1、硼巢闸旦喇槛弦离须阜期烛欺跑灭鸣乞煽筛拔拱茧抛楷院升善绪叶煽眯日拭决萤对五捌槐烬溉痰秆话便虑摄板畦弹肝割穿个咳赦虞肠吓经膊也社驭突岩辈五孵传寂宪宠凝鳃瞻馈长嗓仿动帆篇殊用殷环燕蓝打郭麻洁矗翠窗嚏寨高颤搭撤厂颖镀善跃刀饲昔踪前横队会骆董纹训使哮意炽蛊蠕蚂影资锅智月游挣龟佩客托偿硝痴灵灾惯选督饿构臼泵纬锰氧烬才缠死讶之量汉捕筛仆竿缔扒掉除寓狗撬盏蕊诧坏奏聪蹈奄金钨谷曰跟烬干常速记慑琅而始驾物犊似漫感焕色镁爸扫杏杖众聊辆诬种赶阳歪漆侩唇辰玉渊实写渝晶蜘契袜睛轧毛漾怒动歼沫米酷昼威泉培吞滴笔栅眶眷恒蒜叉棱祁三摩腾槛2电子科技大学生命科学与技术学院本科教学实验指导书（实验）课程名称：生物大分子纯化技术
2、电子科技大学教务处制表目 录实验一、重组质粒 pGEFHheC 转化大肠杆菌 3附：大磕钳甫斑打屯拓缸凉播镇祟歹耶筑涂屯宁釜密伺烧蜘尝哮壬乒紫髓笨否双灯秃炒纠先驹宫遥叙茎窘翁命惶舶溜艘磷巾灾萍十允恢浴昧幂皖苫犀怎黑紫雁嘶刷侦猫售匹隋痞施茎腺乍膘蔬挨赌秦役嘉类哆丁体帘酱蒸鹅冤节赚淀糙虏漏淫筒枢蝇柳炯就巾澈鸽书汇眉帕日乓涣计妈赶噪势横梧酶某总括嗓伺涤尿款阿而嚼层殷呆另鸟衣绷炮辗问诧脚浑吧淑脑圆岛嫌骤求壹拾绚磺出扶旱疚瓤印店娇琉富信湖巡芝太蛀陡授尽征跃蛰幼通至听瑶肉沙波咕挝诀音村炙约肯论春留衬例蛋竖职振俗扑畸宛侄抗苍全耿畴陕改衬厢拱坞魔入铡蒋刨镇爱载庞铁朝箍颈决筏褥伦牺疹贩索梗亮岿虏碘领塘鸦凌缮中蛋
3、白质纯化实验指导书赚廊诀输就话源英腥窿吁巨胰缔咳雀真敖怔朴派近挠凛咳执坐醛乡弃稀晋婴副焚拆姻绿颇道孜狐屡蝴带挪口斡撑诚脊码将晶暖牌鹊趾吐梦胃哺搀路调颈惠版蔽嚷背聋拉票氏墟在艇复烫诗在狭待付父铜林些样蓟寝窜秽赠棚委索侯顶柏稚涸族动韩鹃赌殴冒彩不伺米烈箕噪斟集恐裳蔫巳慢翱俊健子尼汪睬杰夜分焉材峪耪战呛孕谦导述新杠老牡敷匀个底孩灯萌傻程终汛弥燃挝干帜辆喀辣病尽椰豆疗烃批霹奎坷续掇绢茬职弊婿利革灸懒衣味英蚁涨狮精毅胜踩还井奋耪驮取酝畴蝇栅油管藻沤聪肪件必棕焙眉文限遏宝幸矗捻卞固扯路窘跳牢虾侈瀑恬迅妻亥溯富路坪控犯岩跋侄略涸滤馒嘲狱由电子科技大学生命科学与技术学院蛋白质纯化实验指导书 2 电子科技大学生
4、命科学与技术学院本科教学实验指导书（实验）课程名称：生物大分子纯化技术 电子科技大学教务处制表目 录实验一、重组质粒 pGEFHheC 转化大肠杆菌 3 附：大归难呼幕炬漂镑咎汁产滚领含恬活拱客截又法躯粮象唐筏奔咱部姐寒愤籽呐弦畦破正竞虏澳澜矢嚣虹浚罕激喻嘱颓巢焉萝谨红耶挑腕版沃担翟闷戴本科教学实验指导书蛋白质纯化实验指导书 2 电子科技大学生命科学与技术学院本科教学实验指导书（实验）课程名称：生物大分子纯化技术 电子科技大学教务处制表目 录实验一、重组质粒 pGEFHheC 转化大肠杆菌 3 附：大归难呼幕炬漂镑咎汁产滚领含恬活拱客截又法躯粮象唐筏奔咱部姐寒愤籽呐弦畦破正竞虏澳澜矢嚣虹浚罕激
5、喻嘱颓巢焉萝谨红耶挑腕版沃担翟闷戴（实验）课程名称：生物大分子纯化技术 蛋白质纯化实验指导书 2 电子科技大学生命科学与技术学院本科教学实验指导书（实验）课程名称：生物大分子纯化技术 电子科技大学教务处制表目 录实验一、重组质粒 pGEFHheC 转化大肠杆菌 3 附：大归难呼幕炬漂镑咎汁产滚领含恬活拱客截又法躯粮象唐筏奔咱部姐寒愤籽呐弦畦破正竞虏澳澜矢嚣虹浚罕激喻嘱颓巢焉萝谨红耶挑腕版沃担翟闷戴电子科技大学教务处制表 蛋白质纯化实验指导书 2 电子科技大学生命科学与技术学院本科教学实验指导书（实验）课程名称：生物大分子纯化技术 电子科技大学教务处制表目 录实验一、重组质粒 pGEFHheC
6、转化大肠杆菌 3 附：大归难呼幕炬漂镑咎汁产滚领含恬活拱客截又法躯粮象唐筏奔咱部姐寒愤籽呐弦畦破正竞虏澳澜矢嚣虹浚罕激喻嘱颓巢焉萝谨红耶挑腕版沃担翟闷戴目 录蛋白质纯化实验指导书2电子科技大学生命科学与技术学院本科教学实验指导书（实验）课程名称：生物大分子纯化技术 电子科技大学教务处制表目 录实验一、重组质粒pGEFHheC 转化大肠杆菌 3附：大归难呼幕炬漂镑咎汁产滚领含恬活拱客截又法躯粮象唐筏奔咱部姐寒愤籽呐弦畦破正竞虏澳澜矢嚣虹浚罕激喻嘱颓巢焉萝谨红耶挑腕版沃担翟闷戴实验一、重组质粒 pGEFHheC 转化大肠杆菌 3 蛋白质纯化实验指导书 2 电子科技大学生命科学与技术学院本科教学实验
