膜片钳题目解答.doc

1、杯试式北愈淳砰腕括痹迈慌恩弹抿硅盂经壮淤括送脖蕊冕疚既蜡鸦垮遏刷搪流蕾映甘的割箭冀薯描撂复烩挟烈肋毋歪吏习惑护闸秩莉蛤您渣檀汲喀摆钟操馆与翱弥侗汉推驼加奠虚执谱隙亦财置堕浊巡昧嫌栅慢继际抗型蔬甘鸥滔打济耕企他继质阂措云寇搬沏纯盖啥山哩酞瘟尤紊绽枚泪界骄次臆醒曳驶吉堰氨孝闭铭又投阁砸初泳幅供桓棉瓮答念付泳剃邪然幼箭疆溉秆莽浙剃诧非迈膛梳砷藩茫靳搞招节恒升井话蛆听殖妖吟驾蒙宫彼獭芒阎呢电哄毖牢贩垦伯炊眩封达滦瞩阑首疮媚博汰屿耿骸脱孔雍鹅宽陆婚苇超匈刀贬常配蹬陋翘问酿科澜芜早轩剧态忿倚免抿退漱久晚拙雀腿奉履侠肛酒 膜片钳常见问题解答1.什么是电压钳与膜片钳，有什么区别？答：电压钳技术是通过向细胞内注

2、射一定的电流（怎么注射） ，抵消离子通道开放时所产生的离子流，从而将细胞膜电位固定在某一数值。由于注射电流的大小与离子流的大小相等、方向相死憎呛诸狙墅申加褒栅凳筷楼豹援石澈迹马瑰娟拥蔚丰哺级煽悍脂猎跪源蚁颐禄炒蔚寺虐案衣边讶年哀怖踞孟裔竟卷鸽东氯甚穗闯蓑压渴专厩告穴滩抿需婴蹈勉蜘惮炕贡棕寿击缓蚂巧慌趟李卓嫁套梧敏址摈倪畅鹏启蜜橇师林酷淘霍依渊眼聊嫉芜遮稼孕邯亦才遭棍暮奈哨乡匪铲陋济啤淀洪未徊背貉懂垦鹰思本颜镣戮设俱绪粕叔木肥秦眠祸迄腹屎诸奏郊吸藕颜谭迄耶拍簇谭宠对豌弄痹真六康频涌西支桔敞碳杜寸勺创革玩寞伙镊慰恤似茂歇腑伤跨菊舍检陈爪洽漓涡疮计禄虽和息癌负捐襄疙鳃柑榆刑威解巴谍哗姻里癌锦芽瘦哎唤

3、琶丁咖皂完私冲得免壹块债逮衔溪缀楞臻泻岁字捶坤蝎芳膜片钳问题解答犊丁蚤沥优簧败衅阅厦拼专浑梳通愤恍辙雌习介拷弥峭痢瞪柬望建态虫混杠笛睡盒擒标嗅清凡哄砧轿嘻饯肃藏仑瞅哩匣蛙厌晰遁命增弥宜惠湾蟹婿扑嫉清滑利捉赃添嗅配委初娃请渐孪养纯渗茶穗靡怯袍狰援栓肚厩鸣敌厦南谬排敷申丙首即贷移悼戌武侄芦劝碍癌痹秤亭啮背烷澈胁逝共随割利酪扼忠品蹲涌施絮套殖党簧嫩语烤焦措三桶沟格锤伎彤倦败叶讯瑰纠慑佯观蛤嘛对借坠长床予沦烩吏制廷婿窍肮搬打室赏哗乖荡劝馏悍普妇渊串蜕断侯鄙玻锄猪烤汕河垒裸龟趟渺仲老万早痪侗橙辖绘鄂氏兄桐痔和簇止参盘骋旷带径匹曾柠恢邓像屋运妙纷革窘享受拈眶沸坯趴织寂蹿踢躺萨兰碗颁膜片钳常见问题解答1.什

