1、临床检验中的发光免疫分析,由于化学反应（通常是氧化）或生物化学反应产生电子能级处于激发态的物质，后者通过跃迁释放能量并产生光子，从而导致的发光现象。与荧光最大的区别在于无需激发光，因此后者也被称为光致发光。,发光（Luminescence） 化学发光（Chemiluminescence） 生物发光（Bioluminescence）,生物发光和化学发光均属于冷光，即发光不是由于发光体温度升高所致，因此其反应能量绝大部分用于发光而不是发热，发射波长也与温度无关。,发光测定属发射光谱分析，多采用动力/速率法或积分法，无需终止反应，也不受朗伯-比尔定律限制；而酶标显色测定属吸收光谱分析，多采用终点法，
2、需终止反应，并受朗伯-比尔定律限制。,按化学反应类型,化学发光的分类,酶促化学发光：辣根过氧化物酶系统碱性磷酸酶系统黄嘌呤氧化酶系统 非酶促化学发光：吖啶酯系统草酸酯系统三价铁-鲁米诺系统,闪光（Flash）:,按发光持续时间,发光时间在数十分钟以上，如： HRP-Luminol系统AP-AMPPD系统黄嘌呤氧化酶系统 无须原位进样、 以速率法测量。,发光时间在数秒内，如吖啶酯 以原位进样(In Situ Injector) 和时间积分法测量,辉光（Glow）:,时间,发光信号,辉光坪区,速率法测量,原位进样,积分法测量,闪光尖峰,闪光与辉光及其测量方式的差别,鲁米诺及其衍生物的增敏化学发光系
3、统,商业化产品中常见的化学发光系统（一）,AMPPD及其衍生物的化学发光系统,+,*,光子(477nm),AP,O,O,OCH3,OPO32-,O-,O,O,OCH3,商业化产品中常见的化学发光系统（二）,商业化产品中常见的化学发光系统（三）,吖啶酯化学发光系统,发光检测的剂量-反应关系曲线,信号强度（Y）,实际曲线,标记物浓度（X）,理论/校正曲线,由于：不同发光体系和免疫分析模式具有不同的实际信号曲线 因此：科学准确的特定校正技术是衡量设备和试剂匹配性的关键,发光信号检测,光敏二极管、光敏电池、光电偶合器（CCD）,结构简单、性能稳定 但灵敏度低、线性范围较窄。,主要特点,原理：,光信号,
4、光电转换器件,电压或电流信号,放大,单光子计数器是目前高灵敏度 发光分析仪的核心部件,光电倍增管,高压,高速放大器,高速比较器,高速分频器,发光样品 产生光子,激发光阴极 产生光电子,在阳极上形成较强信号,脉冲信号,相对发光单位 数字脉冲(RLU),在各打拿极之间得到 能量和数目的倍增,单光子计数器的工作特性,光子计数（Y）,发光强度（X）,饱和点,理论/校正曲线,实际计数曲线,由于：单光子计数是在检测随机光子事件 因此：随光子数量增多检测效率持续下降 所以：准确的校正技术是设备品质的关键,模拟（光电流）测量曲线,单光子计数式发光检测仪,计 算 机,打 印 机,发光仪控制模块,发光仪执行模块,
5、控制器,程控高压,计数/贮存器,单光子计数器,样品运动/定位装置,程控自动门锁及检测装置,原位注射泵,光生物学技术的应用范围,军事侦测 公安稽查 卫生检疫 药物筛查 医学诊断 环境检测 航天遥感 生命科学 ,已成为现代生物技术最活跃的领域之一,光生物学检测技术的优越性,彻底消除了放射性危害 无半衰期限制，试剂稳定性和有效期大大延长 容易实现连续、动态、重复测定,适合于复合标记系统进行多指标并行测定 操作简单，反应速度快，容易实现自动化 灵敏度和线性范围超过以往技术,几种标记/检测技术理论极限灵敏度的比较,酶标,荧光,放免,发光,灵敏度(mol/L),10-1810-1510-1210-9,几种
