1、第七章 食品中化学物质致癌作用及其评价,目的与要求,1. 掌握基本概念 2. 掌握化学致癌物的分类 3. 掌握癌变多阶段学说 4. 熟悉化学致癌物的评定 5. 掌握哺乳动物致癌试验设计的基本点 6. 了解化学致癌过程的阻断,第一节 概 述,一、癌症发病情况,癌症是一种全身性疾病。癌不但可以恶性膨胀，还能扩散和转移，严重威胁人类健康和生命。 “癌症正在成为人类第一杀手”。全世界每年因癌症死亡的人数高达1000多万人。世界卫生组织（WHO）发表的资料指出，根据目前癌症的发病趋势，2020年全世界癌症发病率将比现在增加50，全球每年新增癌症患者人数将达到1500万人。,一、癌症发病情况,目前全世界发
2、病率最高的癌症是肺癌，每年新增患者为120万人；其次是乳腺癌，每年新增大约100万名患者；随后依次是肠癌(94万人)、胃癌(87万人)、肝癌(56万人)、宫颈癌(47万人)、食道癌(41万人)等。 其中杀伤力最强的是肺癌、胃癌和肝癌，分别占癌症死亡人数的17.8、10.4和8.8。,一、癌症发病情况,人类癌症有80%90%由环境因素引起。 化学因素是人类肿瘤的主要病因，在环境因素引起的肿瘤中，其中80%以上为化学因素所致。,二、研究致癌物的历史,1775年英国Pott 阴囊癌（煤焦油） 1895年德国Rehn 膀胱癌（染料厂） 1915年日本山极和市川 试验性皮肤癌（煤焦油） 1922年英国K
3、ennway 动物皮肤癌（多环芳烃） 1954年英国Case 职业性膀胱癌（-萘胺和联苯胺）,三、相关基础概念,癌（cancer, carcinoma） ：指组织或细胞摆脱了体内平衡，相对自主生长，不断分裂而形成的危害机体的新生物。在毒理学中，“癌”的含义应包括上皮的恶性变(癌)、间质的恶性变(肉瘤)及良性肿瘤。,三、相关基础概念,化学致癌作用(chemical carcinogenesis)：是指化学物质引起正常细胞发生恶性转化并发展成肿瘤的作用。化学致癌物 (chemical carcinogen)： 是指具有化学致癌作用的化学物质 。,第二节 化学致癌物的分类,一、按致癌作用机制分类,（
4、一）遗传毒性致癌物 (genotoxic carcinogens),（二）非遗传毒性致癌物(non-genotoxic carcinogens),1.促长剂 2.内分泌调控剂 3.细胞毒剂 4.过氧化物酶体增殖剂 5.免疫抑制剂 6.固态物质 7.助癌物,（二）非遗传毒性致癌物(non-genotoxic carcinogens),1.促长剂（promoter） 促长剂本身不能诱发肿瘤，只有作用于引发细胞才表现其致癌活性；通常是非致突变物，不与DNA发生反应；促长剂通常具有阈剂量。 引发细胞：在引发剂的作用下发生了不可逆的遗传性改变，但其表型可能正常，不具有自主生长性，因此不是肿瘤细胞。,（二
5、）非遗传毒性致癌物(non-genotoxic carcinogens),2.内分泌调控剂 主要改变内分泌系统平衡及细胞正常分化，常起促长剂作用。雌激素：乙烯雌酚、雌二醇雄激素：睾酮抗甲状腺物质：硫脲、某些磺胺类药物,（二）非遗传毒性致癌物(non-genotoxic carcinogens),3.细胞毒剂 具有细胞毒性的化学物，可通过引起细胞死亡，导致细胞代偿性增生而引发肿瘤。 一些氯代烃类促癌剂的作用机理可能与细胞毒性作用有关。,（二）非遗传毒性致癌物,4.过氧化物酶体增殖剂 (peroxisome proliferator) 有一类化合物可引起肝脏过氧化物酶体增殖，称之为过氧化物酶体增殖