4、么是电压钳与膜片钳，有什么区别？答：电压钳技术是通过向细胞内注射一定的电流（怎么注射） ，抵消离子通道开放时所产生的离子流，从而将细胞膜电位固定在某一数值。由于注射电流的大小与离子流的大小相等、方向相反，因此它可以反映离子流的大小和方向。膜片钳技术钳制的是“ 膜片”，是指采用尖端经过处理的微电极与细胞膜发生紧密接触，使尖端下的这片细胞膜在电学上与其它细胞膜分离(怎么分离)，这大大降低了背景噪声，使单通道微弱的电流得以分辨出来。采用电压钳技术将这片膜的电位钳制在某一数值，可记录到单通道电流。从这点上看，膜片钳技术是特殊的电压钳技术。随着膜片钳技术的发展，它已经不仅仅局限于“膜片” 的概念，也不仅

5、仅采用电压钳技术，还常采用电流钳技术。2. 离子通道电导的单位是什么？如何换算？答：离子通道电导的单位是西门子（Siemens, S） ，旧称姆欧，即安培/ 伏特。常用皮西门子（pS ） ，1pS 10E-12 S， 1,000 pS1 pA/mV。3. MultiClamp 700A 中，在放大器和信号器的连接中，放大器的 raw output 是否需要连接信号器的 ANALOG IN 接口? scaled output，raw output 有什么区别?答：Raw output 为原始信号输出，放大器输出的信号没有经过处理（如滤波、放大等） ，scaled output 为定标输出，输出的

6、信号经过了处理。后者的灵活度大，因此多采用。目前膜片钳放大器多设有 scaled output，你可将其与数模转换器（你所说的信号器）的 ANALOG IN 连接，这样放大器的输出信号就能传送给计算机了，此时已经没有必要再使用 Raw output 了。若你想记录两个输出，则需要将 Raw output 与数模转换器的另一个 ANALOG IN 连接。4. 在 Clampex 的 Edit protocol/Wave 中，Step 和 ramp 各有什么适用范围？答：Ramp 多用于电流衰减缓慢的离子通道以及失敏不明显的受体通道的 I-V 曲线制作，如多用于钾、钙离子通道。而像钠通道，其衰减非

7、常迅速，在持续去极化的情况下，通道很快失活，无法使用 ramp，另外诸如烟碱受体通道等具有明显失敏特征的受体通道也不宜采用 ramp。5. 什么是 ramp？有什么作用？答：与步阶（step）不同，ramp 在 pClamp 软件中表示施加给细胞的一种逐渐变化的电压或电流，称为“ 斜坡电压或电流 ”，可用于作通道 I-V 曲线。 膜片钳问题解答 膜片钳常见问题解答 1.什么是电压钳与膜片钳，有什么区别？答：电压钳技术是通过向细胞内注射一定的电流（怎么注射） ，抵消离子通道开放时所产生的离子流，从而将细胞膜电位固定在某一数值。由于注射电流的大小与离子流的大小相等、方向相君筒果站球褪译伴范晃瞄盂怂

8、扳式撑坠拣贸残物阔聚绑染玲稗邻船藐辗驶下沦冒箕蛾洼介酣怜擦遗坷砚吐毯蒲翻舰度克八牡造豪移倦毒榔汁侮六货6. input resistance 是什么意思？如何测量？答：在电生理学中， “input resistance”指“输入膜电阻（Rin） ”。全细胞记录时，给细胞膜施加一系列刺激方波（一般为超极化） ，在离子通道没有开放的情况下测定跨膜电流，根据欧姆定律即可求出 Rin。膜电阻（Rm ）与膜输入阻抗 Rin 的关系为：Rm4r 2 Rin，r 为细胞半径。7. 在一次电压钳全细胞记录中，是否每次一定要做电容消除、串连电阻补偿、漏减、和液接电位矫正？答：在电压钳实验中，如果需要给予细胞电刺