6、标记/检测技术理论线性范围的比较,酶标,荧光,放免,发光,线性范围,105104103102,几种标记/检测试剂的有效期比较,酶标,荧光,放免,发光,有效期（月）,1815129630,人民币,人民币,三种免疫测定技术的成本及费用,三种免疫测定技术的成本及费用,放免,酶标,发光,夹心法的剂量-反应关系曲线,信号强度（Y）,线性范围,待测物浓度（X）,Hook(前滞)效应,分析灵敏度（最低检测限）（95%可信度）：S0+2SD在该曲线上所对应的浓度值。 功能灵敏度：测定误差（变异）20%的最低可检测浓度。 线性范围：（分析）功能灵敏度-变异20%的最高检测浓度相关系数0.99的曲线范围,竞争法的
7、剂量-反应关系曲线,待测物浓度（ X ）,信号强度（ Y ）,线性范围,分析灵敏度（最低检测限）（95%可信度）：S0-2SD在该曲线上所对应的浓度值 功能灵敏度：测定误差（变异）20%的最低可检测浓度 线性范围：（分析）功能灵敏度-变异20%的最高检测浓度相关系数0.99的曲线范围,发光免疫分析技术 的现状及应注意的问题,商品化光生物学标记检测技术性能比较,化学发光：Chemiluminescence 时间分辨荧光（也称时间延迟光致发光）Time Resolved Fluorescence（Time Delayed Photoluminescence） 标记物为稀土元素络合物，通常采用解离增
8、强荧光免疫分析（DEFIA） 电化学发光（也称场致发光）Electrochemiluminescence（Electroluminescence）标记物为稀土元素络合物,例如：电化学发光TSH检测试剂的分析灵敏度为0.005mIU/L第四代化学发光TSH检测试剂的分析灵敏度为0.001mIU/L原因在于抗体的亲合力，而不是检测技术。,抗体筛选、干扰屏蔽，生产工艺、管理水平和技术服务是决定产品性能的关键,某些产品宣称的灵敏度远超过免疫反应的理论极限10-19mol/L 即：六个待测物分子/ 100ul样品,就发光分析而言，制约灵敏度的瓶颈在于抗体亲合力和干扰因素，而不是检测技术。,所以，片面宣扬
9、检测技术灵敏度和线性范围的强弱，不仅毫无意义，而且也是荒谬的。,商品化发光免疫分析产品的某些宣传误区,C肽,胰 岛 素,免疫源性胰岛素,胰 岛 素,胰岛素原,真胰岛素,胰岛素,针对掩蔽性抗原,抗体选择胰岛素,多抗或无选择性单抗, 亚 单 位, 亚 单 位, 亚 单 位,普通HCG, 亚 单 位,HCG, 亚 单 位, 亚 单 位,HCG游离亚单位, 亚 单 位,X,抗体选择HCG (TSH、PRL、LH、FSH类似),多抗或无选择性单抗,针对掩蔽性抗原, 亚单位特异,亚单位特异, 亚单位特异, 亚单位特异,结合蛋白,PSA,总PSA,PSA,游离PSA,抗体选择游离PSA,针对掩蔽性抗原,针对
10、非掩蔽性抗原 与结合和游离PSA等分子结合,小分子性激素测定方法的进展,减少 结合蛋白 类似物 前体 代谢产物 干扰,直接测定法,经典方法,消化样品 萃取有机相 分子筛柱分离各类甾体 测定,血清直接测定 + 高特异性单抗 + 结合蛋白屏蔽技术,男女性激素和皮质激素均来源于共同的前体和合成、代谢途径，其结构也非常相似；而且普遍与血清中的某些蛋白结合。 因此，皮质功能紊乱、肝肾功能紊乱、某些遗传缺陷、血清蛋白异常、服用类固醇药物等均可造成这些激素测定结果的异常。,游离甲状腺激素测定方法的进展,常见甲功指标：TSH、FT3、FT4、TT3、TT4对甲亢的诊断价值依次为：TSH=FT3FT4TT3TT
11、4对甲低的诊断价值依次为：FT4=TSHTT4FT3TT3,但FT3 、 FT4灵敏度要求高，且易受干扰 发光法提高了灵敏度，使得其临床应用普遍性超过TT4和TT3,两步法 操作时间长 灵敏度差 准确性差,类似物法 操作时间短 灵敏度较好 准确性较好,反向竞争法 （标记抗体） 操作时间短 灵敏度更好 准确性更好,第一代（放免）,第二代,第三代,血清FT3 、 FT4试剂盒的发展 （消除结合蛋白对测定的影响）,测定游离激素的参考方法（“金”标准）：平衡透析法（透析液过多可导致测值偏高）操作复杂、采样量大，不适于临床常规,游离激素测定法的试金石稀释实验 以游离T4为例,样品稀释20倍以内测值无明显
