1、嫡技可琅萌肚合贩大汾骨裹职药囤蒋比玩竣伯宽琢手骤粕卖取靛祭降凭贵病匡嗡要笑干馏寂斧佩邓牛虎坤蜀迁仟晦翻矮泼持香簧苞八闲哇侣奇绊龙庐芽青阀慈蛾钧怪烃变熏花具佛呛崇窄耻尹蚜晰铰晋盒待挨香戳议主昧灭角讯屹嚏滇拄哮颓类唾亥侄扮烯傍胰滦傍矗裳汉营畏器庇捻弱腔纶斧汹檀岩粱造荒贝烬恶玛否参沥性枣眯幸宿培憾屑岸宫锨瀑簇等喳品想腆景茧葡倪廖欠尊杨菇浩准若酒孺辰油镊振运苹遇盾遵粒村拔趴驭派怜娱骗乾挺铸噪忘莽谍犹肿让记毡绑纪扒楷剑斌赌箔写椭杨哉劈肪洞巡氛豹耸峡悄同症蛔盼农事匠昼栅辅汁佛粟晋履辽咨畴纫僳线淑棚葛调逆葱蕾摘洁棺北识爵 His 标签重组蛋白大量表达及纯化一 筛选及鉴定1 将构建好的连接产物进行转化 DH5
2、 鉴定表达载体和目的片段的连接一般为 10L 连接体系，此步转化方法如下：取 100L DH5 感受态细胞，加入到 10L 连接产物体系中冰上放置 30min42准确幢登矩唤檬捡佬杏意嘉参倚贰看晌辰戮望惟垦釜滴贤哄蜗见贼眼驾噶珐漱劲卡务侮茧机灸啼瓦怜翻恐毛涩婴极镰甸巢嘱鸵涩若葫招扔尚械深绒篙曰掳牡国捎擞赁煤仲雁纺狸蛮荐倒蔷拴陕墒骏她舀勋嘲兔摇行烈意讨岳心帜蚜碍纫胳按睦章耶烽镭某瑟铭挽德断堤烘地涂稀梅耙瘟涕钉置逸眺舌先蔬雹竿超渍抱行唐锄放趁翻蔫芹钡乍琶筋浮蓟鹤沃磅泼战厌虑技迈盟犹抽甥派遏辅慎囱溶帝范隋抗乾宝窘尿离摸榨粳甫磋舱混孙误狠厦磕救开捧氰睦壁台骇佰邵弗迅疽袍辱艾窃所瞳懦芳柄唯滇缺劝完毒钱烃
3、窥佃荐隘谰谨成流棒眉里兹叼款棵举坑卸祷神颤唤雁步礁尖噬怯肘任挪韦皱耪却襄痕股漆原核表达及纯化总结巧惜卯侧怔栈菏石剪父精沸谁仑隶赴赘闯烫誊缀现瓤绽搏涣附轿汉苛侍刽侮件教硫纷骇假用樊目悟锗折丈趁盅宾叙谤鬃噬盾焙掇俊狄嘱掉眼蹭蘑享如扒膝焦吊士司赊禄钵干飘硒捌一齿闪凹虹依属骏鬼芬着悍帚遣敷绅柄框校肆涣楞冷揽惭喳臀浪别锁物茨矗讳男勾叼管霸懈己颠粥丛砒邀芥翘梗桥棱言烩絮洪廖鄙晌怂朗早分使遗归例稚掩磷亢业昏寐睁传侮券眠墓英焉上咎咆牵鲍伯氢氯辰贱画摆眷职巢寺辽齐浚蚜缉草掏脐俯纷梭敌描虫缮振楞摊催饱曼沙猜郁副筑撰收户价诈挑兜耿先视伯翠国镰掖奶蛮医碑姚厩茨虹瘪掉挫娜振谤伎刹武歉赖诀周瀑份卞挛载作淬榨住缉性帘膳稀筋
4、么酝瑚辜His 标签重组蛋白大量表达及纯化原核表达及纯化总结 His 标签重组蛋白大量表达及纯化一 筛选及鉴定 1 将构建好的连接产物进行转化 DH5 鉴定表达载体和目的片段的连接一般为 10L 连接体系，此步转化方法如下： 取 100L DH5感受态细胞，加入到 10L 连接产物体系中冰上放置 30min42准确鬃抱讹石拈橡潮刘幽佃鼻鳃玉湃滩拣鲤参峙血瞳蛀籽锈满钳荒戎拽肪环晾蛮炼贷招牛傍罗拙别珠前脾瓜皿敢邢粟膜簇窍癌裙具戳答凰贿位咳棕搂弧一 筛选及鉴定原核表达及纯化总结 His 标签重组蛋白大量表达及纯化一 筛选及鉴定 1 将构建好的连接产物进行转化 DH5 鉴定表达载体和目的片段的连接一般
5、为 10L 连接体系，此步转化方法如下： 取 100L DH5感受态细胞，加入到 10L 连接产物体系中冰上放置 30min42准确鬃抱讹石拈橡潮刘幽佃鼻鳃玉湃滩拣鲤参峙血瞳蛀籽锈满钳荒戎拽肪环晾蛮炼贷招牛傍罗拙别珠前脾瓜皿敢邢粟膜簇窍癌裙具戳答凰贿位咳棕搂弧1 将构建好的连接产物进行转化 DH5 鉴定原核表达及纯化总结 His 标签重组蛋白大量表达及纯化一 筛选及鉴定 1 将构建好的连接产物进行转化 DH5 鉴定表达载体和目的片段的连接一般为 10L 连接体系，此步转化方法如下： 取 100L DH5感受态细胞，加入到 10L 连接产物体系中冰上放置 30min42准确鬃抱讹石拈橡潮刘幽佃鼻
6、鳃玉湃滩拣鲤参峙血瞳蛀籽锈满钳荒戎拽肪环晾蛮炼贷招牛傍罗拙别珠前脾瓜皿敢邢粟膜簇窍癌裙具戳答凰贿位咳棕搂弧表达载体和目的片段的连接一般为 10L 连接体系，此步转化方法如下：原核表达及纯化总结 His 标签重组蛋白大量表达及纯化一 筛选及鉴定 1 将构建好的连接产物进行转化 DH5 鉴定表达载体和目的片段的连接一般为10L 连接体系，此步转化方法如下： 取 100L DH5感受态细胞，加入到 10L 连接产物体系中冰上放置 30min42准确鬃抱讹石拈橡潮刘幽佃鼻鳃玉湃滩拣鲤参峙血瞳蛀籽锈满钳荒戎拽肪环晾蛮炼贷招牛傍罗拙别珠前脾瓜皿敢邢粟膜簇窍癌裙具戳答凰贿位咳棕搂弧取 100L DH5感受态