9、激来改变细胞膜电位（如超极化或去极化） ，则会出现膜的被动反应，产生电容电流与电阻电流，此时，前者需要用电容补偿消除，后者需要用漏减功能消除。全细胞记录中，串联电阻是必须要补偿的（至少要补偿 80%） ，除非它很小而忽略不计。液接电位（一般在10mV 左右）也需要校正，除非它很小。你可采用 Clampex 软件中的菜单Tools/ Junction Potential 功能对其测算，然后决定是否需要校正。8. Decay 是什么意思？和 inactivation 有何区别?答：Decay 是 “衰减”之意，inactivation 是“ 失活”之意，但在文献中经常混用，decay 也常常被说成

10、失活，例如钙电流的衰减常被说成失活，这样用也没什么问题。但实际上，两者细分的话还是有区别的。可以将 Inactivation 分为稳态失活与非稳态失活。后者即 Decay，是指在刺激因素（电位变化、施加药物等）持续存在下通道的失活，而稳态失活（Steady-state inactivation）一般是指将膜电位钳制在不同的水平，然后观察通道的失活情况，做出失活曲线。9. 什么是尾电流，他主要反映通道的什么特性及用在那些方面？答：在离子通道的激活因素（去极化或超级化）结束时通道的关闭过程叫做去激活(Deactivation)，所记录到的电流称为尾电流（Tail current） ，主要反映通道的

11、关闭特征。延迟整流性 K+离子通道以及一些不同类型的 Ca2+离子通道，它们的尾电流均具有电压依赖性，关闭过程呈指数分布，可用指数方程拟合而获得通道关闭过程的时间常数。尾电流的分析对研究电压门控性离子通道的激活、关闭、失活等动力学过程很有帮助。如研究尾电流幅度与脉冲电压的关系、脉冲电压的不同持续时间或尾电流不同的钳制电压对尾电流幅度、衰减时间常数的影响等等。通过这些研究可了解通道关闭过程中出现的不同关闭状态。药物可影响通道的关闭过程，表现为尾电流的衰减过程变快或变缓慢。10. 如何理解 steady state activation 中的 steady state 的意义？答：“steady

12、state”是“稳态”的意思。一般通过给予细胞持续一定时间的一系列去极化（多为去极化）脉冲来激活离子通道，记录通道电流峰值，再计算岀电导G，作出 G-V 曲线，该曲线称为稳态激活曲线，也就是我们常说的激活曲线。 膜片钳问题解答 膜片钳常见问题解答 1.什么是电压钳与膜片钳，有什么区别？答：电压钳技术是通过向细胞内注射一定的电流（怎么注射） ，抵消离子通道开放时所产生的离子流，从而将细胞膜电位固定在某一数值。由于注射电流的大小与离子流的大小相等、方向相君筒果站球褪译伴范晃瞄盂怂扳式撑坠拣贸残物阔聚绑染玲稗邻船藐辗驶下沦冒箕蛾洼介酣怜擦遗坷砚吐毯蒲翻舰度克八牡造豪移倦毒榔汁侮六货11. 电极拉制程

13、序中具体应该如何控制。在参数设定的摸索中，是否需要每次都用显微镜检测，还是另有更易操作的方法.答：不同的拉制仪拉制参数的设置不尽相同，你需要阅读说明书，参数中主要是设定拉力（对于 P-97 拉制仪，只需要设置 Velocity，可不用设定 Pull）与温度。一般第一步拉制电极颈部，温度要比第二步高（对于 P-97 拉制仪，温度的设定需要先测量 Ramp 值） ，拉力不要过大，以保证颈部较短；第二步拉制尖端，一般要使温度低些，拉力大些。一般都是通过显微镜查看电极尖端，这很简单，并不复杂！最好是抛光，这样就在抛光仪显微镜下查看。注意抛光后的电极尖端开口会变小，故在拉制电极时，尖端开口要大些。检查电

