1、细菌耐药表型的检测方法,细菌耐药表型的检测,一、-内酰胺酶的检测 （1）头孢硝基噻吩显色法（Nitrocefin）：制配纸片灭菌水湿润涂测试菌于纸片上，10min观察纸片颜色，显红色为阳性（葡萄球菌应放置1h内观察）。 （2）酸度法：青霉素-内酰胺酶水解青霉酸、pH6.8以下酚红指示剂由红色（构橼酸钠缓冲液pH8.5）变为黄色。 （3）碘测定法：-内酰胺酶破坏-内酰胺环，碘与破坏后的-内酰胺结合，使兰色的淀粉碘复合物转变成无色。 （4）仪器测定法：Vitek、Microscan的药物测试卡中均带有检酶功能。,二、ESBLS检测 （1）纸片扩散初筛：头孢他啶（30g/片）抑菌圈22mm头孢噻肟（
2、30g/片）抑菌圈27mm头孢曲松（30g/片）抑菌圈25mm氨曲南（30g/片）抑菌圈27mm （2）肉汤稀释法：上述药物MIC2g/ml可疑为ESBLS。（表型确证试验：对2个任何一个药物MIC，在加克位维酸比不加克拉维酸的MIC值降低3个以上对倍稀释度判为ESBLS）。,（3）双纸片协同确认试验： 头孢他啶（30g/片）与头孢他啶（30g）/克位维酸（10g） 头孢噻肟（30g/片）与头孢噻肟（30g）/克拉维酸（10g）两纸片抑菌圈相比5mm即为ESBLS。 （4）E-test法（浓度梯度法）：由瑞典AB Biodisk公司研究生产，广洲贝肯公司经销。试条中的三代头孢菌素或氨曲南的MI
3、C2g/ml即可疑为ESBLS。,（5）仪器测定法：Vitek,microscan和BD-PHOEMXTM微生物分析仪均可测试ESBLS。 （6）利用分子生物学技术（PCR、DNA探针等）及分析酶底物谱及抑制物谱、生物化学技术等检测技术可对ESBLS做出确诊。,三、Ampc酶检测 1.初筛： （1）头孢西汀（30g/片）与头孢西汀（30g）/邻氯西林（200g）。后者比前者的抑菌圈5mm即疑为Ampc。 （2）5种纸片筛选：马斯平、泰能、头孢西汀、头孢他啶与头孢他啶/克拉维酸。如头孢西汀18mm，对马斯平、泰能敏感即疑为产Ampc，如头孢他啶与其酶抑制剂的抑菌圈5mm可能产ESBLS。 2.确
4、认试验（头孢西汀三维水相试验法）,AmpC酶新的检测方法,3.三维水相试验方法的改进 （1）将标准菌株ATCC 25922按常规药敏纸片K-B法操作均匀涂布于M-H平板上。 （2）在M-H平板中心贴一片头孢西汀(30ug/片) 纸片，在距纸片边缘1cm处，用无菌手术刀片切3cm长度的小槽，将待测菌株的6个菌落接种于槽内(勿溢出槽外)，35孵育18-24h。 （3）结果观察：若抑菌圈向内凹陷，即AmpC酶阳性。 三维水相试验方法的改进(M-H平板打孔2mm扩散法).,AmpC酶新的检测方法,4.质粒型AmpC酶三联纸片方法的检测 （1）将标准菌株ATCC 25922按常规药敏纸片K-B法操作均匀
5、涂布于M-H平板上。 （2）在M-H平板中心贴一片头孢西汀(30ug/片) 纸片，在纸片边缘贴有待测菌的纸片（纸片上含20ul， PH8.0，1M Tris-0.1MEDTA）。 （3）另一侧边缘贴有产AmpC酶菌的纸片（同上）。 （4）35孵育18-24h，如待检菌出现扁平或凹陷的抑菌环为阳性。,四、金属-内酰胺酶的表型检测方法,1.头孢他啶+2-巯基丙酸法(CAZ+NCA) （1）将待测菌株按常规药敏纸片K-B法操作均匀涂布于M-H平板上。 （2）在M-H平板上分别贴两片头孢他啶(30ug/片)纸片，纸片中心相距2.5cm,将其中一片头孢他啶纸片上加3ul 2-巯基丙酸，35孵育18-24