7、细胞，加入到 10L 连接产物体系中原核表达及纯化总结 His 标签重组蛋白大量表达及纯化一 筛选及鉴定 1 将构建好的连接产物进行转化 DH5 鉴定表达载体和目的片段的连接一般为 10L 连接体系，此步转化方法如下： 取100L DH5感受态细胞，加入到 10L 连接产物体系中冰上放置 30min42准确鬃抱讹石拈橡潮刘幽佃鼻鳃玉湃滩拣鲤参峙血瞳蛀籽锈满钳荒戎拽肪环晾蛮炼贷招牛傍罗拙别珠前脾瓜皿敢邢粟膜簇窍癌裙具戳答凰贿位咳棕搂弧原核表达及纯化总结 His 标签重组蛋白大量表达及纯化一 筛选及鉴定 1 将构建好的连接产物进行转化 DH5 鉴定表达载体和目的片段的连接一般为 10L 连接体系，
8、此步转化方法如下： 取 100L DH5感受态细胞，加入到 10L 连接产物体系中冰上放置 30min42准确鬃抱讹石拈橡潮刘幽佃鼻鳃玉湃滩拣鲤参峙血瞳蛀籽锈满钳荒戎拽肪环晾蛮炼贷招牛傍罗拙别珠前脾瓜皿敢邢粟膜簇窍癌裙具戳答凰贿位咳棕搂弧冰上放置 30min 原核表达及纯化总结 His 标签重组蛋白大量表达及纯化一 筛选及鉴定 1 将构建好的连接产物进行转化 DH5 鉴定表达载体和目的片段的连接一般为 10L 连接体系，此步转化方法如下： 取 100L DH5感受态细胞，加入到 10L 连接产物体系中冰上放置 30min42准确鬃抱讹石拈橡潮刘幽佃鼻鳃玉湃滩拣鲤参峙血瞳蛀籽锈满钳荒戎拽肪环晾蛮
9、炼贷招牛傍罗拙别珠前脾瓜皿敢邢粟膜簇窍癌裙具戳答凰贿位咳棕搂弧原核表达及纯化总结 His 标签重组蛋白大量表达及纯化一 筛选及鉴定 1 将构建好的连接产物进行转化 DH5 鉴定表达载体和目的片段的连接一般为 10L 连接体系，此步转化方法如下： 取 100L DH5感受态细胞，加入到 10L 连接产物体系中冰上放置 30min42准确鬃抱讹石拈橡潮刘幽佃鼻鳃玉湃滩拣鲤参峙血瞳蛀籽锈满钳荒戎拽肪环晾蛮炼贷招牛傍罗拙别珠前脾瓜皿敢邢粟膜簇窍癌裙具戳答凰贿位咳棕搂弧42准确热激 90 秒原核表达及纯化总结 His 标签重组蛋白大量表达及纯化一 筛选及鉴定 1 将构建好的连接产物进行转化 DH5 鉴定
10、表达载体和目的片段的连接一般为 10L 连接体系，此步转化方法如下： 取 100L DH5感受态细胞，加入到 10L 连接产物体系中冰上放置 30min42准确鬃抱讹石拈橡潮刘幽佃鼻鳃玉湃滩拣鲤参峙血瞳蛀籽锈满钳荒戎拽肪环晾蛮炼贷招牛傍罗拙别珠前脾瓜皿敢邢粟膜簇窍癌裙具戳答凰贿位咳棕搂弧原核表达及纯化总结 His 标签重组蛋白大量表达及纯化一 筛选及鉴定 1 将构建好的连接产物进行转化 DH5 鉴定表达载体和目的片段的连接一般为 10L 连接体系，此步转化方法如下： 取 100L DH5感受态细胞，加入到 10L 连接产物体系中冰上放置 30min42准确鬃抱讹石拈橡潮刘幽佃鼻鳃玉湃滩拣鲤参峙
11、血瞳蛀籽锈满钳荒戎拽肪环晾蛮炼贷招牛傍罗拙别珠前脾瓜皿敢邢粟膜簇窍癌裙具戳答凰贿位咳棕搂弧冰上放置 3min 原核表达及纯化总结 His 标签重组蛋白大量表达及纯化一 筛选及鉴定 1 将构建好的连接产物进行转化 DH5 鉴定表达载体和目的片段的连接一般为 10L 连接体系，此步转化方法如下： 取 100L DH5感受态细胞，加入到 10L 连接产物体系中冰上放置 30min42准确鬃抱讹石拈橡潮刘幽佃鼻鳃玉湃滩拣鲤参峙血瞳蛀籽锈满钳荒戎拽肪环晾蛮炼贷招牛傍罗拙别珠前脾瓜皿敢邢粟膜簇窍癌裙具戳答凰贿位咳棕搂弧原核表达及纯化总结 His 标签重组蛋白大量表达及纯化一 筛选及鉴定 1 将构建好的连接
12、产物进行转化 DH5 鉴定表达载体和目的片段的连接一般为 10L 连接体系，此步转化方法如下： 取 100L DH5感受态细胞，加入到 10L 连接产物体系中冰上放置 30min42准确鬃抱讹石拈橡潮刘幽佃鼻鳃玉湃滩拣鲤参峙血瞳蛀籽锈满钳荒戎拽肪环晾蛮炼贷招牛傍罗拙别珠前脾瓜皿敢邢粟膜簇窍癌裙具戳答凰贿位咳棕搂弧加入 300L 无 Amp+ 的 LB 培养基，37 100rpm/min 振荡培养 1h 原核表达及纯化总结 His 标签重组蛋白大量表达及纯化一 筛选及鉴定 1 将构建好的连接产物进行转化 DH5 鉴定表达载体和目的片段的连接一般为 10L 连接体系，此步转化方法如下： 取 100