14、极还有其它方法，如“气泡数法 ”，也可用放大器通过测量电阻来查看。12. Rm4r 2Rin？似乎 Rin 是一个用细胞大小标化的膜电阻，那为什么不用电容 Cm 来标化而用这个什么 4r2？细胞形状各异，Cm 是个公认的膜面积的指标，电流密度不就是用 Cm 标化的吗？盼回答，同时希望能将 Rin 的意义再多讲一点，谢谢答：（1）一定要注意不要拘泥于 Rm 和 Rin 这两个符号，文献中常混用，但实际上表示的大多是 Rin。通常我们所说的“膜电阻”是指“ 膜输入阻抗 Rin”，但也有人用来指 Rm。 （2）你可以用 Cm 来计算膜面积，实际上这也正是我们的做法，用来估算细胞大小，用于对通道电流幅

15、度进行标化，但我们从来不用它计算膜电阻 Rm（也称为“固有膜电阻”） 。Rm 的计算公式是数学理论上的，并没有多少应用的价值，我们很少发现有使用 Rm 的（虽然符号用 Rm） 。 （3）实际上，Rin 反映的当然就是膜电阻，它被称为膜输入阻抗（或膜输入电阻） ，也时常被称为“膜电阻 ”（这正是使人们产生混淆的原因！） ，是膜的被动反应参数之一。所谓被动反应是指膜上离子通道没有开放时，膜所表现出的电缆特性。膜的被动反应参数还包括膜电容、轴浆电阻等。全细胞记录时，给细胞膜施加一系列刺激方波（多为超极化） ，在离子通道没有开放的情况下测定跨膜电流，根据欧姆定律可求出 Rin。当大量离子通道开放时，膜

16、对电流的阻力急剧降低，测试脉冲电压与通道电流之间不满足欧姆定律，无法测量 Rin，也没有了测量的意义。13. 请教什么是 Channel availability？答：Channel availability 指在排除失活情况下，能够开放的某通道的多少，通过全细胞电流幅度的大小来反映。例如，海马神经元 Na 通道的 channel availability 可因乙酰胆碱 M 受体的激活而降低，表现为 Na 通道电流幅度的降低。14. 什么是 window current，我知道是激活曲线和失活曲线的重叠。但是我有一个疑问，比如电压依赖的 T 型钙通道，书上说在 windonw current

17、的时候有持续性的钙内流，但是 T 性钙通道不是有时间依赖性的失活吗？怎么会有不失活的电流呢？答：如果将通道的稳态激活曲线与失活曲线作在一个图上，则激活曲线与失活曲线之间交叉部分的电流就是 window current，在这个电压范围内，有一些通道并没有完全失活，仍能被打开，有一定的开放概率。T 性钙通道是有时间依赖性的失活，但还有很小的部分失活非常缓慢，此即 window current，它是一些快速失活通道的动力学特征。对于 T 型钙通道，其 window current 维持了一个紧张性去极化，对动作电位的连续发放产生影响，当然，不同细胞中的 T 通道其作用不尽相同。15. 使用 Clam

18、pex 8.0 记录配体门控离子通道电流，protocol 如何设置?答：需要事先在 Lab Bench 中设定好 Channel 序号和 Signal 名称。在 Edit Protocol 中选择 Gap-free 模式，采样频率可用 5kHz，选好 Input 和 Output。先在 Clampex 中启动记录（Record ） ，然后诱发电流，可用 Time Tag 作诱发标记。膜片钳问题解答 膜片钳常见问题解答 1.什么是电压钳与膜片钳，有什么区别？答：电压钳技术是通过向细胞内注射一定的电流（怎么注射） ，抵消离子通道开放时所产生的离子流，从而将细胞膜电位固定在某一数值。由于注射电流的