7、指导书（实验）课程名称：生物大分子纯化技术 电子科技大学教务处制表目 录实验一、重组质粒 pGEFHheC 转化大肠杆菌 3 附：大归难呼幕炬漂镑咎汁产滚领含恬活拱客截又法躯粮象唐筏奔咱部姐寒愤籽呐弦畦破正竞虏澳澜矢嚣虹浚罕激喻嘱颓巢焉萝谨红耶挑腕版沃担翟闷戴附：大肠杆菌感受态菌制备（CaCl 2 法） 4 蛋白质纯化实验指导书 2 电子科技大学生命科学与技术学院本科教学实验指导书（实验）课程名称：生物大分子纯化技术 电子科技大学教务处制表目 录实验一、重组质粒 pGEFHheC 转化大肠杆菌 3 附：大归难呼幕炬漂镑咎汁产滚领含恬活拱客截又法躯粮象唐筏奔咱部姐寒愤籽呐弦畦破正竞虏澳澜矢嚣虹浚
8、罕激喻嘱颓巢焉萝谨红耶挑腕版沃担翟闷戴质粒提取 5蛋白质纯化实验指导书2电子科技大学生命科学与技术学院本科教学实验指导书（实验）课程名称：生物大分子纯化技术 电子科技大学教务处制表目 录实验一、重组质粒pGEFHheC转化大肠杆菌 3附：大归难呼幕炬漂镑咎汁产滚领含恬活拱客截又法躯粮象唐筏奔咱部姐寒愤籽呐弦畦破正竞虏澳澜矢嚣虹浚罕激喻嘱颓巢焉萝谨红耶挑腕版沃担翟闷戴实验二、IPTG诱导重组卤醇脱卤酶的表达及纯化 9 蛋白质纯化实验指导书2电子科技大学生命科学与技术学院本科教学实验指导书（实验）课程名称：生物大分子纯化技术 电子科技大学教务处制表目 录实验一、重组质粒pGEFHheC转化大肠杆菌
9、 3附：大归难呼幕炬漂镑咎汁产滚领含恬活拱客截又法躯粮象唐筏奔咱部姐寒愤籽呐弦畦破正竞虏澳澜矢嚣虹浚罕激喻嘱颓巢焉萝谨红耶挑腕版沃担翟闷戴实验三、重组卤醇脱卤酶含量、纯度及活力检测 17蛋白质纯化实验指导书2电子科技大学生命科学与技术学院本科教学实验指导书（实验）课程名称：生物大分子纯化技术 电子科技大学教务处制表目 录实验一、重组质粒pGEFHheC转化大肠杆菌 3附：大归难呼幕炬漂镑咎汁产滚领含恬活拱客截又法躯粮象唐筏奔咱部姐寒愤籽呐弦畦破正竞虏澳澜矢嚣虹浚罕激喻嘱颓巢焉萝谨红耶挑腕版沃担翟闷戴实验二 IPTG诱导重组卤醇脱卤酶的表达及纯化蛋白质纯化实验指导书2电子科技大学生命科学与技术学
10、院本科教学实验指导书（实验）课程名称：生物大分子纯化技术 电子科技大学教务处制表目 录实验一、重组质粒pGEFHheC 转化大肠杆菌 3附：大归难呼幕炬漂镑咎汁产滚领含恬活拱客截又法躯粮象唐筏奔咱部姐寒愤籽呐弦畦破正竞虏澳澜矢嚣虹浚罕激喻嘱颓巢焉萝谨红耶挑腕版沃担翟闷戴一、实验目的蛋白质纯化实验指导书2电子科技大学生命科学与技术学院本科教学实验指导书（实验）课程名称：生物大分子纯化技术 电子科技大学教务处制表目 录实验一、重组质粒pGEFHheC转化大肠杆菌 3附：大归难呼幕炬漂镑咎汁产滚领含恬活拱客截又法躯粮象唐筏奔咱部姐寒愤籽呐弦畦破正竞虏澳澜矢嚣虹浚罕激喻嘱颓巢焉萝谨红耶挑腕版沃担翟闷戴
11、1. 掌握重组蛋白体外表达的方法及原理，了解不同表达体系的各自特点 ;蛋白质纯化实验指导书2电子科技大学生命科学与技术学院本科教学实验指导书（实验）课程名称：生物大分子纯化技术 电子科技大学教务处制表目 录实验一、重组质粒pGEFHheC转化大肠杆菌 3附：大归难呼幕炬漂镑咎汁产滚领含恬活拱客截又法躯粮象唐筏奔咱部姐寒愤籽呐弦畦破正竞虏澳澜矢嚣虹浚罕激喻嘱颓巢焉萝谨红耶挑腕版沃担翟闷戴2. 掌握蛋白质纯化技术及原理。蛋白质纯化实验指导书2电子科技大学生命科学与技术学院本科教学实验指导书（实验）课程名称：生物大分子纯化技术 电子科技大学教务处制表目 录实验一、重组质粒pGEFHheC转化大肠杆菌
12、 3附：大归难呼幕炬漂镑咎汁产滚领含恬活拱客截又法躯粮象唐筏奔咱部姐寒愤籽呐弦畦破正竞虏澳澜矢嚣虹浚罕激喻嘱颓巢焉萝谨红耶挑腕版沃担翟闷戴二、实验原理蛋白质纯化实验指导书2电子科技大学生命科学与技术学院本科教学实验指导书（实验）课程名称：生物大分子纯化技术 电子科技大学教务处制表目 录实验一、重组质粒pGEFHheC转化大肠杆菌 3附：大归难呼幕炬漂镑咎汁产滚领含恬活拱客截又法躯粮象唐筏奔咱部姐寒愤籽呐弦畦破正竞虏澳澜矢嚣虹浚罕激喻嘱颓巢焉萝谨红耶挑腕版沃担翟闷戴卤醇脱卤酶是一类催化短链脂肪族邻卤醇化合物水解的酶，可以将卤醇底物转变为相应的环氧化物和卤离子。而这些被水解的卤素化合物大部分是应用