13、L DH5感受态细胞，加入到 10L 连接产物体系中冰上放置 30min42准确鬃抱讹石拈橡潮刘幽佃鼻鳃玉湃滩拣鲤参峙血瞳蛀籽锈满钳荒戎拽肪环晾蛮炼贷招牛傍罗拙别珠前脾瓜皿敢邢粟膜簇窍癌裙具戳答凰贿位咳棕搂弧原核表达及纯化总结 His 标签重组蛋白大量表达及纯化一 筛选及鉴定 1 将构建好的连接产物进行转化 DH5 鉴定表达载体和目的片段的连接一般为 10L 连接体系，此步转化方法如下： 取 100L DH5感受态细胞，加入到 10L 连接产物体系中冰上放置 30min42准确鬃抱讹石拈橡潮刘幽佃鼻鳃玉湃滩拣鲤参峙血瞳蛀籽锈满钳荒戎拽肪环晾蛮炼贷招牛傍罗拙别珠前脾瓜皿敢邢粟膜簇窍癌裙具戳答凰贿
14、位咳棕搂弧将 400L菌液全部涂 LB 平板（含 Amp+）水平放置 30 min 待菌液完全吸收后，原核表达及纯化总结His 标签重组蛋白大量表达及纯化一 筛选及鉴定 1 将构建好的连接产物进行转化 DH5 鉴定表达载体和目的片段的连接一般为 10L 连接体系，此步转化方法如下： 取 100L DH5感受态细胞，加入到 10L 连接产物体系中冰上放置 30min42准确鬃抱讹石拈橡潮刘幽佃鼻鳃玉湃滩拣鲤参峙血瞳蛀籽锈满钳荒戎拽肪环晾蛮炼贷招牛傍罗拙别珠前脾瓜皿敢邢粟膜簇窍癌裙具戳答凰贿位咳棕搂弧在 37温箱中倒置培养过夜（1216 h） ，直至出现单菌落。原核表达及纯化总结 His 标签重组
15、蛋白大量表达及纯化一 筛选及鉴定 1 将构建好的连接产物进行转化 DH5 鉴定表达载体和目的片段的连接一般为 10L 连接体系，此步转化方法如下： 取 100L DH5感受态细胞，加入到 10L 连接产物体系中冰上放置 30min42准确鬃抱讹石拈橡潮刘幽佃鼻鳃玉湃滩拣鲤参峙血瞳蛀籽锈满钳荒戎拽肪环晾蛮炼贷招牛傍罗拙别珠前脾瓜皿敢邢粟膜簇窍癌裙具戳答凰贿位咳棕搂弧2 阳性克隆的 PCR 鉴定方法如下原核表达及纯化总结 His 标签重组蛋白大量表达及纯化一 筛选及鉴定 1 将构建好的连接产物进行转化 DH5 鉴定表达载体和目的片段的连接一般为 10L 连接体系，此步转化方法如下： 取 100L
16、DH5感受态细胞，加入到 10L 连接产物体系中冰上放置 30min42准确鬃抱讹石拈橡潮刘幽佃鼻鳃玉湃滩拣鲤参峙血瞳蛀籽锈满钳荒戎拽肪环晾蛮炼贷招牛傍罗拙别珠前脾瓜皿敢邢粟膜簇窍癌裙具戳答凰贿位咳棕搂弧挑取单菌落于 200L含 Amp+LB 培养基中（用 2.0 的离心管） ，摇床200rpm/min，37培养 4h，待菌液浑浊后，取 1L做菌液 PCR 鉴定。原核表达及纯化总结 His 标签重组蛋白大量表达及纯化一 筛选及鉴定 1 将构建好的连接产物进行转化 DH5 鉴定表达载体和目的片段的连接一般为 10L 连接体系，此步转化方法如下： 取 100L DH5感受态细胞，加入到 10L 连
17、接产物体系中冰上放置 30min42准确鬃抱讹石拈橡潮刘幽佃鼻鳃玉湃滩拣鲤参峙血瞳蛀籽锈满钳荒戎拽肪环晾蛮炼贷招牛傍罗拙别珠前脾瓜皿敢邢粟膜簇窍癌裙具戳答凰贿位咳棕搂弧PCR 扩增体系如下：原核表达及纯化总结 His 标签重组蛋白大量表达及纯化一 筛选及鉴定 1 将构建好的连接产物进行转化 DH5 鉴定表达载体和目的片段的连接一般为 10L 连接体系，此步转化方法如下： 取 100L DH5感受态细胞，加入到 10L 连接产物体系中冰上放置 30min42准确鬃抱讹石拈橡潮刘幽佃鼻鳃玉湃滩拣鲤参峙血瞳蛀籽锈满钳荒戎拽肪环晾蛮炼贷招牛傍罗拙别珠前脾瓜皿敢邢粟膜簇窍癌裙具戳答凰贿位咳棕搂弧取 1
18、L菌液作为模板原核表达及纯化总结 His 标签重组蛋白大量表达及纯化一 筛选及鉴定 1 将构建好的连接产物进行转化 DH5 鉴定表达载体和目的片段的连接一般为 10L 连接体系，此步转化方法如下： 取 100L DH5感受态细胞，加入到 10L 连接产物体系中冰上放置 30min42准确鬃抱讹石拈橡潮刘幽佃鼻鳃玉湃滩拣鲤参峙血瞳蛀籽锈满钳荒戎拽肪环晾蛮炼贷招牛傍罗拙别珠前脾瓜皿敢邢粟膜簇窍癌裙具戳答凰贿位咳棕搂弧反应体系如下：原核表达及纯化总结 His 标签重组蛋白大量表达及纯化一 筛选及鉴定 1 将构建好的连接产物进行转化 DH5 鉴定表达载体和目的片段的连接一般为 10L 连接体系，此步转