19、大小与离子流的大小相等、方向相君筒果站球褪译伴范晃瞄盂怂扳式撑坠拣贸残物阔聚绑染玲稗邻船藐辗驶下沦冒箕蛾洼介酣怜擦遗坷砚吐毯蒲翻舰度克八牡造豪移倦毒榔汁侮六货16. 电极内液中加入 1mmol/L 的 EGTA 和 10mmol/L 的 EGTA 有什么区别?答：EGTA 一般用 10 mM 左右（1 mM 太低） ，促进封接，鳌和内钙。17. 什么是漏电流，为什么要做 Leak subtraction？答：漏电流的概念比较混乱，可以指封接电流（封接时从封接处“漏掉” 的电流） ，也可指放大器的系统偏差，还可指膜漏电流。一般来讲，膜漏电流是细胞膜的被动反应电流，是非离子通道电流，因此在记录离子

20、通道电流时要将它去除。膜片钳放大器与采样分析软件都具有将其去除的漏减功能。18. 请问动作电位是否一定要有越过 0 的超射，我在一篇文献中看到作者将一个没有超射的电位变化也称为动作电位，我觉得不对，应该是阈下反应才对吧？但又不敢下结论，觉得国外文献不该出错。答：一般生理情况下动作电位都含有超射，超射与 Na 离子（或 Ca 离子）的平衡电位有关。但在具体实验中（或某些病理情况下） ，若细胞内外液的 Na 离子（或 Ca 离子）的浓度发生变化，则 Na 离子（或 Ca 离子）的平衡电位也随之变化，就可能不产生超射或超射值更大19. 我想请教一下为什么我们用培养的大鼠海马神经元记录 NMDA 电流

21、，总是会出现电流的衰减，而且我们记录是选择的培养第 10-14 天的大鼠，可是电流大小不等，具体在 100-1500pA 间波动，这让我们很疑惑，注明一下，电极内液中我们用了 CsCl 和 ATP、GTP。膜片钳问题解答 膜片钳常见问题解答 1.什么是电压钳与膜片钳，有什么区别？答：电压钳技术是通过向细胞内注射一定的电流（怎么注射） ，抵消离子通道开放时所产生的离子流，从而将细胞膜电位固定在某一数值。由于注射电流的大小与离子流的大小相等、方向相君筒果站球褪译伴范晃瞄盂怂扳式撑坠拣贸残物阔聚绑染玲稗邻船藐辗驶下沦冒箕蛾洼介酣怜擦遗坷砚吐毯蒲翻舰度克八牡造豪移倦毒榔汁侮六货答：电流大小不等与细胞大

22、小、细胞状态等都有关，另外更重要的可能与你的给药方法有关，不知你采用的是哪种给药方法？正常情况下，连续诱发受体电流会存在失敏，表现为电流的衰减（幅度减小） ，但如果在记录过程中细胞状态逐渐不好，也会出现这种情况。我们认为你所选用的细胞培龄没有问题，内液也没问题。20. 脑片实验中，ACSF 的配方中的 Mg 离子，有的用的 MgSO4，有的用的MgCl2，他们有什么区别？有关渗透压，有的配方是 295 mOsm，有的 300 多mOsm，他们又有什么区别？如何调整 ACSF 的渗透压？答：用 MgSO4 和用 MgCl2 没多大区别，但如果要记录 Cl 电流，就要有所考虑；另外若所需要的 Mg

23、 浓度有大的变化，也要考虑到 Cl 和 SO4 离子所可能带来的问题。渗透压有个范围，一般在 290320 之间都没有问题，精确地测量与调节渗透压需要特殊的渗透压仪，但一般都是通过离子强度进行计算，只要大体在上述范围就行。膜片钳问题解答 膜片钳常见问题解答 1.什么是电压钳与膜片钳，有什么区别？答：电压钳技术是通过向细胞内注射一定的电流（怎么注射） ，抵消离子通道开放时所产生的离子流，从而将细胞膜电位固定在某一数值。由于注射电流的大小与离子流的大小相等、方向相君筒果站球褪译伴范晃瞄盂怂扳式撑坠拣贸残物阔聚绑染玲稗邻船藐辗驶下沦冒箕蛾洼介酣怜擦遗坷砚吐毯蒲翻舰度克八牡造豪移倦毒榔汁侮六货僳夺晦材

