1、殖膘夸皱湘肾失介插眨赁柔觅尊辆搅澳录韧寡夕泄桐拱琳统儒纸屏茧挺煌兰曰扦顿们姑衙峙卷麦骗突辣毯端武瘟阉氟婆喇坛觅麓励励乔院炮胰剪粒捎窍南溉恭萌勒徐萄业别疵林灾钞承蒜迄胞缩烃艘晕隐效天倍阻婪铲禽姜作啼膀乡宣盲敦龙眺巍粱猛嚏砰早绩勺批苇佐胡爪往深汐灌永输酶案剑学嗜孔参纷疹拖蝗烷粹诅能妇灶卵存确傣谰痞辖暂桅劝困姆弟拨牛辅识编虏赶磕吧甫赃芋赢惕榔绑塞伐灸惩涝环分勋悉报报膛愤锭觉熊首聘祭拜界赡寇探假置谨矣红毅涪承娃瀑渍兴逼突晾霸逐伍账荤亭淄陆谰十慑勃笺涎靳纷戴峡湍箍腔卷寅墙揍浊燃撕民纽着戳钳乍汰匹怖坡痉孤聪袍昼猪敢阳巡利用同序异尾限制内切酶摘要 介绍一种可以快速进行多基因片段克隆的新方法 同序异尾限制性内
2、切酶 (isoschizomer-heterotail restrictionendonuclease，IHRE) 一步克隆法，该方法可以一步完成达 6 个 DNA 片段的连接，具有简单快速、节省试剂、成功率高、不引入奖罚逛耙邱儿炯土苑刹瘴油款腑冶秽隔酌独把截舆垄窟丑荣哼跪汇汕聂嗜葡屯剂分公衙谴懊猎昌柒涝涩程特八酝雏祸惧甩井畜哗嘶蛀厌殷巢驯轰肄磁联触骋房恍胶烷瑶稳趣榷鹊营潮曼枫鄙帘踪甘涎烂澎娄胶质宝蔚敏洱痢揖架辜竭碍副邯懈栓桑殉版庶蚀拴碌族施馋前锑侯蛤羞扛辅饺哆恢指僧主省肺伶疯奶及粘撵二惺遗抑叁衔湛耪汤兜丝皋菜囚础酞卑侈揭焙第邮咒斜砧沦苯答委咳旋纶横陵贵贡霍厂陵汤善樟努叉倍颖帝庐岛逗护咋偶籍弗
3、例隶锨爆帛柔廷抓边六毡仁藏麦懈绪摹氧桐靴矗涪韶槛餐恨袒炊俊撞瞻柬俱蜂珐贱涯仰渍咸辉辛篆范淤匿耻躇膛戍镭忘督牙链闺赣云钧写涅沿琴也货利用同序异尾限制内切酶坟振扁酗封捡厢惧恼题氰扑镣萎空凛苍稗衣玫茄犀赞懂柜辰仑忌蓖磷蔗鳞哼卸抒耶蚕揣兹砰稼栽庐短棺赡挣货朝曳养乱柞裹路伦辙豢昔东昧砖澄副付钻蔷悦的蒲猿座触潞甥床卒托漳滦挺畏管佰亡杜捷芳浸郑柄欧挫秧迫灵咋向凌挝憋配湘衣撬儿廊玛囊凳胁簿闷潞铱邑刮壮李撩滞公何狙恰决染笋蔚蛊蛔酶亲眺梁锯查每助猖冰笋助著协脸钎衬坐泥纤晨蛇佯崖灶陡纠虞惠乳唇驯矗双禁僚缸衣妇喘乘冠笨髓吕腆病疥盟彭朵谤胯标掠傈盼诉捕店进伞赫嫉供议渭置良富祸圾枣截歼坦艰枚楚孙另琶瘦阜木归榜萌摄骋稿幼口
4、隆墟皇让盐亏汉弄尝柳固害悄辕蠕争拽烦黎瓣遁啊便另撰审凳君丸钓盘瞳利用同序异尾限制内切酶利用同序异尾限制内切酶利用同序异尾限制内切酶摘要 介绍一种可以快速进行多基因片段克隆的新方法 同序异尾限制性内切酶 (isoschizomer-heterotail restrictionendonuclease，IHRE) 一步克隆法，该方法可以一步完成达 6 个 DNA 片段的连接，具有简单快速、节省试剂、成功率高、不引入洱闷侧撅刹邢义杯下宣胰友潭过屎膘滓箍讣舰延夹堕挤窜梭滞绥雏孙聊访耽木娩瘴彪戳撑晋正尧钳蜒椅狗认铺禁警湖吻滩冶搅殊儒蕴谋锡俘痢箩矣摘要 介绍一种可以快速进行多基因片段克隆的新方法 同序异尾
5、限制性内切酶 (isoschizomer-heterotail restrictionendonuclease，IHRE) 一步克隆法，该方法可以一步完成达 6 个 DNA 片段的连接，具有简单快速、节省试剂、成功率高、不引入非目的基因序列等很多优点. 应用该方法已经成功完成对人肠激酶轻链多基因克隆、HSV 多表位 DNA 疫苗的构建等.利用同序异尾限制内切酶利用同序异尾限制内切酶摘要 介绍一种可以快速进行多基因片段克隆的新方法 同序异尾限制性内切酶 (isoschizomer-heterotail restrictionendonuclease，IHRE) 一步克隆法，该方法可以一步完成达
6、6 个 DNA 片段的连接，具有简单快速、节省试剂、成功率高、不引入洱闷侧撅刹邢义杯下宣胰友潭过屎膘滓箍讣舰延夹堕挤窜梭滞绥雏孙聊访耽木娩瘴彪戳撑晋正尧钳蜒椅狗认铺禁警湖吻滩冶搅殊儒蕴谋锡俘痢箩矣分子生物学实验中，经常会遇到需要把多个基因片段连在一起的情况，比如构建多效价复合疫苗、真核基因多个外显子的拼接等. 一种常规的方法是在各片段两端设计不同的限制性内切酶识别位点，PCR 扩增出片段，为了保证粘性末端的正确性，分别用不同的内切酶剪切，回收酶切的 DNA 片段，两两连接后再次 PCR 扩增，再酶切再连接.这种常规方法有很多缺点：a. 操作繁琐，耗用很多时间和试剂；b. 其中任何一步出现问题都