12、变化 （应扣除实验本身对样品的稀释度并注意基质效应,建议用6-8%BSA稀释）,FT4 + TBG,K,T4TBG,游离 T4,游离结合蛋白,结合常数,结合T4,其中：K=,由于绝大部分T4呈结合状态，因此：T4TBGTT4(总T4); TBG总TBGTT4,故， K,所以，样品被稀释N倍后，,T4TBG FT4 TBG,TT4 FT4 (总TBGTT4),(固定常数，不变),TT4 K(总TBGTT4),TT4/N K (总TBG/NTT4 /N),FT4,=,TT4/N K (总TBGTT4)/N,=,TT4 K(总TBGTT4),相 同,即， FT4,发光技术 临床免疫分析划时代的进步,
13、以TSH(促甲状腺素)为例,第一代 TSH检测试剂盒,普通放免 功能灵敏度1-2mIU/L 基本无法测到正常值 下限以下的血清TSH 对甲亢的诊断意义不大,固相放免 功能灵敏度 0.1-0.2mIU/L 在甲亢的诊断中 开始发挥作用,第二代 TSH检测试剂盒,发光免疫 功能灵敏度 0.01-0.02mIU/L 成为甲亢诊断的 首选指标之一,新型发光免疫 功能灵敏度 0.001-0.002mIU/L 更新了部分临床概念 改写了甲功的调控理论,第三代 TSH检测试剂盒,第四代 TSH检测试剂盒,目前商品化发光免疫分析产品的几个特点,大多采用全自动工作方式，部分采用微孔板半自动方式 多采用磁性或非磁
14、性微粒包被，以增加表面积，使反应时间缩短 使用内建标准曲线加校正的办法产生工作曲线 部分产品采用流动池测定方式(适合于闪光型发光或电化学发光),流动池检测方式示意图,检测器,检测池,负压泵,废液,四通阀,冲洗液,样品管,计量泵,干燥空气,原位进样泵,氧化剂,优点：结构简单，运行成本低 缺点：易产生交叉污染，工作效率受限,标准化自动化免疫分析系统对试剂盒的技术要求,对仪器的要求：结构简单、运行效率高、故障率低、维护费用少 对试剂盒的相应要求：标准化、成套化、简单化，具体为：反应/洗涤/测定条件一致；操作步骤少且趋于一致反应时间短； 通用成分多、专用成分少措施 统一标记/检测系统 重新优化并统一反
15、应/洗涤/测定条件和操作步骤 改变包被模式：微粒包被：反应效率，反应时间；散射干扰 、离子干扰 （磁珠）间接包被：反应效率，反应时间；散射干扰 、检测效率注意内源性物质干扰！（生物素-亲合素系统）微粒+间接包被：,间接包被夹心法原理,包被体,待测抗原,间接包被物,标记抗体,俘获抗体,特点：所有试剂盒均采用同一包被物和结合配体,结合配体,工作曲线的特点与校正原理,工作曲线四要素 拟合方式：描述曲线基本形状，取决于实验模式和剂量-效应关系走向。 截距：描述曲线位置，修正依据为本底信号和系统误差，修正后导致曲线平移。 斜率：描述曲线俯仰角度，修正依据为结合/反应/检测效率。修正后导致曲线旋转。 变形
16、因子：调整曲线形状（取决于抗体活性和特异干扰因素变化）,信 号 强 度 （Y）,待测物浓度（X）,基本形状,平移,旋转,变形,常见拟合方式的性质及其参数的含义,X：待测物浓度； Y：信号强度； Y0：零浓度样品信号强度; N：非特异结合信号强度（NSB）,漂亮的拟合曲线决不是实验结果准确的唯一保证！ 定值/非定值质控血清才是监控数据可靠性的主要手段！（谨防作弊软件）,使用商品化发光免疫分析产品 可能遇到的几个问题,与以往方法（放免等）在检测指标的正常值及临床意义上的差异。如：免疫源性胰岛素与真胰岛素、HCG、性激素等 采用不同的单抗或多抗时检测结果也有较大差异。（单抗特异性好，受干扰小，因此测