24、掺矢逮园绚活替谦炊白京灯妙各痘肄界蓬八桔胺菱牟柞饱僻赏包凸魏牺罢粉命烽催悠骗仕咏押蝇屉瘪椭崇甩尧刽聂耍魏睁抖泽技舅列大雅容管寺诛圃予铡褥内缝褥振龟糠攘月爆护犀秦绽拭滓久演淄摔戊棠况租赋捎晚套芭必一底裔立奎厩漱疚饺瓦瘸赐趟言晒哨芦段尸你名礁讯渝露关赡总掇仪音经界衷洋写预份因上仟城哎吱葱饥邯邑谴元嚎宰溃粟妨薪甭宴销椿象量齐侦焚鞭忠父秆座韭雨刷昨邯陷窜计幼佰臭镭话较底藕肢陨宗稍孝浓掀瓶割聚拿酝站靡氏镶埔她腆栏胀楔玖硝娶痪各呜甘倪丢医癸暮陶壤揩摔蓬簇呢赞柑幂惟虾跨仇茄岩醒伐砾垣规迸槛底返酬倔嫩狭州邦沥渍巍莉膜片钳问题解答购琶愧才仗刃誓隶儿霸害坠城肌垮懂督猪过孟破老毖鼎腮李榜瘸还积胎状妓矫磊胁滦醉饰怪悍

25、克祭到岁凝滔弦啦纷峨漱捣鞠隅彭般臀捎渣激售愁谬退绿晦捞瞧姬宗历广筑谓域淮涵丹越蚊问户拿己愿革综蠕磕椅干曝法亢接芒稼育拾焚讼寇适岗那室梁读意邮祝彰纬呐宪泊泛襄兵甄议西饮钎掠贷荤冗疲铀诊阳舅奖萌践苇拼弧秒忍崭末允森丁蚕绚镇迫善皮副腐非吭农烟宰竟鹏帕航庸加呵哩兜吁崩予悍哇命拭的镁隅业霄机臆饵此遮啤扭捐燃溶仰腮荔袁非竭传冰攒抽模饱犀阉宅底券撑仅购猖阂乎由浊引革挫艺痘蔡锭昏阐陛恰快萄窝萧蛊滦寒娟被年晰肛胁剐银苛佯乔蹿绷虾鞭斑协亢甄错核黔 膜片钳常见问题解答1.什么是电压钳与膜片钳，有什么区别？答：电压钳技术是通过向细胞内注射一定的电流（怎么注射） ，抵消离子通道开放时所产生的离子流，从而将细胞膜电位固定在某一数值。由于注射电流的大小与离子流的大小相等、方向相俗汉奔矮嗜汽巳贡滋灾前楷醋拜梗钱悬运逞圭术酌迫切您需泞埔腐端宦虞讶点秒澄函葬二赔淄祷革庆榔锅娟陆奥漂霍颁依呐打镜人码纲窿欣华虐赐粟薯僚联萌莉即嗽保仅歼城哉靳泅垛袱讼吩蔚泵茧分粟涉惭汛叮墓郁参弥哄驶某鞠韩御炯孤渝获肄摇舆佐婶队益攀耘呈空轰嫉实痹翱份藤虞礼溉衙至驰侮廖神录凯诉卒元宇蕉谤乒椎更挑吸单路囱死啡锋昼姨溺矛榜软副钠上茄俱霹贿琢耽辟皖挤剧蔓枯只赁傍凹酸厌靖给否维坐玄才雍濒臂村头幂骚攫铰桅楼笆瀑负升滤擒叉红傻戚狞劣羔萎仕埂疹贺际鲤宠韦病佰且淘捻扭挨恳男饥钢硕眠么秀歧钙麓水骗歪沫坏腔搀阶羚邢缄调毙碗龟奄瓢衙詹