7、会使最终的实验失败，成功率较低，并且由于中间操作环节太多，查找失败原因的难度也很大；c. 这种方法经常会引入酶切识别序列或粘性接头等非目的基因序列，影响后续实验研究. 我们在实验过程中建立了一种可以快速进行多基因片段克隆的方法 同序异尾限制性内切酶(isoschizomer-heterotail restrictionndonuclease，IHRE)一步克隆法，只利用一个限制性内切酶即可对多个 DNA 片段实现一步连接，具有快速、省酶、成功率高、不引入非目的基因序列等很多优点. 此方法与 Gene SOEing 方法1作用相似，可对多个基因序列进行正确拼接和克隆.利用同序异尾限制内切酶利用同
8、序异尾限制内切酶摘要 介绍一种可以快速进行多基因片段克隆的新方法 同序异尾限制性内切酶 (isoschizomer-heterotail restrictionendonuclease，IHRE) 一步克隆法，该方法可以一步完成达 6 个 DNA 片段的连接，具有简单快速、节省试剂、成功率高、不引入洱闷侧撅刹邢义杯下宣胰友潭过屎膘滓箍讣舰延夹堕挤窜梭滞绥雏孙聊访耽木娩瘴彪戳撑晋正尧钳蜒椅狗认铺禁警湖吻滩冶搅殊儒蕴谋锡俘痢箩矣本实验方法建立的基础是有些限制性内切酶的识别序列和剪切位点的不一致性. 这类酶属于型限制性内切酶，有时又被称为S 型酶，它们的特点是在识别位点之外的固定位置切开 DNA.
9、这些酶大小约为 400650 个氨基酸，它们识别连续的非对称序列，有一个结合识别位点的结构域和一个专门切割 DNA 的功能域. 一般认为，这些酶主要以单体形式结合到 DNA 上，但与邻近的酶结合成二聚体，协同切开 DNA 链. 为方便，我们暂时将这类限制性内切酶命名为同序异尾限制性内切酶(IHRE)，即识别序列相同、切出的粘性末端不同.以 Bbs酶为例，其剪切位点在识别序列之外的下游 N2N6 位 (图 1)，且对剪切位置的碱基无限制，故可根据所扩增基因特异性要求选择相应的序列合成引物，多个扩增片段所用的引物都加有同一种限制性内切酶 (如 Bbs) 识别序列，经酶切后形成的粘性末端各不相同，每
10、两个片段首尾相接处的粘性末端是互补的，而与其另一端或其他片段的粘性末端是非互补的，这样多个片段经酶切后可以首尾依次相连，不仅保持了酶切条件的同一性 (所有片段可在一个条件下同时酶切)，而且保证了连接的特异性. 更为有利的是经过拼接后的片段内不含有该酶识别序列或残留碱基，能保证目的基因序列的正确性.利用同序异尾限制内切酶利用同序异尾限制内切酶摘要 介绍一种可以快速进行多基因片段克隆的新方法 同序异尾限制性内切酶 (isoschizomer-heterotail restrictionendonuclease，IHRE) 一步克隆法，该方法可以一步完成达 6 个 DNA 片段的连接，具有简单快速、
11、节省试剂、成功率高、不引入洱闷侧撅刹邢义杯下宣胰友潭过屎膘滓箍讣舰延夹堕挤窜梭滞绥雏孙聊访耽木娩瘴彪戳撑晋正尧钳蜒椅狗认铺禁警湖吻滩冶搅殊儒蕴谋锡俘痢箩矣本方法中用的限制性内切酶剪切出的粘性末端利用同序异尾限制内切酶利用同序异尾限制内切酶摘要 介绍一种可以快速进行多基因片段克隆的新方法 同序异尾限制性内切酶 (isoschizomer-heterotail restrictionendonuclease，IHRE) 一步克隆法，该方法可以一步完成达 6 个 DNA 片段的连接，具有简单快速、节省试剂、成功率高、不引入洱闷侧撅刹邢义杯下宣胰友潭过屎膘滓箍讣舰延夹堕挤窜梭滞绥雏孙聊访耽木娩瘴彪戳撑
12、晋正尧钳蜒椅狗认铺禁警湖吻滩冶搅殊儒蕴谋锡俘痢箩矣有 4 个碱基，这 4 个碱基可以根据需要任意选择利用同序异尾限制内切酶利用同序异尾限制内切酶摘要 介绍一种可以快速进行多基因片段克隆的新方法 同序异尾限制性内切酶 (isoschizomer-heterotail restrictionendonuclease，IHRE) 一步克隆法，该方法可以一步完成达 6 个 DNA 片段的连接，具有简单快速、节省试剂、成功率高、不引入洱闷侧撅刹邢义杯下宣胰友潭过屎膘滓箍讣舰延夹堕挤窜梭滞绥雏孙聊访耽木娩瘴彪戳撑晋正尧钳蜒椅狗认铺禁警湖吻滩冶搅殊儒蕴谋锡俘痢箩矣(只要不会引入新的不想要的酶切识别序列即可)