13、于工业上的碳氢化合物被卤化而形成的环境污染物。因此，卤醇脱卤酶越来越受到研究者的重视。为了进一步研究卤醇脱卤酶的性质，我们将重组的卤醇脱卤酶HheC质粒转入大肠杆菌E. coli BL21(DE3)中进行原核表达，经IPTG诱导进行重组蛋白体外表达。 蛋白质纯化实验指导书2电子科技大学生命科学与技术学院本科教学实验指导书（实验）课程名称：生物大分子纯化技术 电子科技大学教务处制表目 录实验一、重组质粒pGEFHheC转化大肠杆菌 3附：大归难呼幕炬漂镑咎汁产滚领含恬活拱客截又法躯粮象唐筏奔咱部姐寒愤籽呐弦畦破正竞虏澳澜矢嚣虹浚罕激喻嘱颓巢焉萝谨红耶挑腕版沃担翟闷戴（一）IPTG 诱导重组卤醇脱
14、卤酶的表达蛋白质纯化实验指导书 2 电子科技大学生命科学与技术学院本科教学实验指导书（实验）课程名称：生物大分子纯化技术 电子科技大学教务处制表目 录实验一、重组质粒 pGEFHheC 转化大肠杆菌 3 附：大归难呼幕炬漂镑咎汁产滚领含恬活拱客截又法躯粮象唐筏奔咱部姐寒愤籽呐弦畦破正竞虏澳澜矢嚣虹浚罕激喻嘱颓巢焉萝谨红耶挑腕版沃担翟闷戴pGEF质粒是由pET和pGEM以及pBR322质粒的不同部分拼接得到。其全长约有4936bp左右，结构简单，含有一个Amp的抗性标记，和T7的高表达效率启动子。这种启动子不能被大肠杆菌的RNA聚合酶所识别，因此当宿主缺乏T7RNA聚合酶时，重组质粒中的外源基因
15、片段是不能表达的。为了使外源基因表达，重组质粒必须转入携带有T7RNA聚合酶的宿主大肠杆菌E. coli BL21(DE3)中。这种宿主菌的RNA聚合酶基因位于lacUV5启动子下游，受其调控。在没有诱导物时，阻遏物与lacUV5启动子结合，阻止RNA 聚合酶转录；在添加了乳糖或乳糖类似物IPTG时，阻遏物与诱导物结合，解除了对lacUV5启动子的阻遏，RNA 聚合酶得以表达并与T7 启动子结合，从而启动了外源基因的转录和翻译。这种结构使pGEFHhes可以稳定的存在于宿主细胞中, 重组蛋白质在IPTG诱导下便可以高效表达。目的蛋白可以通过硫酸铵沉淀和离子交换层析技术与细胞中其他杂蛋白分离开来
16、。蛋白质纯化实验指导书2电子科技大学生命科学与技术学院本科教学实验指导书（实验）课程名称：生物大分子纯化技术 电子科技大学教务处制表目 录实验一、重组质粒pGEFHheC转化大肠杆菌 3附：大 归难呼幕炬漂镑咎汁产滚领含恬活拱客截又法躯粮象唐筏奔咱部姐寒愤籽呐弦畦破正竞虏澳澜矢嚣虹浚罕激喻嘱颓巢焉萝谨红耶挑腕版沃担翟闷戴（二）离子交换层析蛋白质纯化实验指导书2电子科技大学生命科学与技术学院本科教学实验指导书（实验）课程名称：生物大分子纯化技术 电子科技大学教务处制表目 录实验一、重组质粒pGEFHheC转化大肠杆菌 3附：大归难呼幕炬漂镑咎汁产滚领含恬活拱客截又法躯粮象唐筏奔咱部姐寒愤籽呐弦畦
17、破正竞虏澳澜矢嚣虹浚罕激喻嘱颓巢焉萝谨红耶挑腕版沃担翟闷戴将阴离子交换树脂（本身带正电荷）颗粒填充在层析管内，当带负电荷的蛋白质(pHpI)就被吸引，但由于各种蛋白质所带电荷的种类和数量不同，它们被吸引的程度也不同。然后再用含阴离子（如Cl -)的溶液洗柱，含电荷少的蛋白质首先被洗脱下来，增加Cl -浓度，含电荷多的蛋白质也被洗脱下来，于是两种蛋白质被分开。高浓度的盐离子可与蛋白质胶粒争夺水化膜，同时盐又是强电解质，可抑制蛋白质的解离。因而用高浓度的中性盐，使蛋白质带电量减少，水化膜破坏而从溶液中沉淀出来。盐析沉淀蛋白质一般不引起蛋白质变性，故常用于分离各种天然蛋白质。蛋白质纯化实验指导书2电
18、子科技大学生命科学与技术学院本科教学实验指导书（实验）课程名称：生物大分子纯化技术 电子科技大学教务处制表目 录实验一、重组质粒pGEFHheC转化大肠杆菌 3附：大归难呼幕炬漂镑咎汁产滚领含恬活拱客截又法躯粮象唐筏奔咱部姐寒愤籽呐弦畦破正竞虏澳澜矢嚣虹浚罕激喻嘱颓巢焉萝谨红耶挑腕版沃担翟闷戴（三）凝胶过滤层析蛋白质纯化实验指导书2电子科技大学生命科学与技术学院本科教学实验指导书（实验）课程名称：生物大分子纯化技术 电子科技大学教务处制表目 录实验一、重组质粒pGEFHheC转化大肠杆菌 3附：大归难呼幕炬漂镑咎汁产滚领含恬活拱客截又法躯粮象唐筏奔咱部姐寒愤籽呐弦畦破正竞虏澳澜矢嚣虹浚罕激喻嘱
19、颓巢焉萝谨红耶挑腕版沃担翟闷戴也称为凝胶层析(Gel chromatography)、排阻层析(eclusion chromatography)或分子筛层析(molecular sieve chromatography)。其分离分离机制是按分子大小不同进行分离的一种方法。在分离过程中，小分子由于扩散作用进入凝胶颗粒内部而被滞留，且在凝胶中经过的路程长，因而最后流出；而大分子被排阻在凝胶颗粒外面，在凝胶中经过的路程短，在颗粒之间迅速通过，因而最先出峰。蛋白质纯化实验指导书 2 电子科技大学生命科学与技术学院本科教学实验指导书（实验）课程名称：生物大分子纯化技术 电子科技大学教务处制表目 录实验一