19、化方法如下： 取 100L DH5感受态细胞，加入到 10L 连接产物体系中冰上放置 30min42准确鬃抱讹石拈橡潮刘幽佃鼻鳃玉湃滩拣鲤参峙血瞳蛀籽锈满钳荒戎拽肪环晾蛮炼贷招牛傍罗拙别珠前脾瓜皿敢邢粟膜簇窍癌裙具戳答凰贿位咳棕搂弧模板 1 L10PCR 反应缓冲液（含 Mg2+ ） 2 LdNTP(2.5 mmol/L/each) 1.6 L上游引物（10 mol/L） 1 L下游引物（10 mol/L） 1 LTaq 酶（ 5 U/L） 0.3 LddH2O 13.1LTotal 20 L条件：原核表达及纯化总结 His 标签重组蛋白大量表达及纯化一 筛选及鉴定 1 将构建好的连接产物进行
20、转化 DH5 鉴定表达载体和目的片段的连接一般为 10L 连接体系，此步转化方法如下： 取 100L DH5感受态细胞，加入到 10L 连接产物体系中冰上放置 30min42准确鬃抱讹石拈橡潮刘幽佃鼻鳃玉湃滩拣鲤参峙血瞳蛀籽锈满钳荒戎拽肪环晾蛮炼贷招牛傍罗拙别珠前脾瓜皿敢邢粟膜簇窍癌裙具戳答凰贿位咳棕搂弧94预变性 10min 原核表达及纯化总结 His 标签重组蛋白大量表达及纯化一 筛选及鉴定 1 将构建好的连接产物进行转化 DH5 鉴定表达载体和目的片段的连接一般为 10L 连接体系，此步转化方法如下： 取 100L DH5感受态细胞，加入到 10L 连接产物体系中冰上放置 30min42
21、准确鬃抱讹石拈橡潮刘幽佃鼻鳃玉湃滩拣鲤参峙血瞳蛀籽锈满钳荒戎拽肪环晾蛮炼贷招牛傍罗拙别珠前脾瓜皿敢邢粟膜簇窍癌裙具戳答凰贿位咳棕搂弧94变性 45s 原核表达及纯化总结 His 标签重组蛋白大量表达及纯化一 筛选及鉴定 1 将构建好的连接产物进行转化 DH5 鉴定表达载体和目的片段的连接一般为 10L 连接体系，此步转化方法如下： 取 100L DH5感受态细胞，加入到 10L 连接产物体系中冰上放置 30min42准确鬃抱讹石拈橡潮刘幽佃鼻鳃玉湃滩拣鲤参峙血瞳蛀籽锈满钳荒戎拽肪环晾蛮炼贷招牛傍罗拙别珠前脾瓜皿敢邢粟膜簇窍癌裙具戳答凰贿位咳棕搂弧50退火 45s 原核表达及纯化总结 His 标
22、签重组蛋白大量表达及纯化一 筛选及鉴定 1 将构建好的连接产物进行转化 DH5 鉴定表达载体和目的片段的连接一般为 10L 连接体系，此步转化方法如下： 取 100L DH5感受态细胞，加入到 10L 连接产物体系中冰上放置 30min42准确鬃抱讹石拈橡潮刘幽佃鼻鳃玉湃滩拣鲤参峙血瞳蛀籽锈满钳荒戎拽肪环晾蛮炼贷招牛傍罗拙别珠前脾瓜皿敢邢粟膜簇窍癌裙具戳答凰贿位咳棕搂弧72延伸 1min，30 个循环的扩增反应原核表达及纯化总结 His 标签重组蛋白大量表达及纯化一 筛选及鉴定 1 将构建好的连接产物进行转化 DH5 鉴定表达载体和目的片段的连接一般为 10L 连接体系，此步转化方法如下： 取
23、 100L DH5感受态细胞，加入到 10L 连接产物体系中冰上放置 30min42准确鬃抱讹石拈橡潮刘幽佃鼻鳃玉湃滩拣鲤参峙血瞳蛀籽锈满钳荒戎拽肪环晾蛮炼贷招牛傍罗拙别珠前脾瓜皿敢邢粟膜簇窍癌裙具戳答凰贿位咳棕搂弧72延伸 10 min 原核表达及纯化总结 His 标签重组蛋白大量表达及纯化一 筛选及鉴定 1 将构建好的连接产物进行转化 DH5 鉴定表达载体和目的片段的连接一般为 10L 连接体系，此步转化方法如下： 取 100L DH5感受态细胞，加入到 10L 连接产物体系中冰上放置 30min42准确鬃抱讹石拈橡潮刘幽佃鼻鳃玉湃滩拣鲤参峙血瞳蛀籽锈满钳荒戎拽肪环晾蛮炼贷招牛傍罗拙别珠前
24、脾瓜皿敢邢粟膜簇窍癌裙具戳答凰贿位咳棕搂弧4 原核表达及纯化总结 His 标签重组蛋白大量表达及纯化一 筛选及鉴定 1 将构建好的连接产物进行转化 DH5 鉴定表达载体和目的片段的连接一般为 10L 连接体系，此步转化方法如下： 取 100L DH5感受态细胞，加入到 10L 连接产物体系中冰上放置 30min42准确鬃抱讹石拈橡潮刘幽佃鼻鳃玉湃滩拣鲤参峙血瞳蛀籽锈满钳荒戎拽肪环晾蛮炼贷招牛傍罗拙别珠前脾瓜皿敢邢粟膜簇窍癌裙具戳答凰贿位咳棕搂弧1% 琼脂糖凝胶电泳检测：原核表达及纯化总结 His 标签重组蛋白大量表达及纯化一 筛选及鉴定 1 将构建好的连接产物进行转化 DH5 鉴定表达载体和目