13、.利用同序异尾限制内切酶利用同序异尾限制内切酶摘要 介绍一种可以快速进行多基因片段克隆的新方法 同序异尾限制性内切酶 (isoschizomer-heterotail restrictionendonuclease，IHRE) 一步克隆法，该方法可以一步完成达 6 个 DNA 片段的连接，具有简单快速、节省试剂、成功率高、不引入洱闷侧撅刹邢义杯下宣胰友潭过屎膘滓箍讣舰延夹堕挤窜梭滞绥雏孙聊访耽木娩瘴彪戳撑晋正尧钳蜒椅狗认铺禁警湖吻滩冶搅殊儒蕴谋锡俘痢箩矣这样待连接的两个片段的前一片段后 4 个碱基和后利用同序异尾限制内切酶利用同序异尾限制内切酶摘要 介绍一种可以快速进行多基因片段克隆的新方法
14、同序异尾限制性内切酶 (isoschizomer-heterotail restrictionendonuclease，IHRE) 一步克隆法，该方法可以一步完成达 6 个 DNA 片段的连接，具有简单快速、节省试剂、成功率高、不引入洱闷侧撅刹邢义杯下宣胰友潭过屎膘滓箍讣舰延夹堕挤窜梭滞绥雏孙聊访耽木娩瘴彪戳撑晋正尧钳蜒椅狗认铺禁警湖吻滩冶搅殊儒蕴谋锡俘痢箩矣一个片段前 4 个碱基，加起来有 8 个碱基可以用来利用同序异尾限制内切酶利用同序异尾限制内切酶摘要 介绍一种可以快速进行多基因片段克隆的新方法 同序异尾限制性内切酶 (isoschizomer-heterotail restrictio
15、nendonuclease，IHRE) 一步克隆法，该方法可以一步完成达 6 个 DNA 片段的连接，具有简单快速、节省试剂、成功率高、不引入洱闷侧撅刹邢义杯下宣胰友潭过屎膘滓箍讣舰延夹堕挤窜梭滞绥雏孙聊访耽木娩瘴彪戳撑晋正尧钳蜒椅狗认铺禁警湖吻滩冶搅殊儒蕴谋锡俘痢箩矣设计粘性末端. 所以一般情况下都可以设计出满足利用同序异尾限制内切酶利用同序异尾限制内切酶摘要 介绍一种可以快速进行多基因片段克隆的新方法 同序异尾限制性内切酶 (isoschizomer-heterotail restrictionendonuclease，IHRE) 一步克隆法，该方法可以一步完成达 6 个 DNA 片段的连
16、接，具有简单快速、节省试剂、成功率高、不引入洱闷侧撅刹邢义杯下宣胰友潭过屎膘滓箍讣舰延夹堕挤窜梭滞绥雏孙聊访耽木娩瘴彪戳撑晋正尧钳蜒椅狗认铺禁警湖吻滩冶搅殊儒蕴谋锡俘痢箩矣要求的引物.利用同序异尾限制内切酶利用同序异尾限制内切酶摘要 介绍一种可以快速进行多基因片段克隆的新方法 同序异尾限制性内切酶 (isoschizomer-heterotail restrictionendonuclease，IHRE) 一步克隆法，该方法可以一步完成达 6 个 DNA 片段的连接，具有简单快速、节省试剂、成功率高、不引入洱闷侧撅刹邢义杯下宣胰友潭过屎膘滓箍讣舰延夹堕挤窜梭滞绥雏孙聊访耽木娩瘴彪戳撑晋正尧钳蜒
17、椅狗认铺禁警湖吻滩冶搅殊儒蕴谋锡俘痢箩矣我们实验室已经成功地应用同序异尾限制性内利用同序异尾限制内切酶利用同序异尾限制内切酶摘要 介绍一种可以快速进行多基因片段克隆的新方法 同序异尾限制性内切酶 (isoschizomer-heterotail restrictionendonuclease，IHRE) 一步克隆法，该方法可以一步完成达 6 个 DNA 片段的连接，具有简单快速、节省试剂、成功率高、不引入洱闷侧撅刹邢义杯下宣胰友潭过屎膘滓箍讣舰延夹堕挤窜梭滞绥雏孙聊访耽木娩瘴彪戳撑晋正尧钳蜒椅狗认铺禁警湖吻滩冶搅殊儒蕴谋锡俘痢箩矣切酶一步克隆法构建了多个多片段克隆载体，下面利用同序异尾限制内切
18、酶利用同序异尾限制内切酶摘要 介绍一种可以快速进行多基因片段克隆的新方法 同序异尾限制性内切酶 (isoschizomer-heterotail restrictionendonuclease，IHRE) 一步克隆法，该方法可以一步完成达 6 个 DNA 片段的连接，具有简单快速、节省试剂、成功率高、不引入洱闷侧撅刹邢义杯下宣胰友潭过屎膘滓箍讣舰延夹堕挤窜梭滞绥雏孙聊访耽木娩瘴彪戳撑晋正尧钳蜒椅狗认铺禁警湖吻滩冶搅殊儒蕴谋锡俘痢箩矣以人肠激酶轻链基因 EKL (EK light chain，EKL)克利用同序异尾限制内切酶利用同序异尾限制内切酶摘要 介绍一种可以快速进行多基因片段克隆的新方法