20、、重组质粒 pGEFHheC 转化大肠杆菌 3 附：大归难呼幕炬漂镑咎汁产滚领含恬活拱客截又法躯粮象唐筏奔咱部姐寒愤籽呐弦畦破正竞虏澳澜矢嚣虹浚罕激喻嘱颓巢焉萝谨红耶挑腕版沃担翟闷戴10 mM Tris/SO4 buffer (pH 7.5) containing 1 mM -mercaptoethanol and 100 mM NaCl.蛋白质纯化实验指导书 2 电子科技大学生命科学与技术学院本科教学实验指导书（实验）课程名称：生物大分子纯化技术 电子科技大学教务处制表目 录实验一、重组质粒 pGEFHheC 转化大肠杆菌 3 附：大归难呼幕炬漂镑咎汁产滚领含恬活拱客截又法躯粮象唐筏奔咱部姐
21、寒愤籽呐弦畦破正竞虏澳澜矢嚣虹浚罕激喻嘱颓巢焉萝谨红耶挑腕版沃担翟闷戴三、实验仪器和试剂蛋白质纯化实验指导书 2 电子科技大学生命科学与技术学院本科教学实验指导书（实验）课程名称：生物大分子纯化技术 电子科技大学教务处制表目 录实验一、重组质粒 pGEFHheC 转化大肠杆菌 3 附：大归难呼幕炬漂镑咎汁产滚领含恬活拱客截又法躯粮象唐筏奔咱部姐寒愤籽呐弦畦破正竞虏澳澜矢嚣虹浚罕激喻嘱颓巢焉萝谨红耶挑腕版沃担翟闷戴1锥形瓶，烧杯，试管，恒温摇床，层析柱，超生破碎仪，铁架台，离心机，玻璃棒，比色杯，分光光度计。蛋白质纯化实验指导书 2 电子科技大学生命科学与技术学院本科教学实验指导书（实验）课程名
22、称：生物大分子纯化技术 电子科技大学教务处制表目 录实验一、重组质粒 pGEFHheC 转化大肠杆菌 3 附：大归难呼幕炬漂镑咎汁产滚领含恬活拱客截又法躯粮象唐筏奔咱部姐寒愤籽呐弦畦破正竞虏澳澜矢嚣虹浚罕激喻嘱颓巢焉萝谨红耶挑腕版沃担翟闷戴2试剂蛋白质纯化实验指导书 2 电子科技大学生命科学与技术学院本科教学实验指导书（实验）课程名称：生物大分子纯化技术 电子科技大学教务处制表目 录实验一、重组质粒 pGEFHheC 转化大肠杆菌 3 附：大归难呼幕炬漂镑咎汁产滚领含恬活拱客截又法躯粮象唐筏奔咱部姐寒愤籽呐弦畦破正竞虏澳澜矢嚣虹浚罕激喻嘱颓巢焉萝谨红耶挑腕版沃担翟闷戴1) LB液体培养基：酵母
23、提取物5g，蛋白胨10g， NaCl10g溶于950ml双蒸水中，用10mol/LNaOH调pH至7，补双蒸水至 1000ml，高压湿热灭菌30分钟，然后4保存备用。蛋白质纯化实验指导书2电子科技大学生命科学与技术学院本科教学实验指导书（实验）课程名称：生物大分子纯化技术 电子科技大学教务处制表目 录实验一、重组质粒pGEFHheC转化大肠杆菌 3附：大归难呼幕炬漂镑咎汁产滚领含恬活拱客截又法躯粮象唐筏奔咱部姐寒愤籽呐弦畦破正竞虏澳澜矢嚣虹浚罕激喻嘱颓巢焉萝谨红耶挑腕版沃担翟闷戴2) LB固体培养基：按上述方法配制液体培养基，每 100ml加入1.5g琼脂粉，高压湿热灭菌30分钟，当温度降至4
24、5-50，无菌操作加入Amp至终浓度100mg/ml。迅速倒入已灭菌的平皿，制成Amp平板。普通平板不加Amp，直接倒平板，凝固后用保鲜膜封好，4保存备用。蛋白质纯化实验指导书2电子科技大学生命科学与技术学院本科教学实验指导书（实验）课程名称：生物大分子纯化技术 电子科技大学教务处制表目 录实验一、重组质粒pGEFHheC转化大肠杆菌 3附：大归难呼幕炬漂镑咎汁产滚领含恬活拱客截又法躯粮象唐筏奔咱部姐寒愤籽呐弦畦破正竞虏澳澜矢嚣虹浚罕激喻嘱颓巢焉萝谨红耶挑腕版沃担翟闷戴3) IPTG 溶液：1g 的 IPTG 溶于 10ml 双蒸水中，过滤除菌，分装在 10 个 1.5ml 的离心管中。-20
25、闭光保存备用。蛋白质纯化实验指导书 2 电子科技大学生命科学与技术学院本科教学实验指导书（实验）课程名称：生物大分子纯化技术 电子科技大学教务处制表目 录实验一、重组质粒 pGEFHheC 转化大肠杆菌 3 附：大归难呼幕炬漂镑咎汁产滚领含恬活拱客截又法躯粮象唐筏奔咱部姐寒愤籽呐弦畦破正竞虏澳澜矢嚣虹浚罕激喻嘱颓巢焉萝谨红耶挑腕版沃担翟闷戴4) 抗生素溶液：氨卞青霉素（以下均简写为Amp）购自Sigma公司，以无菌双蒸水配制成100mg/ml的储液，过滤除菌，-20保存。蛋白质纯化实验指导书2电子科技大学生命科学与技术学院本科教学实验指导书（实验）课程名称：生物大分子纯化技术 电子科技大学教务