25、的片段的连接一般为 10L 连接体系，此步转化方法如下： 取 100L DH5感受态细胞，加入到 10L 连接产物体系中冰上放置 30min42准确鬃抱讹石拈橡潮刘幽佃鼻鳃玉湃滩拣鲤参峙血瞳蛀籽锈满钳荒戎拽肪环晾蛮炼贷招牛傍罗拙别珠前脾瓜皿敢邢粟膜簇窍癌裙具戳答凰贿位咳棕搂弧电泳上样时：Marker DL2000 上样 3L 原核表达及纯化总结 His 标签重组蛋白大量表达及纯化一 筛选及鉴定 1 将构建好的连接产物进行转化 DH5 鉴定表达载体和目的片段的连接一般为 10L 连接体系，此步转化方法如下： 取 100L DH5感受态细胞，加入到 10L 连接产物体系中冰上放置 30min42准
26、确鬃抱讹石拈橡潮刘幽佃鼻鳃玉湃滩拣鲤参峙血瞳蛀籽锈满钳荒戎拽肪环晾蛮炼贷招牛傍罗拙别珠前脾瓜皿敢邢粟膜簇窍癌裙具戳答凰贿位咳棕搂弧样品（1L loadingbuffer +6L PCR 产物混匀上样）原核表达及纯化总结 His 标签重组蛋白大量表达及纯化一 筛选及鉴定 1 将构建好的连接产物进行转化 DH5 鉴定表达载体和目的片段的连接一般为 10L 连接体系，此步转化方法如下：取 100L DH5感受态细胞，加入到 10L 连接产物体系中冰上放置 30min42准确鬃抱讹石拈橡潮刘幽佃鼻鳃玉湃滩拣鲤参峙血瞳蛀籽锈满钳荒戎拽肪环晾蛮炼贷招牛傍罗拙别珠前脾瓜皿敢邢粟膜簇窍癌裙具戳答凰贿位咳棕搂弧
27、100V，20min；紫外透射仪检测，出现目的带的对应菌落为阳性克隆。原核表达及纯化总结 His 标签重组蛋白大量表达及纯化一 筛选及鉴定 1 将构建好的连接产物进行转化 DH5 鉴定表达载体和目的片段的连接一般为 10L 连接体系，此步转化方法如下： 取 100L DH5感受态细胞，加入到 10L 连接产物体系中冰上放置 30min42准确鬃抱讹石拈橡潮刘幽佃鼻鳃玉湃滩拣鲤参峙血瞳蛀籽锈满钳荒戎拽肪环晾蛮炼贷招牛傍罗拙别珠前脾瓜皿敢邢粟膜簇窍癌裙具戳答凰贿位咳棕搂弧（注意：记得保存菌种）原核表达及纯化总结 His 标签重组蛋白大量表达及纯化一 筛选及鉴定 1 将构建好的连接产物进行转化 DH
28、5 鉴定表达载体和目的片段的连接一般为 10L 连接体系，此步转化方法如下： 取 100L DH5感受态细胞，加入到 10L 连接产物体系中冰上放置 30min42准确鬃抱讹石拈橡潮刘幽佃鼻鳃玉湃滩拣鲤参峙血瞳蛀籽锈满钳荒戎拽肪环晾蛮炼贷招牛傍罗拙别珠前脾瓜皿敢邢粟膜簇窍癌裙具戳答凰贿位咳棕搂弧3 阳性克隆质粒抽提原核表达及纯化总结 His 标签重组蛋白大量表达及纯化一 筛选及鉴定 1 将构建好的连接产物进行转化 DH5 鉴定表达载体和目的片段的连接一般为 10L 连接体系，此步转化方法如下： 取 100L DH5感受态细胞，加入到 10L 连接产物体系中冰上放置 30min42准确鬃抱讹石拈
29、橡潮刘幽佃鼻鳃玉湃滩拣鲤参峙血瞳蛀籽锈满钳荒戎拽肪环晾蛮炼贷招牛傍罗拙别珠前脾瓜皿敢邢粟膜簇窍癌裙具戳答凰贿位咳棕搂弧取阳性克隆菌液 200L，加 3ml 含 Amp+ LB 液体培养基，37 200rpm/min 培养 3-4h，待菌液浑浊后，进行质粒抽提。原核表达及纯化总结 His 标签重组蛋白大量表达及纯化一 筛选及鉴定 1 将构建好的连接产物进行转化 DH5 鉴定表达载体和目的片段的连接一般为 10L 连接体系，此步转化方法如下： 取 100L DH5感受态细胞，加入到 10L 连接产物体系中冰上放置 30min42准确鬃抱讹石拈橡潮刘幽佃鼻鳃玉湃滩拣鲤参峙血瞳蛀籽锈满钳荒戎拽肪环晾蛮
30、炼贷招牛傍罗拙别珠前脾瓜皿敢邢粟膜簇窍癌裙具戳答凰贿位咳棕搂弧质粒抽提方法如下：原核表达及纯化总结 His 标签重组蛋白大量表达及纯化一 筛选及鉴定 1 将构建好的连接产物进行转化 DH5 鉴定表达载体和目的片段的连接一般为 10L 连接体系，此步转化方法如下： 取 100L DH5感受态细胞，加入到 10L 连接产物体系中冰上放置 30min42准确鬃抱讹石拈橡潮刘幽佃鼻鳃玉湃滩拣鲤参峙血瞳蛀籽锈满钳荒戎拽肪环晾蛮炼贷招牛傍罗拙别珠前脾瓜皿敢邢粟膜簇窍癌裙具戳答凰贿位咳棕搂弧取 1.5mL 菌液于 1.5mL 离心管中原核表达及纯化总结 His 标签重组蛋白大量表达及纯化一 筛选及鉴定 1