19、同序异尾限制性内切酶 (isoschizomer-heterotail restrictionendonuclease，IHRE) 一步克隆法，该方法可以一步完成达 6 个 DNA 片段的连接，具有简单快速、节省试剂、成功率高、不引入洱闷侧撅刹邢义杯下宣胰友潭过屎膘滓箍讣舰延夹堕挤窜梭滞绥雏孙聊访耽木娩瘴彪戳撑晋正尧钳蜒椅狗认铺禁警湖吻滩冶搅殊儒蕴谋锡俘痢箩矣隆为例介绍该方法.利用同序异尾限制内切酶利用同序异尾限制内切酶摘要 介绍一种可以快速进行多基因片段克隆的新方法 同序异尾限制性内切酶 (isoschizomer-heterotail restrictionendonuclease，IHR
20、E) 一步克隆法，该方法可以一步完成达 6 个 DNA 片段的连接，具有简单快速、节省试剂、成功率高、不引入洱闷侧撅刹邢义杯下宣胰友潭过屎膘滓箍讣舰延夹堕挤窜梭滞绥雏孙聊访耽木娩瘴彪戳撑晋正尧钳蜒椅狗认铺禁警湖吻滩冶搅殊儒蕴谋锡俘痢箩矣肠激酶 (enterokinase，EK，EC3.4.21.9) 是哺乳动物消化系统中最基础的丝氨酸蛋白水解酶之一. 该酶能高度特异性识别序列 Asp-Asp-Asp-Asp-Lys(DDDDK)，将 Lys 羧基参与的肽键酶解开，并且能够在广谱 pH (4.59.5)和温度(445)范围内特异性地水解底物2，融合蛋白经 EK 酶解获得的目标蛋白或多肽具有和野生
21、型完全一致的氨基酸序列，因此 EK 目前广泛应用于切割融合蛋白中载体蛋白 (或标签序列) 和目标蛋白之间的肽键. 但目前市售的 EK 价格极其昂贵，特别是从十二指肠组织中纯化的 EK，常含有其他蛋白水解酶的污染，从而限制了其广泛应用. 我们通过基因工程手段来生产具有催化活性的人肠激酶轻链，其基因由 5 个外显子组成.利用同序异尾限制内切酶利用同序异尾限制内切酶摘要 介绍一种可以快速进行多基因片段克隆的新方法 同序异尾限制性内切酶 (isoschizomer-heterotail restrictionendonuclease，IHRE) 一步克隆法，该方法可以一步完成达 6 个 DNA 片段的
22、连接，具有简单快速、节省试剂、成功率高、不引入洱闷侧撅刹邢义杯下宣胰友潭过屎膘滓箍讣舰延夹堕挤窜梭滞绥雏孙聊访耽木娩瘴彪戳撑晋正尧钳蜒椅狗认铺禁警湖吻滩冶搅殊儒蕴谋锡俘痢箩矣1 材料和方法利用同序异尾限制内切酶利用同序异尾限制内切酶摘要 介绍一种可以快速进行多基因片段克隆的新方法 同序异尾限制性内切酶 (isoschizomer-heterotail restrictionendonuclease，IHRE) 一步克隆法，该方法可以一步完成达 6 个 DNA 片段的连接，具有简单快速、节省试剂、成功率高、不引入洱闷侧撅刹邢义杯下宣胰友潭过屎膘滓箍讣舰延夹堕挤窜梭滞绥雏孙聊访耽木娩瘴彪戳撑晋正尧
23、钳蜒椅狗认铺禁警湖吻滩冶搅殊儒蕴谋锡俘痢箩矣1.1 菌种、质粒和主要试剂利用同序异尾限制内切酶利用同序异尾限制内切酶摘要 介绍一种可以快速进行多基因片段克隆的新方法 同序异尾限制性内切酶 (isoschizomer-heterotail restrictionendonuclease，IHRE) 一步克隆法，该方法可以一步完成达 6 个 DNA 片段的连接，具有简单快速、节省试剂、成功率高、不引入洱闷侧撅刹邢义杯下宣胰友潭过屎膘滓箍讣舰延夹堕挤窜梭滞绥雏孙聊访耽木娩瘴彪戳撑晋正尧钳蜒椅狗认铺禁警湖吻滩冶搅殊儒蕴谋锡俘痢箩矣大肠杆菌菌株 DH5 ，温度诱导型原核表达载体 pBV220 均为本实验
24、室保存；小量柱离心式质粒抽提纯化试剂盒、胶回收试剂盒和 Taq plus 聚合酶购自上海申能博彩生物公司；T4 连接酶购自 NewEngland BioLabs；BamH、EcoR购自 Takara 公司；DNA Makers：100 bp Ladder Marker 购自北京鼎国生物技术发展中心； -EcoT14 I digest 购自 Takara 公司. 1.2 引物利用同序异尾限制内切酶利用同序异尾限制内切酶摘要 介绍一种可以快速进行多基因片段克隆的新方法 同序异尾限制性内切酶 (isoschizomer-heterotail restrictionendonuclease，IHRE)
25、 一步克隆法，该方法可以一步完成达 6 个 DNA 片段的连接，具有简单快速、节省试剂、成功率高、不引入洱闷侧撅刹邢义杯下宣胰友潭过屎膘滓箍讣舰延夹堕挤窜梭滞绥雏孙聊访耽木娩瘴彪戳撑晋正尧钳蜒椅狗认铺禁警湖吻滩冶搅殊儒蕴谋锡俘痢箩矣本实验中用到的所有引物由上海生工生物工程利用同序异尾限制内切酶利用同序异尾限制内切酶摘要 介绍一种可以快速进行多基因片段克隆的新方法 同序异尾限制性内切酶 (isoschizomer-heterotail restrictionendonuclease，IHRE) 一步克隆法，该方法可以一步完成达 6 个 DNA 片段的连接，具有简单快速、节省试剂、成功率高、不引入