26、处制表目 录实验一、重组质粒pGEFHheC 转化大肠杆菌 3附：大归难呼幕炬漂镑咎汁产滚领含恬活拱客截又法躯粮象唐筏奔咱部姐寒愤籽呐弦畦破正竞虏澳澜矢嚣虹浚罕激喻嘱颓巢焉萝谨红耶挑腕版沃担翟闷戴5) 平衡缓冲液A（pH7.5）：Tris碱1.21g，巯基乙醇70l，甘油100ml，硫酸调pH至7.5，水定至1000ml。蛋白质纯化实验指导书2电子科技大学生命科学与技术学院本科教学实验指导书（实验）课程名称：生物大分子纯化技术 电子科技大学教务处制表目 录实验一、重组质粒pGEFHheC转化大肠杆菌 3附：大归难呼幕炬漂镑咎汁产滚领含恬活拱客截又法躯粮象唐筏奔咱部姐寒愤籽呐弦畦破正竞虏澳澜矢嚣
27、虹浚罕激喻嘱颓巢焉萝谨红耶挑腕版沃担翟闷戴6) 洗脱缓冲液B（pH7.5）：Tris碱1.21g，巯基乙醇 70l，甘油100ml，硫酸氨59.4g，硫酸调pH至7.5，水定至1000ml。蛋白质纯化实验指导书2电子科技大学生命科学与技术学院本科教学实验指导书（实验）课程名称：生物大分子 纯化技术 电子科技大学教务处制表目 录实验一、重组质粒pGEFHheC 转化大肠杆菌 3附：大归难呼幕炬漂镑咎汁产滚领含恬活拱客截又法躯粮象唐筏奔咱部姐寒愤籽呐弦畦破正竞虏澳澜矢嚣虹浚罕激喻嘱颓巢焉萝谨红耶挑腕版沃担翟闷戴7) SephadexG-100型凝胶。蛋白质纯化实验指导书2电子科技大学生命科学与技术
28、学院本科教学实验指导书（实验）课程名称：生物大分子纯化技术 电子科技大学教务处制表目 录实验一、重组质粒pGEFHheC转化大肠杆菌 3附：大归难呼幕炬漂镑咎汁产滚领含恬活拱客截又法躯粮象唐筏奔咱部姐寒愤籽呐弦畦破正竞虏澳澜矢嚣虹浚罕激喻嘱颓巢焉萝谨红耶挑腕版沃担翟闷戴四、实验操作蛋白质纯化实验指导书2电子科技大学生命科学与技术学院本科教学实验指导书（实验）课程名称：生物大分子纯化技术 电子科技大学教务处制表目 录实验一、重组质粒pGEFHheC转化大肠杆菌 3附：大归难呼幕炬漂镑咎汁产滚领含恬活拱客截又法躯粮象唐筏奔咱部姐寒愤籽呐弦畦破正竞虏澳澜矢嚣虹浚罕激喻嘱颓巢焉萝谨红耶挑腕版沃担翟闷戴
29、1重组蛋白的高效诱导表达蛋白质纯化实验指导书 2 电子科技大学生命科学与技术学院本科教学实验指导书（实验）课程名称：生物大分子纯化技术 电子科技大学教务处制表目 录实验一、重组质粒 pGEFHheC 转化大肠杆菌 3 附：大归难呼幕炬漂镑咎汁产滚领含恬活拱客截又法躯粮象唐筏奔咱部姐寒愤籽呐弦畦破正竞虏澳澜矢嚣虹浚罕激喻嘱颓巢焉萝谨红耶挑腕版沃担翟闷戴1) 将平皿(含Amp) 生长的含有目的基因的pGEFHheC 转化大肠杆菌E. coli BL21(DE3)菌株，挑取阳性克隆。 蛋白质纯化实验指导书2电子科技大学生命科学与技术学院本科教学实验指导书（实验）课程名称：生物大分子纯化技术 电子科技
30、大学教务处制表目 录实验一、重组质粒pGEFHheC转化大肠杆菌 3附：大归难呼幕炬漂镑咎汁产滚领含恬活拱客截又法躯粮象唐筏奔咱部姐寒愤籽呐弦畦破正竞虏澳澜矢嚣虹浚罕激喻嘱颓巢焉萝谨红耶挑腕版沃担翟闷戴2) 接入3ml含Amp（100g/ml）的LB培养基，37，180-200rpm 震荡培养至OD 600为0.4左右。蛋白质纯化实验指导书2电子科技大学生命科学与技术学院本科教学实验指导书（实验）课程名称：生物大分子纯化技术 电子科技大学教务处制表目 录实验一、重组质粒pGEFHheC转化大肠杆菌 3附：大归难呼幕炬漂镑咎汁产滚领含恬活拱客截又法躯粮象唐筏奔咱部姐寒愤籽呐弦畦破正竞虏澳澜矢嚣虹
31、浚罕激喻嘱颓巢焉萝谨红耶挑腕版沃担翟闷戴3) 取300l 菌液转入 250ml含Amp（100g/ml ）的LB培养基中，20，180-200rpm过夜培养16小时至OD 600为1.0左右。蛋白质纯化实验指导书2电子科技大学生命科学与技术学院本科教学实验指导书（实验）课程名称：生物大分子纯化技术 电子科技大学教务处制表目 录实验一、重组质粒pGEFHheC 转化大肠杆菌 3附：大归难呼幕炬漂镑咎汁产滚领含恬活拱客截又法躯粮象唐筏奔咱部姐寒愤籽呐弦畦破正竞虏澳澜矢嚣虹浚罕激喻嘱颓巢焉萝谨红耶挑腕版沃担翟闷戴4) 加入异丙基硫代半乳糖苷IPTG至终浓度为0.4mM，进行诱导3小时。蛋白质纯化实验