17、值低） 不同厂家产品测定结果之间一致性差（未与国家标准品比对）。 所使用的内建标准曲线结合校正的方法不尽完善。 部分产品不显示原始数据，无法监控其准确性。,免疫分析结果的干扰因素,温度,氧化剂,还原剂,光线,磁场,金属离子,防腐剂,杂质,本底物质,结合蛋白 （测定小分子）,同一干扰因素对不同检测方法的不同影响,待测物,包被（结合）抗体,放免法,免放或发光法,标记抗原,TBG,离心沉降,洗 涤 祛 除,以甲状腺素结合蛋白（TBG）干扰竞争法测定T3为例,信号 结果,信号 结果,使用商品化发光免疫分析产品 必须做好的几个工作,在厂家提供的数据基础上，自行建立正常参考值系统。 明确各个试剂盒的特异性
18、及交叉反应情况如：小分子激素之间，以及与自身前体或代谢物之间的交叉胰岛素与C-肽、胰岛素原之间的交叉FSH、LH、HCG之间的交叉。,充分利用现有国标参考品校正结果（注意防腐剂干扰）（可以从国家药品生物制品检定所或临床检验中心得到） 自行建立多点质控（2-3点）监控每次实验的准确性。,尽可能避免干扰因素采样：清洁样品管（防止还原剂干扰）、不使用酶抑制剂、及时送检实验室：恒温、避免强光和强磁场、严格操作规程、及时维护、报修,正常值参考的意义及灰色区域的存在,如果测定结果处于灰色区域（约在正常值上下限以内20%）内，则需要进一步追踪检查。,95%或99%,-20%,+20%,自身基础数据 最佳“正
19、常参考值”,对于患者来讲，最佳的参考值是自己以往的测定数据，即自身对照； 因此积累病人的基础数据非常重要。 尤其是性激素、生长激素、胰岛素等具有周期性分泌或释放规律的激素。,时间,FSH,卵泡期 排卵期 黄体期 月经期,正常人平均值变化规律,正常参考值范围,某一患者变化规律（无排卵峰）,灵敏度（真阳性率）：对真阳性病例的检出率，即=检出阳性病例数/总受检阳性病例数 特异度（真阴性率）：对真阴性病例报阴性的比率， 即=报阴性结果数/总受检正常人数若某肿瘤筛查法的指标达到理论极限，即灵敏度100%，特异度99%（正常值为99%可信限） 而肿瘤的发病率多在十万分之三十以下，因此其应用于正常人群体检时
20、，总阳性病例可能为： 30+（100,000-30）（1-99%）=30+999.71030； 其中，假阳性率=999.7/1030 100%=97%绝大部分为假阳性！ 因此，筛查指标的意义在于高危人群的早期预警，而决不是疾病确诊！改进办法：采用多个厂家的产品或多指标联合测定（艾滋、肿瘤）串联实验：多个检测均阳性才定为阳性，假阳性（误诊），假阴性（漏诊）并联实验：一个指标阳性就定为阳性，假阳性（误诊） ，假阴性（漏诊） 取舍原则：分别对误诊和漏诊带来的医学、经济、社会、伦理风险综合分析平衡,低发病率疾病的筛查指标用于普通人群 产生的巨大“困惑”,化验结果与临床不符的原因,由于个体差异或不明干扰
21、因素的存在，总有少数病例的化验结果与其临床表现不符,操作失误、 仪器故障、 试剂失活等因素,一步夹心法测值低 可能存在前滞效应,药物以及其它 基础疾病的干扰,排除这些因素后 重复测定或重复送样,用同试剂盒的校准品A 稀释后再重新测定,及时与临床沟通 结合说明书综合判断,原因,解决,所有夹心法均强信号 往往存在异嗜性抗体,用小鼠血清稀释样品 找厂家索取拮抗剂,不同实验方法， 或同一方法的不同厂家产品之间， 其测定结果和临床正常值都会有所差异,不同实验室环境和不同人群条件下， 其测定结果和临床正常值也会有所不同,在厂家提供的正常参考值基础上 建立自己的正常参考系统,待测物的降解及其与血清蛋白结合状态的改变 检测结果受标本存放时间及条件的影响,及时采样、送检， 实验室及时完成化验， 严格按照试剂盒说明书要求存放,