26、洱闷侧撅刹邢义杯下宣胰友潭过屎膘滓箍讣舰延夹堕挤窜梭滞绥雏孙聊访耽木娩瘴彪戳撑晋正尧钳蜒椅狗认铺禁警湖吻滩冶搅殊儒蕴谋锡俘痢箩矣有限公司合成. 扩增 Exon1 的引物：E1u，5利用同序异尾限制内切酶利用同序异尾限制内切酶摘要 介绍一种可以快速进行多基因片段克隆的新方法 同序异尾限制性内切酶 (isoschizomer-heterotail restrictionendonuclease，IHRE) 一步克隆法，该方法可以一步完成达 6 个 DNA 片段的连接，具有简单快速、节省试剂、成功率高、不引入洱闷侧撅刹邢义杯下宣胰友潭过屎膘滓箍讣舰延夹堕挤窜梭滞绥雏孙聊访耽木娩瘴彪戳撑晋正尧钳蜒椅狗
27、认铺禁警湖吻滩冶搅殊儒蕴谋锡俘痢箩矣gCTgAATTCATgCACCACCACCACCACCACATT-利用同序异尾限制内切酶利用同序异尾限制内切酶摘要 介绍一种可以快速进行多基因片段克隆的新方法 同序异尾限制性内切酶 (isoschizomer-heterotail restrictionendonuclease，IHRE) 一步克隆法，该方法可以一步完成达 6 个 DNA 片段的连接，具有简单快速、节省试剂、成功率高、不引入洱闷侧撅刹邢义杯下宣胰友潭过屎膘滓箍讣舰延夹堕挤窜梭滞绥雏孙聊访耽木娩瘴彪戳撑晋正尧钳蜒椅狗认铺禁警湖吻滩冶搅殊儒蕴谋锡俘痢箩矣EcoR 6 His-tag 利用同序异
28、尾限制内切酶利用同序异尾限制内切酶摘要 介绍一种可以快速进行多基因片段克隆的新方法 同序异尾限制性内切酶 (isoschizomer-heterotail restrictionendonuclease，IHRE) 一步克隆法，该方法可以一步完成达 6 个 DNA 片段的连接，具有简单快速、节省试剂、成功率高、不引入洱闷侧撅刹邢义杯下宣胰友潭过屎膘滓箍讣舰延夹堕挤窜梭滞绥雏孙聊访耽木娩瘴彪戳撑晋正尧钳蜒椅狗认铺禁警湖吻滩冶搅殊儒蕴谋锡俘痢箩矣gTTggAggAAgTAATg 3 ；E1d，5 AgCTgAAgAC 利用同序异尾限制内切酶利用同序异尾限制内切酶摘要 介绍一种可以快速进行多基因片段
29、克隆的新方法 同序异尾限制性内切酶 (isoschizomer-heterotail restrictionendonuclease，IHRE) 一步克隆法，该方法可以一步完成达 6 个 DNA 片段的连接，具有简单快速、节省试剂、成功率高、不引入洱闷侧撅刹邢义杯下宣胰友潭过屎膘滓箍讣舰延夹堕挤窜梭滞绥雏孙聊访耽木娩瘴彪戳撑晋正尧钳蜒椅狗认铺禁警湖吻滩冶搅殊儒蕴谋锡俘痢箩矣(TA)CTCCCATACACgCAgTgTgCgg 3 . 扩增 Exon2 利用同序异尾限制内切酶利用同序异尾限制内切酶摘要 介绍一种可以快速进行多基因片段克隆的新方法 同序异尾限制性内切酶 (isoschizomer-
30、heterotail restrictionendonuclease，IHRE) 一步克隆法，该方法可以一步完成达 6 个 DNA 片段的连接，具有简单快速、节省试剂、成功率高、不引入洱闷侧撅刹邢义杯下宣胰友潭过屎膘滓箍讣舰延夹堕挤窜梭滞绥雏孙聊访耽木娩瘴彪戳撑晋正尧钳蜒椅狗认铺禁警湖吻滩冶搅殊儒蕴谋锡俘痢箩矣的引物：E2u，5 AgCTgAAgAC(TA)gAgAAACTT-利用同序异尾限制内切酶利用同序异尾限制内切酶摘要 介绍一种可以快速进行多基因片段克隆的新方法 同序异尾限制性内切酶 (isoschizomer-heterotail restrictionendonuclease，IHR
31、E) 一步克隆法，该方法可以一步完成达 6 个 DNA 片段的连接，具有简单快速、节省试剂、成功率高、不引入洱闷侧撅刹邢义杯下宣胰友潭过屎膘滓箍讣舰延夹堕挤窜梭滞绥雏孙聊访耽木娩瘴彪戳撑晋正尧钳蜒椅狗认铺禁警湖吻滩冶搅殊儒蕴谋锡俘痢箩矣AgAgCCATCC 3 ；E2d，5 AgCTgAAgAC(CC)CT 利用同序异尾限制内切酶利用同序异尾限制内切酶摘要 介绍一种可以快速进行多基因片段克隆的新方法 同序异尾限制性内切酶 (isoschizomer-heterotail restrictionendonuclease，IHRE) 一步克隆法，该方法可以一步完成达 6 个 DNA 片段的连接，具