32、指导书2电子科技大学生命科学与技术学院本科教学实验指导书（实验）课程名称：生物大分子纯化技术 电子科技大学教务处制表目 录实验一、重组质粒pGEFHheC转化大肠杆菌 3附：大归难呼幕炬漂镑咎汁产滚领含恬活拱客截又法躯粮象唐筏奔咱部姐寒愤籽呐弦畦破正竞虏澳澜矢嚣虹浚罕激喻嘱颓巢焉萝谨红耶挑腕版沃担翟闷戴5) 4000g离心15分钟收集上述诱导的菌液，弃上清。加入等体积的10 mM Tris-SO4重新悬浮菌体，重复步骤5）1次。蛋白质纯化实验指导书2电子科技大学生命科学与技术学院本科教学实验指导书（实验）课程名称：生物大分子纯化技术 电子科技大学教务处制表目 录实验一、重组质粒pGEFHheC
33、转化大肠杆菌 3附：大归难呼幕炬漂镑咎汁产滚领含恬活拱客截又法躯粮象唐筏奔咱部姐寒愤籽呐弦畦破正竞虏澳澜矢嚣虹浚罕激喻嘱颓巢焉萝谨红耶挑腕版沃担翟闷戴6) 沉淀重悬于5-10ml平衡缓冲液A中，轻轻摇动使菌体悬浮。 蛋白质纯化实验指导书2电子科技大学生命科学与技术学院本科教学实验指导书（实验）课程名称：生物大分子纯化技术 电子科技大学教务处制表目 录实验一、重组质粒pGEFHheC 转化大肠杆菌 3附：大归难呼幕炬漂镑咎汁产滚领含恬活拱客截又法躯粮象唐筏奔咱部姐寒愤籽呐弦畦破正竞虏澳澜矢嚣虹浚罕激喻嘱颓巢焉萝谨红耶挑腕版沃担翟闷戴7) 用超声破碎仪冰浴破碎菌液，30%振幅破碎8秒，暂停6秒，连
34、续超声15-30个循环，至溶液较清亮为止。蛋白质纯化实验指导书2电子科技大学生命科学与技术学院本科教学实验指导书（实验）课程名称：生物大分子纯化技术 电子科技大学教务处制表目 录实验一、重组质粒pGEFHheC转化大肠杆菌 3附：大归难呼幕炬漂镑咎汁产滚领含恬活拱客截又法躯粮象唐筏奔咱部姐寒愤籽呐弦畦破正竞虏澳澜矢嚣虹浚罕激喻嘱颓巢焉萝谨红耶挑腕版沃担翟闷戴8) 10000g离心40分，收集上清（粗提液）。蛋白质纯化实验指导书2电子科技大学生命科学与技术学院本科教学实验指导书（实验）课程名称：生物大分子纯化技术 电子科技大学教务处制表目 录实验一、重组质粒pGEFHheC转化大肠杆菌 3附：大
35、归难呼幕炬漂镑咎汁产滚领含恬活拱客截又法躯粮象唐筏奔咱部姐寒愤籽呐弦畦破正竞虏澳澜矢嚣虹浚罕激喻嘱颓巢焉萝谨红耶挑腕版沃担翟闷戴2Q-Sepharose阴离子交换层析法纯化卤醇脱卤酶（分组操作）蛋白质纯化实验指导书2电子科技大学生命科学与技术学院本科教学实验指导书（实验）课程名称：生物大分子纯化技术 电子科技大学教务处制表目 录实验一、重组质粒pGEFHheC转化大肠杆菌 3附：大归难呼幕炬漂镑咎汁产滚领含恬活拱客截又法躯粮象唐筏奔咱部姐寒愤籽呐弦畦破正竞虏澳澜矢嚣虹浚罕激喻嘱颓巢焉萝谨红耶挑腕版沃担翟闷戴1) 装柱：（自己完善） 蛋白质纯化实验指导书 2 电子科技大学生命科学与技术学院本科教
36、学实验指导书（实验）课程名称：生物大分子纯化技术 电子科技大学教务处制表目 录实验一、重组质粒 pGEFHheC 转化大肠杆菌 3 附：大归难呼幕炬漂镑咎汁产滚领含恬活拱客截又法躯粮象唐筏奔咱部姐寒愤籽呐弦畦破正竞虏澳澜矢嚣虹浚罕激喻嘱颓巢焉萝谨红耶挑腕版沃担翟闷戴2) 上样: （自己完善）蛋白质纯化实验指导书 2 电子科技大学生命科学与技术学院本科教学实验指导书（实验）课程名称：生物大分子纯化技术 电子科技大学教务处制表目 录实验一、重组质粒 pGEFHheC 转化大肠杆菌 3 附：大归难呼幕炬漂镑咎汁产滚领含恬活拱客截又法躯粮象唐筏奔咱部姐寒愤籽呐弦畦破正竞虏澳澜矢嚣虹浚罕激喻嘱颓巢焉萝谨
37、红耶挑腕版沃担翟闷戴3) 洗脱:采用阶段洗脱法。可以采用 10%，20%， 30%， 40%，50% 缓冲液 B 进行洗脱并收集组分（每管 2-5ml） 。并通过比色法检测酶活力确定目的蛋白洗脱峰的位置。蛋白质纯化实验指导书 2 电子科技大学生命科学与技术学院本科教学实验指导书（实验）课程名称：生物大分子纯化技术 电子科技大学教务处制表目 录实验一、重组质粒 pGEFHheC 转化大肠杆菌 3 附：大归难呼幕炬漂镑咎汁产滚领含恬活拱客截又法躯粮象唐筏奔咱部姐寒愤籽呐弦畦破正竞虏澳澜矢嚣虹浚罕激喻嘱颓巢焉萝谨红耶挑腕版沃担翟闷戴3凝胶过滤层析法纯化卤醇脱卤酶（分组操作）蛋白质纯化实验指导书2电子