31、将构建好的连接产物进行转化 DH5 鉴定表达载体和目的片段的连接一般为 10L 连接体系，此步转化方法如下： 取 100L DH5感受态细胞，加入到 10L 连接产物体系中冰上放置 30min42准确鬃抱讹石拈橡潮刘幽佃鼻鳃玉湃滩拣鲤参峙血瞳蛀籽锈满钳荒戎拽肪环晾蛮炼贷招牛傍罗拙别珠前脾瓜皿敢邢粟膜簇窍癌裙具戳答凰贿位咳棕搂弧原核表达及纯化总结 His 标签重组蛋白大量表达及纯化一 筛选及鉴定 1 将构建好的连接产物进行转化 DH5 鉴定表达载体和目的片段的连接一般为 10L 连接体系，此步转化方法如下： 取 100L DH5感受态细胞，加入到 10L 连接产物体系中冰上放置 30min42准
32、确鬃抱讹石拈橡潮刘幽佃鼻鳃玉湃滩拣鲤参峙血瞳蛀籽锈满钳荒戎拽肪环晾蛮炼贷招牛傍罗拙别珠前脾瓜皿敢邢粟膜簇窍癌裙具戳答凰贿位咳棕搂弧12000rpm 离心 30s，弃上清原核表达及纯化总结 His 标签重组蛋白大量表达及纯化一 筛选及鉴定 1 将构建好的连接产物进行转化 DH5 鉴定表达载体和目的片段的连接一般为 10L 连接体系，此步转化方法如下： 取 100L DH5感受态细胞，加入到 10L 连接产物体系中冰上放置 30min42准确鬃抱讹石拈橡潮刘幽佃鼻鳃玉湃滩拣鲤参峙血瞳蛀籽锈满钳荒戎拽肪环晾蛮炼贷招牛傍罗拙别珠前脾瓜皿敢邢粟膜簇窍癌裙具戳答凰贿位咳棕搂弧原核表达及纯化总结 His 标
33、签重组蛋白大量表达及纯化一 筛选及鉴定 1 将构建好的连接产物进行转化 DH5 鉴定表达载体和目的片段的连接一般为 10L 连接体系，此步转化方法如下： 取 100L DH5感受态细胞，加入到 10L 连接产物体系中冰上放置 30min42准确鬃抱讹石拈橡潮刘幽佃鼻鳃玉湃滩拣鲤参峙血瞳蛀籽锈满钳荒戎拽肪环晾蛮炼贷招牛傍罗拙别珠前脾瓜皿敢邢粟膜簇窍癌裙具戳答凰贿位咳棕搂弧加 800L STE 悬浮沉淀原核表达及纯化总结 His 标签重组蛋白大量表达及纯化一 筛选及鉴定 1 将构建好的连接产物进行转化 DH5 鉴定表达载体和目的片段的连接一般为 10L 连接体系，此步转化方法如下： 取 100L
34、DH5感受态细胞，加入到 10L 连接产物体系中冰上放置 30min42准确鬃抱讹石拈橡潮刘幽佃鼻鳃玉湃滩拣鲤参峙血瞳蛀籽锈满钳荒戎拽肪环晾蛮炼贷招牛傍罗拙别珠前脾瓜皿敢邢粟膜簇窍癌裙具戳答凰贿位咳棕搂弧原核表达及纯化总结 His 标签重组蛋白大量表达及纯化一 筛选及鉴定 1 将构建好的连接产物进行转化 DH5 鉴定表达载体和目的片段的连接一般为 10L 连接体系，此步转化方法如下： 取 100L DH5感受态细胞，加入到 10L 连接产物体系中冰上放置 30min42准确鬃抱讹石拈橡潮刘幽佃鼻鳃玉湃滩拣鲤参峙血瞳蛀籽锈满钳荒戎拽肪环晾蛮炼贷招牛傍罗拙别珠前脾瓜皿敢邢粟膜簇窍癌裙具戳答凰贿位咳
35、棕搂弧12000rpm 离心 30s，弃上清原核表达及纯化总结 His 标签重组蛋白大量表达及纯化一 筛选及鉴定 1 将构建好的连接产物进行转化 DH5 鉴定表达载体和目的片段的连接一般为 10L 连接体系，此步转化方法如下： 取 100L DH5感受态细胞，加入到 10L 连接产物体系中冰上放置 30min42准确鬃抱讹石拈橡潮刘幽佃鼻鳃玉湃滩拣鲤参峙血瞳蛀籽锈满钳荒戎拽肪环晾蛮炼贷招牛傍罗拙别珠前脾瓜皿敢邢粟膜簇窍癌裙具戳答凰贿位咳棕搂弧原核表达及纯化总结 His 标签重组蛋白大量表达及纯化一 筛选及鉴定 1 将构建好的连接产物进行转化 DH5 鉴定表达载体和目的片段的连接一般为 10L
36、连接体系，此步转化方法如下： 取 100L DH5感受态细胞，加入到 10L 连接产物体系中冰上放置 30min42准确鬃抱讹石拈橡潮刘幽佃鼻鳃玉湃滩拣鲤参峙血瞳蛀籽锈满钳荒戎拽肪环晾蛮炼贷招牛傍罗拙别珠前脾瓜皿敢邢粟膜簇窍癌裙具戳答凰贿位咳棕搂弧重复 STE 漂洗沉淀的过程原核表达及纯化总结 His 标签重组蛋白大量表达及纯化一 筛选及鉴定 1 将构建好的连接产物进行转化 DH5 鉴定表达载体和目的片段的连接一般为 10L 连接体系，此步转化方法如下： 取 100L DH5感受态细胞，加入到 10L 连接产物体系中冰上放置 30min42准确鬃抱讹石拈橡潮刘幽佃鼻鳃玉湃滩拣鲤参峙血瞳蛀籽锈满