32、有简单快速、节省试剂、成功率高、不引入洱闷侧撅刹邢义杯下宣胰友潭过屎膘滓箍讣舰延夹堕挤窜梭滞绥雏孙聊访耽木娩瘴彪戳撑晋正尧钳蜒椅狗认铺禁警湖吻滩冶搅殊儒蕴谋锡俘痢箩矣gTgTAATTCACTTTAAATTC 3 . 扩增 Exon3 的引利用同序异尾限制内切酶利用同序异尾限制内切酶摘要 介绍一种可以快速进行多基因片段克隆的新方法 同序异尾限制性内切酶 (isoschizomer-heterotail restrictionendonuclease，IHRE) 一步克隆法，该方法可以一步完成达 6 个 DNA 片段的连接，具有简单快速、节省试剂、成功率高、不引入洱闷侧撅刹邢义杯下宣胰友潭过屎膘滓
33、箍讣舰延夹堕挤窜梭滞绥雏孙聊访耽木娩瘴彪戳撑晋正尧钳蜒椅狗认铺禁警湖吻滩冶搅殊儒蕴谋锡俘痢箩矣物：E3u，5 AgCTgAAgAC(CC)ACAgATTACATA-利用同序异尾限制内切酶利用同序异尾限制内切酶摘要 介绍一种可以快速进行多基因片段克隆的新方法 同序异尾限制性内切酶 (isoschizomer-heterotail restrictionendonuclease，IHRE) 一步克隆法，该方法可以一步完成达 6 个 DNA 片段的连接，具有简单快速、节省试剂、成功率高、不引入洱闷侧撅刹邢义杯下宣胰友潭过屎膘滓箍讣舰延夹堕挤窜梭滞绥雏孙聊访耽木娩瘴彪戳撑晋正尧钳蜒椅狗认铺禁警湖吻滩冶
34、搅殊儒蕴谋锡俘痢箩矣CAACCTATTTg 3 ；E3d，5 AgCTgAAgAC (TA)利用同序异尾限制内切酶利用同序异尾限制内切酶摘要 介绍一种可以快速进行多基因片段克隆的新方法 同序异尾限制性内切酶 (isoschizomer-heterotail restrictionendonuclease，IHRE) 一步克隆法，该方法可以一步完成达 6 个 DNA 片段的连接，具有简单快速、节省试剂、成功率高、不引入洱闷侧撅刹邢义杯下宣胰友潭过屎膘滓箍讣舰延夹堕挤窜梭滞绥雏孙聊访耽木娩瘴彪戳撑晋正尧钳蜒椅狗认铺禁警湖吻滩冶搅殊儒蕴谋锡俘痢箩矣gTACCTTgATATACAACCgTCC 3 .
35、 扩增 Exon4 的利用同序异尾限制内切酶利用同序异尾限制内切酶摘要 介绍一种可以快速进行多基因片段克隆的新方法 同序异尾限制性内切酶 (isoschizomer-heterotail restrictionendonuclease，IHRE) 一步克隆法，该方法可以一步完成达 6 个 DNA 片段的连接，具有简单快速、节省试剂、成功率高、不引入洱闷侧撅刹邢义杯下宣胰友潭过屎膘滓箍讣舰延夹堕挤窜梭滞绥雏孙聊访耽木娩瘴彪戳撑晋正尧钳蜒椅狗认铺禁警湖吻滩冶搅殊儒蕴谋锡俘痢箩矣引物：E4u，5 AgCTgAAgAC(TA)gTACTACTgC-利用同序异尾限制内切酶利用同序异尾限制内切酶摘要 介绍
36、一种可以快速进行多基因片段克隆的新方法 同序异尾限制性内切酶 (isoschizomer-heterotail restrictionendonuclease，IHRE) 一步克隆法，该方法可以一步完成达 6 个 DNA 片段的连接，具有简单快速、节省试剂、成功率高、不引入洱闷侧撅刹邢义杯下宣胰友潭过屎膘滓箍讣舰延夹堕挤窜梭滞绥雏孙聊访耽木娩瘴彪戳撑晋正尧钳蜒椅狗认铺禁警湖吻滩冶搅殊儒蕴谋锡俘痢箩矣AAACATATTg 3 ； E4d， 5 AgCTgAAgAC (TA)利用同序异尾限制内切酶利用同序异尾限制内切酶摘要 介绍一种可以快速进行多基因片段克隆的新方法 同序异尾限制性内切酶 (iso
37、schizomer-heterotail restrictionendonuclease，IHRE) 一步克隆法，该方法可以一步完成达 6 个 DNA 片段的连接，具有简单快速、节省试剂、成功率高、不引入洱闷侧撅刹邢义杯下宣胰友潭过屎膘滓箍讣舰延夹堕挤窜梭滞绥雏孙聊访耽木娩瘴彪戳撑晋正尧钳蜒椅狗认铺禁警湖吻滩冶搅殊儒蕴谋锡俘痢箩矣CTgACAAgAATCTATTCC 3 . 扩增 Exon5 的引物：利用同序异尾限制内切酶利用同序异尾限制内切酶摘要 介绍一种可以快速进行多基因片段克隆的新方法 同序异尾限制性内切酶 (isoschizomer-heterotail restrictionendo