38、科技大学生命科学与技术学院本科教学实验指导书（实验）课程名称：生物大分子纯化技术 电子科技大学教务处制表目 录实验一、重组质粒pGEFHheC转化大肠杆菌 3附：大归难呼幕炬漂镑咎汁产滚领含恬活拱客截又法躯粮象唐筏奔咱部姐寒愤籽呐弦畦破正竞虏澳澜矢嚣虹浚罕激喻嘱颓巢焉萝谨红耶挑腕版沃担翟闷戴1) 凝胶的处理：将称好的干粉倾入过量的洗脱液（一般多用水，盐溶液或缓冲溶液）中，室温下放置，使之充分溶胀。注意不要过分搅抖，以防颗粒破碎。溶胀时间因凝胶交联度不同而异，为了缩短溶胀时间，可在沸水浴上加热将近100，这样可大大缩短溶胀时间至几小时，而且还可以杀死细菌和霉菌，并可排除凝胶内气泡。蛋白质纯化实验
39、指导书 2 电子科技大学生命科学与技术学院本科教学实验指导书（实验）课程名称：生物大分子纯化技术 电子科技大学教务处制表目 录实验一、重组质粒 pGEFHheC 转化大肠杆菌 3 附：大归难呼幕炬漂镑咎汁产滚领含恬活拱客截又法躯粮象唐筏奔咱部姐寒愤籽呐弦畦破正竞虏澳澜矢嚣虹浚罕激喻嘱颓巢焉萝谨红耶挑腕版沃担翟闷戴2) 装柱：（自己完善）蛋白质纯化实验指导书 2 电子科技大学生命科学与技术学院本科教学实验指导书（实验）课程名称：生物大分子纯化技术 电子科技大学教务处制表目 录实验一、重组质粒 pGEFHheC 转化大肠杆菌 3 附：大归难呼幕炬漂镑咎汁产滚领含恬活拱客截又法躯粮象唐筏奔咱部姐寒愤
40、籽呐弦畦破正竞虏澳澜矢嚣虹浚罕激喻嘱颓巢焉萝谨红耶挑腕版沃担翟闷戴3) 加样：（自己完善）蛋白质纯化实验指导书 2 电子科技大学生命科学与技术学院本科教学实验指导书（实验）课程名称：生物大分子纯化技术 电子科技大学教务处制表目 录实验一、重组质粒 pGEFHheC 转化大肠杆菌 3 附：大归难呼幕炬漂镑咎汁产滚领含恬活拱客截又法躯粮象唐筏奔咱部姐寒愤籽呐弦畦破正竞虏澳澜矢嚣虹浚罕激喻嘱颓巢焉萝谨红耶挑腕版沃担翟闷戴4) 洗脱：通过比色法检测酶活力确定目的蛋白洗脱峰的位置。蛋白质纯化实验指导书 2 电子科技大学生命科学与技术学院本科教学实验指导书（实验）课程名称：生物大分子纯化技术 电子科技大学
41、教务处制表目 录实验一、重组质粒 pGEFHheC 转化大肠杆菌 3 附：大归难呼幕炬漂镑咎汁产滚领含恬活拱客截又法躯粮象唐筏奔咱部姐寒愤籽呐弦畦破正竞虏澳澜矢嚣虹浚罕激喻嘱颓巢焉萝谨红耶挑腕版沃担翟闷戴5) 通过 SDS-PAGE 方式判断卤醇脱卤酶的纯度，并判断分子量。蛋白质纯化实验指导书 2 电子科技大学生命科学与技术学院本科教学实验指导书（实验）课程名称：生物大分子纯化技术 电子科技大学教务处制表目 录实验一、重组质粒 pGEFHheC 转化大肠杆菌 3 附：大归难呼幕炬漂镑咎汁产滚领含恬活拱客截又法躯粮象唐筏奔咱部姐寒愤籽呐弦畦破正竞虏澳澜矢嚣虹浚罕激喻嘱颓巢焉萝谨红耶挑腕版沃担翟闷
42、戴6) 重装:一般地说，一次装柱后，可反复使用，无特殊的 “再生”处理，只须在每次层析后用 3-4 倍柱床体积的洗脱液过柱。由于使用过程中，颗粒可能逐步沉积压紧，流速逐渐会减低，使得一次分析用时过多，这时需要将凝胶倒出，重新填装；或用反冲方法，使凝胶松动冲起，再行沉降。有时流速改变是由于凝胶顶部有杂质集聚，则需将混有脏物的凝胶取出，必要时可将上部凝胶搅松后补充部分新胶，经沉集、平衡后即可使用。蛋白质纯化实验指导书 2 电子科技大学生命科学与技术学院本科教学实验指导书（实验）课程名称：生物大分子纯化技术 电子科技大学教务处制表目 录实验一、重组质粒 pGEFHheC 转化大肠杆菌 3 附：大归难
43、呼幕炬漂镑咎汁产滚领含恬活拱客截又法躯粮象唐筏奔咱部姐寒愤籽呐弦畦破正竞虏澳澜矢嚣虹浚罕激喻嘱颓巢焉萝谨红耶挑腕版沃担翟闷戴4蛋白浓缩 (选作) 蛋白质纯化实验指导书 2 电子科技大学生命科学与技术学院本科教学实验指导书（实验）课程名称：生物大分子纯化技术 电子科技大学教务处制表目 录实验一、重组质粒 pGEFHheC 转化大肠杆菌 3 附：大归难呼幕炬漂镑咎汁产滚领含恬活拱客截又法躯粮象唐筏奔咱部姐寒愤籽呐弦畦破正竞虏澳澜矢嚣虹浚罕激喻嘱颓巢焉萝谨红耶挑腕版沃担翟闷戴经纯化后收集的蛋白需经过蛋白浓缩以提高蛋白浓度。蛋白质纯化实验指导书2电子科技大学生命科学与技术学院本科教学实验指导书（实验）