6、h。 （3）结果观察：若加有2-巯基乙酸的头孢他啶纸片抑菌圈大于单个头孢他啶的抑菌圈（4mm），则为阳性，即产金属-内酰胺酶。,金属-内酰胺酶的表型检测方法,2.亚胺培南+EDTA法(IMP+EDTA) （1）将待测菌株按常规药敏纸片K-B法操作均匀涂布于M-H平板上。 （2）在M-H平板上贴一片亚胺培南(10ug/片) 纸片，在距亚胺培南纸片中心1.5cm处贴无菌空白纸片一片，将0.5M EDTA 10ul 均匀浸注于空白纸片上，35孵育18-24h。 （3）结果观察：若两片纸片抑菌圈有协同作用，则为阳性，即产金属-内酰胺酶。,五、肠杆菌科碳青霉烯霉筛选和确证 （2009年CLSI:M100
7、-S19.APPB.124）,1.如果菌株对碳青霉烯类药物表现为“I”或“R”没必要再去检验该酶，（医生通常不会选用“I”或“R”的药物），但主要以感染控制为目的检验该酶。 2.什么是碳青霉烯酶？ 一类能水解或灭活碳青霉烯类抗生素的酶，如：KPC（肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶）. 碳青霉烯类抗生素 Doripenem（目前无CLSI折点） 厄他培南 亚胺培南 美洛培南,3.肠杆菌科碳青霉烯敏感及碳青霉烯酶筛选的折点,亚胺培南不用于变形/普罗威登/摩根菌属中碳青霉烯酶的筛选。因为这些菌属会产生非碳青霉烯酶导致的亚胺培南MIC升高。 NA：不可用（本试验不适用于筛查）,4.什么时候做改良Hodge试验？
8、 如果头孢噻肟、头孢他啶和 /或头孢曲松全部“R”。 注：头孢比肟对于碳青霉烯酶产生株的结果是不稳定的。 MIC（g/ml) 抑菌圈(mm)厄他培南 2 19-21亚胺培南 2-4 NA 美洛培南 2-4 16-21 5.做改良的Hodge试验（确证试验） （1）ATCC25922配成0.5麦氏浊度，1：10稀释。 （2）用棉签满涂布于MH平板上，就像纸片扩散法药敏试验一样，在中心加一张厄他培南或美洛培南（最好）纸片。 （3）取待测菌（13号）从纸片边缘向外划（用1l接种环）。 （4）35培养过夜后，观察结果。 （5）大肠沿着菌株划线的生长表明碳青霉烯水解酶的产生。,6.改良的Hodge试验：
9、检测碳青霉烯酶活性的表型试验，在检测KPC方面有90的敏感性/特异性，检测其他碳青霉烯酶时敏感性/特异性不定（如：低水平的金属酶）。 7. 改良Hodge试验的质量控制(2009年CLSI:M100-S19.APPB.124)： 随患者菌株每天检测。 （1）改良Hodge试验阳性菌株: 肺克ATCC BAA-1705 （2） 改良Hodge试验阴性菌株：肺克ATCC BAA-1706,六、D-Test试验,（1）将待检菌按常规药敏纸片K-B法操作均匀涂布于M-H平板上。 （2）在M-H平上板贴一片红霉素 (15ug/片) 纸片，在距纸片边缘1.5cm处贴克林霉素 (2ug/片) 纸片。 （3）
10、35孵育18-24h，如克林霉素出现扁平或凹陷的抑菌环为阳性。,D-Test试验耐药表型判断,耐药机制 红霉素 克林霉素 基因型 泵出(MS) R S MSRA 核糖体基因诱导变异 (iMls) R D-Test(+) （ermC为主） 核糖体基因结构变异 (cMLS) R R （ermA为主） ,七、其它耐药表型检测,1.MRSA，MRCNS 2.VRE 3.PRP 4.泵出机制：美平/泰能（MIC）1,附：鉴定卡他球菌方法,1.40%KNO3浸湿滤纸条，贴于羊(马)血平板上，周围点种待测菌，如果菌落周围出现大的绿色环 ，即为阳性。 2.丁酸酯酶检测法：购买丁酸酯酶检测纸片(梅里埃公司生产)，涂细菌于纸片上，如几分钟内出现绿色为阳性。,