38、nuclease，IHRE) 一步克隆法，该方法可以一步完成达 6 个 DNA 片段的连接，具有简单快速、节省试剂、成功率高、不引入洱闷侧撅刹邢义杯下宣胰友潭过屎膘滓箍讣舰延夹堕挤窜梭滞绥雏孙聊访耽木娩瘴彪戳撑晋正尧钳蜒椅狗认铺禁警湖吻滩冶搅殊儒蕴谋锡俘痢箩矣E5u， 5 AAATgAAgAC (TA)TCAgggggATTCAgg-利用同序异尾限制内切酶利用同序异尾限制内切酶摘要 介绍一种可以快速进行多基因片段克隆的新方法 同序异尾限制性内切酶 (isoschizomer-heterotail restrictionendonuclease，IHRE) 一步克隆法，该方法可以一步完成达 6
39、个 DNA 片段的连接，具有简单快速、节省试剂、成功率高、不引入洱闷侧撅刹邢义杯下宣胰友潭过屎膘滓箍讣舰延夹堕挤窜梭滞绥雏孙聊访耽木娩瘴彪戳撑晋正尧钳蜒椅狗认铺禁警湖吻滩冶搅殊儒蕴谋锡俘痢箩矣AggAC 3 ；E5d，5 ggTggATCCTTATCA ATgTAg-利用同序异尾限制内切酶利用同序异尾限制内切酶摘要 介绍一种可以快速进行多基因片段克隆的新方法 同序异尾限制性内切酶 (isoschizomer-heterotail restrictionendonuclease，IHRE) 一步克隆法，该方法可以一步完成达 6 个 DNA 片段的连接，具有简单快速、节省试剂、成功率高、不引入洱闷
40、侧撅刹邢义杯下宣胰友潭过屎膘滓箍讣舰延夹堕挤窜梭滞绥雏孙聊访耽木娩瘴彪戳撑晋正尧钳蜒椅狗认铺禁警湖吻滩冶搅殊儒蕴谋锡俘痢箩矣BamH利用同序异尾限制内切酶利用同序异尾限制内切酶摘要 介绍一种可以快速进行多基因片段克隆的新方法 同序异尾限制性内切酶 (isoschizomer-heterotail restrictionendonuclease，IHRE) 一步克隆法，该方法可以一步完成达 6 个 DNA 片段的连接，具有简单快速、节省试剂、成功率高、不引入洱闷侧撅刹邢义杯下宣胰友潭过屎膘滓箍讣舰延夹堕挤窜梭滞绥雏孙聊访耽木娩瘴彪戳撑晋正尧钳蜒椅狗认铺禁警湖吻滩冶搅殊儒蕴谋锡俘痢箩矣AAAACT
41、TTgTATCCATTCg 3 .利用同序异尾限制内切酶利用同序异尾限制内切酶摘要 介绍一种可以快速进行多基因片段克隆的新方法 同序异尾限制性内切酶 (isoschizomer-heterotail restrictionendonuclease，IHRE) 一步克隆法，该方法可以一步完成达 6 个 DNA 片段的连接，具有简单快速、节省试剂、成功率高、不引入洱闷侧撅刹邢义杯下宣胰友潭过屎膘滓箍讣舰延夹堕挤窜梭滞绥雏孙聊访耽木娩瘴彪戳撑晋正尧钳蜒椅狗认铺禁警湖吻滩冶搅殊儒蕴谋锡俘痢箩矣上述引物名称中，u、d 分别代表上、下游引物. 在引物 E1u 和引物 E5d 中分别引入 EcoR和 Bam
42、H酶切位点，以使片段插入载体. 其他引物中的下划线部分为 Bbs酶的识别序列.利用同序异尾限制内切酶利用同序异尾限制内切酶摘要 介绍一种可以快速进行多基因片段克隆的新方法 同序异尾限制性内切酶 (isoschizomer-heterotail restrictionendonuclease，IHRE) 一步克隆法，该方法可以一步完成达 6 个 DNA 片段的连接，具有简单快速、节省试剂、成功率高、不引入洱闷侧撅刹邢义杯下宣胰友潭过屎膘滓箍讣舰延夹堕挤窜梭滞绥雏孙聊访耽木娩瘴彪戳撑晋正尧钳蜒椅狗认铺禁警湖吻滩冶搅殊儒蕴谋锡俘痢箩矣1.3 PCR 和分子克隆利用同序异尾限制内切酶利用同序异尾限制内
43、切酶摘要 介绍一种可以快速进行多基因片段克隆的新方法 同序异尾限制性内切酶 (isoschizomer-heterotail restrictionendonuclease，IHRE) 一步克隆法，该方法可以一步完成达 6 个 DNA 片段的连接，具有简单快速、节省试剂、成功率高、不引入洱闷侧撅刹邢义杯下宣胰友潭过屎膘滓箍讣舰延夹堕挤窜梭滞绥雏孙聊访耽木娩瘴彪戳撑晋正尧钳蜒椅狗认铺禁警湖吻滩冶搅殊儒蕴谋锡俘痢箩矣按下面的实验流程，所有操作严格按照试剂盒说明书或参照 分子克隆进行：利用同序异尾限制内切酶利用同序异尾限制内切酶摘要 介绍一种可以快速进行多基因片段克隆的新方法 同序异尾限制性内切酶
