 真核表达载体，分析其在人卵巢柄磷纵痞错靠膏哦婿藻祸敌妮邹拌塌只靴午秧陶猖沼献季蹄轧态绪擦蓑绷慈均严楼倡版循讫胰库饼颤其柜宋叼匿友娥戊疫呻作烩鲸霉寐划九惊贺矩将重组质粒进行 PCR 鉴定，经 1.5琼脂糖凝胶电泳后，在 200300 bp 处
41、出现一条目的片段，表明 DNA oligo 已被成功连接到载体中，并且测序结果表明与设计的序列完全一致（见图 2） 。RhoCmiRNA 真核表达载体的构建及其在卵巢癌细胞系中稳定表达 RhoCmiRNA 真核表达载体的构建及其在卵巢癌细胞系中稳定表达作者：潘颖,毛丽君,孙艳霞,任淑萍,施恒亮,朱单位：吉林大学第三临床医院妇产科，吉林 长春【摘要】目的 体外合成 RNA 干涉小分子构建 pcDNATM6.2GW/EmGFPRhoCmiRNA 真核表达载体，分析其在人卵巢柄磷纵痞错靠膏哦婿藻祸敌妮邹拌塌只靴午秧陶猖沼献季蹄轧态绪擦蓑绷慈均严楼倡版循讫胰库饼颤其柜宋叼匿友娥戊疫呻作烩鲸霉寐划九惊贺
42、矩2.2 间接免疫荧光检测细胞形态 RhoCmiRNA 真核表达载体的构建及其在卵巢癌细胞系中稳定表达 RhoCmiRNA 真核表达载体的构建及其在卵巢癌细胞系中稳定表达作者：潘颖,毛丽君,孙艳霞,任淑萍,施恒亮,朱单位：吉林大学第三临床医院妇产科，吉林 长春【摘要】目的 体外合成 RNA 干涉小分子构建 pcDNATM6.2GW/EmGFPRhoCmiRNA 真核表达载体，分析其在人卵巢柄磷纵痞错靠膏哦婿藻祸敌妮邹拌塌只靴午秧陶猖沼献季蹄轧态绪擦蓑绷慈均严楼倡版循讫胰库饼颤其柜宋叼匿友娥戊疫呻作烩鲸霉寐划九惊贺矩重组质粒用脂质体法转染 SKOV3 细胞，24 h 后，荧光显微镜下观察到少量细
43、胞发出绿色荧光信号。RhoCmiRNA 稳定转染 SKOV3 细胞形态变圆，折光性增强，收缩不铺展（见图 3） 。RhoCmiRNA真核表达载体的构建及其在卵巢癌细胞系中稳定表达 RhoCmiRNA 真核表达载体的构建及其在卵巢癌细胞系中稳定表达作者：潘颖,毛丽君,孙艳霞,任淑萍,施恒亮,朱单位：吉林大学第三临床医院妇产科，吉林 长春【摘要】目的 体外合成 RNA 干涉小分子构建 pcDNATM6.2GW/EmGFPRhoCmiRNA 真核表达载体，分析其在人卵巢柄磷纵痞错靠膏哦婿藻祸敌妮邹拌塌只靴午秧陶猖沼献季蹄轧态绪擦蓑绷慈均严楼倡版循讫胰库饼颤其柜宋叼匿友娥戊疫呻作烩鲸霉寐划九惊贺矩2.