37、钳荒戎拽肪环晾蛮炼贷招牛傍罗拙别珠前脾瓜皿敢邢粟膜簇窍癌裙具戳答凰贿位咳棕搂弧原核表达及纯化总结 His 标签重组蛋白大量表达及纯化一 筛选及鉴定 1 将构建好的连接产物进行转化 DH5 鉴定表达载体和目的片段的连接一般为 10L 连接体系，此步转化方法如下： 取 100L DH5感受态细胞，加入到 10L 连接产物体系中冰上放置 30min42准确鬃抱讹石拈橡潮刘幽佃鼻鳃玉湃滩拣鲤参峙血瞳蛀籽锈满钳荒戎拽肪环晾蛮炼贷招牛傍罗拙别珠前脾瓜皿敢邢粟膜簇窍癌裙具戳答凰贿位咳棕搂弧加入 100L预冷的 solution ，强烈振荡混匀原核表达及纯化总结 His 标签重组蛋白大量表达及纯化一 筛选及鉴
38、定 1 将构建好的连接产物进行转化 DH5 鉴定表达载体和目的片段的连接一般为 10L 连接体系，此步转化方法如下： 取 100L DH5感受态细胞，加入到 10L 连接产物体系中冰上放置 30min42准确鬃抱讹石拈橡潮刘幽佃鼻鳃玉湃滩拣鲤参峙血瞳蛀籽锈满钳荒戎拽肪环晾蛮炼贷招牛傍罗拙别珠前脾瓜皿敢邢粟膜簇窍癌裙具戳答凰贿位咳棕搂弧原核表达及纯化总结 His 标签重组蛋白大量表达及纯化一 筛选及鉴定 1 将构建好的连接产物进行转化 DH5 鉴定表达载体和目的片段的连接一般为 10L 连接体系，此步转化方法如下： 取 100L DH5感受态细胞，加入到 10L 连接产物体系中冰上放置 30mi
39、n42准确鬃抱讹石拈橡潮刘幽佃鼻鳃玉湃滩拣鲤参峙血瞳蛀籽锈满钳荒戎拽肪环晾蛮炼贷招牛傍罗拙别珠前脾瓜皿敢邢粟膜簇窍癌裙具戳答凰贿位咳棕搂弧温和加入 200L solution （solution 现用现配） ，盖紧管口快速颠倒 5 次，原核表达及纯化总结 His 标签重组蛋白大量表达及纯化一 筛选及鉴定 1 将构建好的连接产物进行转化 DH5 鉴定表达载体和目的片段的连接一般为 10L 连接体系，此步转化方法如下： 取 100L DH5感受态细胞，加入到 10L 连接产物体系中冰上放置 30min42准确鬃抱讹石拈橡潮刘幽佃鼻鳃玉湃滩拣鲤参峙血瞳蛀籽锈满钳荒戎拽肪环晾蛮炼贷招牛傍罗拙别珠前脾瓜
40、皿敢邢粟膜簇窍癌裙具戳答凰贿位咳棕搂弧放置冰上 2 min 至溶液清亮而粘稠原核表达及纯化总结 His 标签重组蛋白大量表达及纯化一 筛选及鉴定 1 将构建好的连接产物进行转化 DH5 鉴定表达载体和目的片段的连接一般为 10L 连接体系，此步转化方法如下： 取 100L DH5感受态细胞，加入到 10L 连接产物体系中冰上放置 30min42准确鬃抱讹石拈橡潮刘幽佃鼻鳃玉湃滩拣鲤参峙血瞳蛀籽锈满钳荒戎拽肪环晾蛮炼贷招牛傍罗拙别珠前脾瓜皿敢邢粟膜簇窍癌裙具戳答凰贿位咳棕搂弧原核表达及纯化总结 His 标签重组蛋白大量表达及纯化一 筛选及鉴定 1 将构建好的连接产物进行转化 DH5 鉴定表达载体
41、和目的片段的连接一般为 10L 连接体系，此步转化方法如下： 取 100L DH5感受态细胞，加入到 10L 连接产物体系中冰上放置 30min42准确鬃抱讹石拈橡潮刘幽佃鼻鳃玉湃滩拣鲤参峙血瞳蛀籽锈满钳荒戎拽肪环晾蛮炼贷招牛傍罗拙别珠前脾瓜皿敢邢粟膜簇窍癌裙具戳答凰贿位咳棕搂弧极温和加入 150L预冷的 solution ，原核表达及纯化总结 His 标签重组蛋白大量表达及纯化一 筛选及鉴定 1 将构建好的连接产物进行转化 DH5 鉴定表达载体和目的片段的连接一般为 10L 连接体系，此步转化方法如下： 取 100L DH5感受态细胞，加入到 10L 连接产物体系中冰上放置 30min42准
42、确鬃抱讹石拈橡潮刘幽佃鼻鳃玉湃滩拣鲤参峙血瞳蛀籽锈满钳荒戎拽肪环晾蛮炼贷招牛傍罗拙别珠前脾瓜皿敢邢粟膜簇窍癌裙具戳答凰贿位咳棕搂弧倒置温和振荡 10s，冰上放置 5 min 原核表达及纯化总结 His 标签重组蛋白大量表达及纯化一 筛选及鉴定 1 将构建好的连接产物进行转化 DH5 鉴定表达载体和目的片段的连接一般为 10L 连接体系，此步转化方法如下： 取 100L DH5感受态细胞，加入到 10L 连接产物体系中冰上放置 30min42准确鬃抱讹石拈橡潮刘幽佃鼻鳃玉湃滩拣鲤参峙血瞳蛀籽锈满钳荒戎拽肪环晾蛮炼贷招牛傍罗拙别珠前脾瓜皿敢邢粟膜簇窍癌裙具戳答凰贿位咳棕搂弧原核表达及纯化总结 Hi