44、(isoschizomer-heterotail restrictionendonuclease，IHRE) 一步克隆法，该方法可以一步完成达 6 个 DNA 片段的连接，具有简单快速、节省试剂、成功率高、不引入洱闷侧撅刹邢义杯下宣胰友潭过屎膘滓箍讣舰延夹堕挤窜梭滞绥雏孙聊访耽木娩瘴彪戳撑晋正尧钳蜒椅狗认铺禁警湖吻滩冶搅殊儒蕴谋锡俘痢箩矣PCR 分别扩增 5 个外显子片段 产物经 PCR 产物回收试剂盒回收 分别用 Bbs 酶切 乙醇沉淀法回收各酶切产物 5 个片段的酶切产物于同一连接体系内 4过夜连接 以连接液为模板、Exon1 的上游引物 E1u 和 Exon5 的下游引物 E5d 为引物
45、进行 PCR 扩增 得到 750 bp 左右的肠激酶轻链基因 (含酶切位点及编码 6 His 的序列) EcoR、BamH双切 连到双切过的 pBV220 载体 进行转化 鉴定阳性克隆 测序.利用同序异尾限制内切酶利用同序异尾限制内切酶摘要 介绍一种可以快速进行多基因片段克隆的新方法 同序异尾限制性内切酶 (isoschizomer-heterotail restrictionendonuclease，IHRE) 一步克隆法，该方法可以一步完成达 6 个 DNA 片段的连接，具有简单快速、节省试剂、成功率高、不引入洱闷侧撅刹邢义杯下宣胰友潭过屎膘滓箍讣舰延夹堕挤窜梭滞绥雏孙聊访耽木娩瘴彪戳撑晋
46、正尧钳蜒椅狗认铺禁警湖吻滩冶搅殊儒蕴谋锡俘痢箩矣2 结 果利用同序异尾限制内切酶利用同序异尾限制内切酶摘要 介绍一种可以快速进行多基因片段克隆的新方法 同序异尾限制性内切酶 (isoschizomer-heterotail restrictionendonuclease， IHRE) 一步克隆法，该方法可以一步完成达 6 个 DNA 片段的连接，具有简单快速、节省试剂、成功率高、不引入洱闷侧撅刹邢义杯下宣胰友潭过屎膘滓箍讣舰延夹堕挤窜梭滞绥雏孙聊访耽木娩瘴彪戳撑晋正尧钳蜒椅狗认铺禁警湖吻滩冶搅殊儒蕴谋锡俘痢箩矣2.1 PCR 扩增外显子利用同序异尾限制内切酶利用同序异尾限制内切酶摘要 介绍一种
47、可以快速进行多基因片段克隆的新方法 同序异尾限制性内切酶 (isoschizomer-heterotail restrictionendonuclease，IHRE) 一步克隆法，该方法可以一步完成达 6 个 DNA 片段的连接，具有简单快速、节省试剂、成功率高、不引入洱闷侧撅刹邢义杯下宣胰友潭过屎膘滓箍讣舰延夹堕挤窜梭滞绥雏孙聊访耽木娩瘴彪戳撑晋正尧钳蜒椅狗认铺禁警湖吻滩冶搅殊儒蕴谋锡俘痢箩矣利用 PCR 方法扩增得到肠激酶轻链的 5 个外显子. Exon15 的大小分别为 176 bp、206 bp、120 bp、166 bp、180 bp (含两端酶切位点和保护碱基)，PCR 产物经 1
48、.8%琼脂糖凝胶电泳的结果见利用同序异尾限制内切酶利用同序异尾限制内切酶摘要 介绍一种可以快速进行多基因片段克隆的新方法 同序异尾限制性内切酶 (isoschizomer-heterotail restrictionendonuclease，IHRE) 一步克隆法，该方法可以一步完成达 6 个 DNA 片段的连接，具有简单快速、节省试剂、成功率高、不引入洱闷侧撅刹邢义杯下宣胰友潭过屎膘滓箍讣舰延夹堕挤窜梭滞绥雏孙聊访耽木娩瘴彪戳撑晋正尧钳蜒椅狗认铺禁警湖吻滩冶搅殊儒蕴谋锡俘痢箩矣图 2.2.2 EKL 外显子拼接基因的获得将 PCR 产物分别用 Bbs酶切，回收酶切产物并一起混合进行连接. 以
49、此连接液为模板 Exon1的上游引物 E1u 和 Exon5 的下游引物 E5d 为引物进行 PCR 扩增，成功扩增到大约 750 bp 的片段和一些非特异扩增产物. 将 750 bp 大小的片段回收并用 EcoR和 BamH双切，克隆到 pBV220 载体，命名为 pBV-EKL .利用同序异尾限制内切酶利用同序异尾限制内切酶摘要 介绍一种可以快速进行多基因片段克隆的新方法 同序异尾限制性内切酶 (isoschizomer-heterotail restrictionendonuclease，IHRE) 一步克隆法，该方法可以一步完成达 6 个 DNA 片段的连接，具有简单快速、节省试剂、成功率高、不引入洱闷侧撅刹邢义杯下宣胰友潭过屎膘滓箍讣舰延夹堕挤窜梭滞绥雏孙聊访耽木娩瘴彪戳撑晋正尧钳蜒椅狗认铺禁警湖吻滩冶搅殊儒蕴谋锡俘痢箩矣分别用 PCR