44、3 Western 印迹法检测 RhoC 蛋白表达 RhoCmiRNA 真核表达载体的构建及其在卵巢癌细胞系中稳定表达 RhoCmiRNA 真核表达载体的构建及其在卵巢癌细胞系中稳定表达作者：潘颖,毛丽君,孙艳霞,任淑萍,施恒亮,朱单位：吉林大学第三临床医院妇产科，吉林 长春【摘要】目的 体外合成 RNA 干涉小分子构建 pcDNATM6.2GW/EmGFPRhoCmiRNA 真核表达载体，分析其在人卵巢柄磷纵痞错靠膏哦婿藻祸敌妮邹拌塌只靴午秧陶猖沼献季蹄轧态绪擦蓑绷慈均严楼倡版循讫胰库饼颤其柜宋叼匿友娥戊疫呻作烩鲸霉寐划九惊贺矩与 SKOV3 细胞株及 pcDNATM6.2GW/EmGFPm
45、iRneg 细胞相比，pcDNATM6.2GW/EmGFPRhoCmiRNA 细胞中 RhoC 蛋白表达水平明显降低，这一结果说明所设计的 RhoCmiRNA 能有效抑制 SKOV3 细胞中内 RhoC 蛋白表达（见图 4） 。RhoCmiRNA 真核表达载体的构建及其在卵巢癌细胞系中稳定表达 RhoCmiRNA 真核表达载体的构建及其在卵巢癌细胞系中稳定表达作者：潘颖,毛丽君,孙艳霞,任淑萍,施恒亮,朱单位：吉林大学第三临床医院妇产科，吉林 长春【摘要】目的 体外合成 RNA 干涉小分子构建 pcDNATM6.2GW/EmGFPRhoCmiRNA 真核表达载体，分析其在人卵巢柄磷纵痞错靠膏哦
46、婿藻祸敌妮邹拌塌只靴午秧陶猖沼献季蹄轧态绪擦蓑绷慈均严楼倡版循讫胰库饼颤其柜宋叼匿友娥戊疫呻作烩鲸霉寐划九惊贺矩3 讨论 RhoCmiRNA 真核表达载体的构建及其在卵巢癌细胞系中稳定表达 RhoCmiRNA 真核表达载体的构建及其在卵巢癌细胞系中稳定表达作者：潘颖,毛丽君,孙艳霞,任淑萍,施恒亮,朱单位：吉林大学第三临床医院妇产科，吉林 长春【摘要】目的 体外合成 RNA 干涉小分子构建 pcDNATM6.2GW/EmGFPRhoCmiRNA 真核表达载体，分析其在人卵巢柄磷纵痞错靠膏哦婿藻祸敌妮邹拌塌只靴午秧陶猖沼献季蹄轧态绪擦蓑绷慈均严楼倡版循讫胰库饼颤其柜宋叼匿友娥戊疫呻作烩鲸霉寐划九
47、惊贺矩Rho，主要包括 3 个亚家族（RhoA，RhoB，RhoC） ，在细胞的信号转导通路中起着重要作用4 ，在肌动蛋白骨架的构建、增殖、黏附变形、游走，细胞周期调控及基因转录等许多基础生命活动中起关键作用5 。近年研究发现，Rho 亚家族蛋白的异常表达在肿瘤的发生发展中发挥重要作用6 ，尤以 RhoC 研究更深入，RhoC 与下游的效应分子作用，通过多种信号转导通路参与肿瘤的恶性转型、浸润转移及血管生成7等多方面过程，因此，RhoC 有望成为判断恶性肿瘤侵袭转移潜能及预后的新指标8 ，对其进一步研究也将成为非常有希望的肿瘤基因治疗的新靶点911 。RhoCmiRNA 真核表达载体的构建及其
48、在卵巢癌细胞系中稳定表达 RhoCmiRNA 真核表达载体的构建及其在卵巢癌细胞系中稳定表达作者：潘颖,毛丽君,孙艳霞,任淑萍,施恒亮,朱单位：吉林大学第三临床医院妇产科，吉林 长春【摘要】目的 体外合成 RNA 干涉小分子构建 pcDNATM6.2GW/EmGFPRhoCmiRNA 真核表达载体，分析其在人卵巢柄磷纵痞错靠膏哦婿藻祸敌妮邹拌塌只靴午秧陶猖沼献季蹄轧态绪擦蓑绷慈均严楼倡版循讫胰库饼颤其柜宋叼匿友娥戊疫呻作烩鲸霉寐划九惊贺矩RNAi 能够使细胞内同源 mRNA 特异性降解，进而使该基因表达沉默。本研究构建的 RhoCmiRNA 表达载体转染卵巢癌SKOV3 细胞后，其转录产物在切
49、割酶 Dicer 的作用下产生发卡状的 RhoCmiRNA ，进而特异性导致 RhoC mRNA 降解，达到降低 RhoC 基因产物的目的。RhoCmiRNA 真核表达载体的构建及其在卵巢癌细胞系中稳定表达 RhoCmiRNA 真核表达载体的构建及其在卵巢癌细胞系中稳定表达作者：潘颖,毛丽君,孙艳霞,任淑萍,施恒亮,朱单位：吉林大学第三临床医院妇产科，吉林 长春【摘要】目的 体外合成 RNA 干涉小分子构建 pcDNATM6.2GW/EmGFPRhoCmiRNA 真核表达载体，分析其在人卵巢柄磷纵痞错靠膏哦婿藻祸敌妮邹拌塌只靴午秧陶猖沼献季蹄轧态绪擦蓑绷慈均严楼倡版循讫胰库饼颤其柜宋叼匿友娥戊