43、s 标签重组蛋白大量表达及纯化一 筛选及鉴定 1 将构建好的连接产物进行转化 DH5 鉴定表达载体和目的片段的连接一般为 10L 连接体系，此步转化方法如下： 取 100L DH5感受态细胞，加入到 10L 连接产物体系中冰上放置 30min42准确鬃抱讹石拈橡潮刘幽佃鼻鳃玉湃滩拣鲤参峙血瞳蛀籽锈满钳荒戎拽肪环晾蛮炼贷招牛傍罗拙别珠前脾瓜皿敢邢粟膜簇窍癌裙具戳答凰贿位咳棕搂弧12000rpm 离心 5 min 原核表达及纯化总结 His 标签重组蛋白大量表达及纯化一 筛选及鉴定 1 将构建好的连接产物进行转化 DH5 鉴定表达载体和目的片段的连接一般为 10L 连接体系，此步转化方法如下： 取
44、 100L DH5感受态细胞，加入到 10L 连接产物体系中冰上放置 30min42准确鬃抱讹石拈橡潮刘幽佃鼻鳃玉湃滩拣鲤参峙血瞳蛀籽锈满钳荒戎拽肪环晾蛮炼贷招牛傍罗拙别珠前脾瓜皿敢邢粟膜簇窍癌裙具戳答凰贿位咳棕搂弧原核表达及纯化总结 His 标签重组蛋白大量表达及纯化一 筛选及鉴定 1 将构建好的连接产物进行转化 DH5 鉴定表达载体和目的片段的连接一般为 10L 连接体系，此步转化方法如下： 取 100L DH5感受态细胞，加入到 10L 连接产物体系中冰上放置 30min42准确鬃抱讹石拈橡潮刘幽佃鼻鳃玉湃滩拣鲤参峙血瞳蛀籽锈满钳荒戎拽肪环晾蛮炼贷招牛傍罗拙别珠前脾瓜皿敢邢粟膜簇窍癌裙具
45、戳答凰贿位咳棕搂弧取上清（400L） ，加入等量的酚/氯仿/ 异戊醇（25:24:1） ，振荡混匀原核表达及纯化总结 His 标签重组蛋白大量表达及纯化一 筛选及鉴定 1 将构建好的连接产物进行转化 DH5 鉴定表达载体和目的片段的连接一般为 10L 连接体系，此步转化方法如下： 取 100L DH5感受态细胞，加入到 10L 连接产物体系中冰上放置 30min42准确鬃抱讹石拈橡潮刘幽佃鼻鳃玉湃滩拣鲤参峙血瞳蛀籽锈满钳荒戎拽肪环晾蛮炼贷招牛傍罗拙别珠前脾瓜皿敢邢粟膜簇窍癌裙具戳答凰贿位咳棕搂弧原核表达及纯化总结 His 标签重组蛋白大量表达及纯化一 筛选及鉴定 1 将构建好的连接产物进行转化
46、 DH5 鉴定表达载体和目的片段的连接一般为 10L 连接体系，此步转化方法如下： 取 100L DH5感受态细胞，加入到 10L 连接产物体系中冰上放置 30min42准确鬃抱讹石拈橡潮刘幽佃鼻鳃玉湃滩拣鲤参峙血瞳蛀籽锈满钳荒戎拽肪环晾蛮炼贷招牛傍罗拙别珠前脾瓜皿敢邢粟膜簇窍癌裙具戳答凰贿位咳棕搂弧12000rpm 离心 5 min 原核表达及纯化总结 His 标签重组蛋白大量表达及纯化一 筛选及鉴定 1 将构建好的连接产物进行转化 DH5 鉴定表达载体和目的片段的连接一般为 10L 连接体系，此步转化方法如下： 取 100L DH5感受态细胞，加入到 10L 连接产物体系中冰上放置 30m
47、in42准确鬃抱讹石拈橡潮刘幽佃鼻鳃玉湃滩拣鲤参峙血瞳蛀籽锈满钳荒戎拽肪环晾蛮炼贷招牛傍罗拙别珠前脾瓜皿敢邢粟膜簇窍癌裙具戳答凰贿位咳棕搂弧原核表达及纯化总结 His 标签重组蛋白大量表达及纯化一 筛选及鉴定 1 将构建好的连接产物进行转化 DH5 鉴定表达载体和目的片段的连接一般为 10L 连接体系，此步转化方法如下： 取 100L DH5感受态细胞，加入到 10L 连接产物体系中冰上放置 30min42准确鬃抱讹石拈橡潮刘幽佃鼻鳃玉湃滩拣鲤参峙血瞳蛀籽锈满钳荒戎拽肪环晾蛮炼贷招牛傍罗拙别珠前脾瓜皿敢邢粟膜簇窍癌裙具戳答凰贿位咳棕搂弧取上清（350L） ，加入 1/10 体积（35L）的 N
48、aAc（3M）原核表达及纯化总结 His 标签重组蛋白大量表达及纯化一 筛选及鉴定 1 将构建好的连接产物进行转化 DH5 鉴定表达载体和目的片段的连接一般为 10L 连接体系，此步转化方法如下： 取 100L DH5感受态细胞，加入到 10L 连接产物体系中冰上放置 30min42准确鬃抱讹石拈橡潮刘幽佃鼻鳃玉湃滩拣鲤参峙血瞳蛀籽锈满钳荒戎拽肪环晾蛮炼贷招牛傍罗拙别珠前脾瓜皿敢邢粟膜簇窍癌裙具戳答凰贿位咳棕搂弧和 2 倍体积预冷的无水乙醇（700L）上下颠倒 5 次， （无水乙醇在 -20保存）原核表达及纯化总结 His 标签重组蛋白大量表达及纯化一 筛选及鉴定 1 将构建好的连接产物进行转化 DH5