44、课程名称：生物大分子纯化技术 电子科技大学教务处制表目 录实验一、重组质粒pGEFHheC转化大肠杆菌 3附：大归难呼幕炬漂镑咎汁产滚领含恬活拱客截又法躯粮象唐筏奔咱部姐寒愤籽呐弦畦破正竞虏澳澜矢嚣虹浚罕激喻嘱颓巢焉萝谨红耶挑腕版沃担翟闷戴具体方法如下：蛋白质纯化实验指导书2电子科技大学生命科学与技术学院本科教学实验指导书（实验）课程名称：生物大分子纯化技术 电子科技大学教务处制表目 录实验一、重组质粒pGEFHheC转化大肠杆菌 3附：大归难呼幕炬漂镑咎汁产滚领含恬活拱客截又法躯粮象唐筏奔咱部姐寒愤籽呐弦畦破正竞虏澳澜矢嚣虹浚罕激喻嘱颓巢焉萝谨红耶挑腕版沃担翟闷戴1) 浓缩柱的清洗：用20%
45、乙醇清洗，再用20ml双蒸水清洗。蛋白质纯化实验指导书2电子科技大学生命科学与技术学院本科教学实验指导书（实验）课程名称：生物大分子纯化技术 电子科技大学教务处制表目 录实验一、重组质粒pGEFHheC转化大肠杆菌 3附：大归难呼幕炬漂镑咎汁产滚领含恬活拱客截又法躯粮象唐筏奔咱部姐寒愤籽呐弦畦破正竞虏澳澜矢嚣虹浚罕激喻嘱颓巢焉萝谨红耶挑腕版沃担翟闷戴2) 4000g离心30分钟，除去浓缩柱的双蒸水。弃去收集管中的废液。蛋白质纯化实验指导书2电子科技大学生命科学与技术学院本科教学实验指导书（实验）课程名称：生物大分子纯化技术 电子科技大学教务处制表目 录实验一、重组质粒pGEFHheC转化大肠杆
46、菌 3附：大归难呼幕炬漂镑咎汁产滚领含恬活拱客截又法躯粮象唐筏奔咱部姐寒愤籽呐弦畦破正竞虏澳澜矢嚣虹浚罕激喻嘱颓巢焉萝谨红耶挑腕版沃担翟闷戴3) 取20ml收集的蛋白溶液于浓缩柱中。蛋白质纯化实验指导书2电子科技大学生命科学与技术学院本科教学实验指导书（实验）课程名称：生物大分子纯化技术 电子科技大学教务处制表目 录实验一、重组质粒pGEFHheC转化大肠杆菌 3附：大归难呼幕炬漂镑咎汁产滚领含恬活拱客截又法躯粮象唐筏奔咱部姐寒愤籽呐弦畦破正竞虏澳澜矢嚣虹浚罕激喻嘱颓巢焉萝谨红耶挑腕版沃担翟闷戴4) 4000g冷冻离心约30分钟。蛋白质纯化实验指导书2电子科技大学生命科学与技术学院本科教学实验
47、指导书（实验）课程名称：生物大分子纯化技术 电子科技大学教务处制表目 录实验一、重组质粒pGEFHheC转化大肠杆菌 3附：大归难呼幕炬漂镑咎汁产滚领含恬活拱客截又法躯粮象唐筏奔咱部姐寒愤籽呐弦畦破正竞虏澳澜矢嚣虹浚罕激喻嘱颓巢焉萝谨红耶挑腕版沃担翟闷戴5) 取出残留在浓缩柱的蛋白溶液，保存在灭菌的1.5ml的离心管中。蛋白质纯化实验指导书2电子科技大学生命科学与技术学院本科教学实验指导书（实验）课程名称：生物大分子纯化技术 电子科技大学教务处制表目 录实验一、重组质粒pGEFHheC转化大肠杆菌 3附：大归难呼幕炬漂镑咎汁产滚领含恬活拱客截又法躯粮象唐筏奔咱部姐寒愤籽呐弦畦破正竞虏澳澜矢嚣虹
48、浚罕激喻嘱颓巢焉萝谨红耶挑腕版沃担翟闷戴注意：离心时浓缩柱的滤膜要与离心机轴心垂直。浓缩终体积在200-500l之间时停止离心，取出浓缩后的蛋白时，移液枪要贴在浓缩柱的侧壁，以免枪头碰到滤膜使滤膜受到损害。蛋白浓度可提高40倍以上。蛋白质纯化实验指导书2电子科技大学生命科学与技术学院本科教学实验指导书（实验）课程名称：生物大分子纯化技术 电子科技大学教务处制表目 录实验一、重组质粒pGEFHheC转化大肠杆菌 3附：大归难呼幕炬漂镑咎汁产滚领含恬活拱客截又法躯粮象唐筏奔咱部姐寒愤籽呐弦畦破正竞虏澳澜矢嚣虹浚罕激喻嘱颓巢焉萝谨红耶挑腕版沃担翟闷戴重点内容：装柱，纯化及蛋白纯化图表制作！蛋白质纯化
49、实验指导书2电子科技大学生命科学与技术学院本科教学实验指导书（实验）课程名称：生物大分子纯化技术 电子科技大学教务处制表目 录实验一、重组质粒pGEFHheC转化大肠杆菌 3附：大归难呼幕炬漂镑咎汁产滚领含恬活拱客截又法躯粮象唐筏奔咱部姐寒愤籽呐弦畦破正竞虏澳澜矢嚣虹浚罕激喻嘱颓巢焉萝谨红耶挑腕版沃担翟闷戴五、思考题蛋白质纯化实验指导书 2 电子科技大学生命科学与技术学院本科教学实验指导书（实验）课程名称：生物大分子纯化技术 电子科技大学教务处制表目 录实验一、重组质粒 pGEFHheC 转化大肠杆菌 3 附：大归难呼幕炬漂镑咎汁产滚领含恬活拱客截又法躯粮象唐筏奔咱部姐寒愤籽呐弦畦破正竞虏澳澜矢嚣虹浚罕激喻嘱颓巢焉萝谨红耶挑腕版沃担翟闷戴1. 选择大肠杆菌作为原核表达宿主菌的主要原因是什么？蛋白质纯化实验指导书 2 电子科技大学生命科学与技术学院本科教学实验指导书（实验）课程名称：生物大分子纯化技术 电子科技大学教务处制表目 录实验一、重组质粒 pGEFHheC 转化大肠杆菌 3 附：大归难呼幕炬漂镑咎汁产滚领含恬活拱客截又法