6、剂。 已发现的过氧化物酶体增殖剂有降血脂药物安妥明、增塑剂二-（2-乙基己基）邻苯甲酸酯和有机溶剂1,1,2-三氯乙烯。 有关过氧化物酶体增殖剂致癌机制尚未完全阐明，目前理论有：引起氧化物酶体增多，导致细胞内氧自由基过量生成，造成DNA氧化损伤，而启动致癌过程；通过短期“暴发”的DNA修复合成增强，导致细胞增殖；通过激活受体介导的促有丝分裂作用。,（二）非遗传毒性致癌物(non-genotoxic carcinogens),5.免疫抑制剂 主要对病毒诱导的恶性转化起增强作用。 硫唑嘌呤、6-巯基嘌呤等免疫抑制剂或免疫血清均能使动物和人发生白血病或淋巴瘤，但很少发生实体肿瘤。,（二）非遗传毒性致
7、癌物(non-genotoxic carcinogens),6.固态物质 一些惰性物质及金属薄片可在啮齿类动物体内的种植部位引发肉瘤，物理特性及表面积很大程度上决定了植入物的致癌能力。 如塑料、石棉等。暴露于石棉纤维会引起恶性间皮瘤或呼吸系肿瘤，而其主要取决于石棉的晶体结构而非其组分。,（二）非遗传毒性致癌物(non-genotoxic carcinogens),7.助癌物(cocarcinogen) 指其单独接触无致癌性，但在接触致癌物之前或同时接触可增加肿瘤发生的一类化合物。 芘在苯并（a）芘致皮肤肿瘤中起助癌作用，香烟烟雾中的儿茶酚和其他酚类化合物可能兼具促长剂和助癌物的作用。 助癌作用
8、的机制可涉及增强致癌物的吸收，增强间接致癌物的代谢活化或抑制致癌物的代谢解毒，耗竭内源性结合反应底物（如谷胱甘肽等），抑制DNA修复，促进细胞增殖等。,二、按致癌作用证据分类（IARC分类）,世界卫生组织下属机构国际癌症研究所（international agency for research on cancer，IARC ）根据对人类和对实验动物致癌性资料，以及其他有关的资料进行综合评价将环境致癌因素分为四组：组1， 对人类是致癌物。 组2， 对人类是很可能或可能致癌物。组2A，对人类很可能（probably）是致癌物 。组2B，对人类是可能(possible)致癌物 。 组3， 现有的证据
9、不能对人类致癌性进行分类。 组4， 对人类可能是非致癌物。,IARC分类,第三节 化学致癌物的作用机制,化学致癌物的作用机制,一、体细胞突变学说 二、癌基因学说 三、亲电子剂学说 四、癌变多阶段学说 五、表观遗传机制学说,癌变多阶段学说多因素、多基因参与的多阶段过程,一、引发阶段,引发阶段指化学物或其活性代谢物与DNA作用，导致体细胞突变成引发细胞的阶段。 引发剂（initiator）：指具有引发作用的化学物。引发剂大多数是致突变物，没有可检测的阈剂量。 引发细胞（initiated cell）：在引发剂的作用下发生了不可逆的遗传性改变，但其表型可能正常，不具有自主生长性，因此不是肿瘤细胞。
10、引发剂作用的靶：主要是原癌基因和肿瘤抑制基因。,一、引发阶段,癌基因（oncogene）是一类能引起细胞恶性转化及癌变的基因。 癌基因通常是以原癌基因（pro-oncogene）的形式普遍存在于正常动物细胞的基因组内，原癌基因在进化过程中高度保守，具有正常的生物学功能，对细胞增殖、分化和信息传递的调控起重要作用。只有当其受到物理、化学或生物等致癌因素作用而激活变为活化的癌基因后才显示其致癌活性。 原癌基因是一种显性基因，当其两个等位基因之一发生突变，即可被激活。,一、引发阶段,肿瘤抑制基因也称抑癌基因或抗癌基因，其作用方式与癌基因相反，它们在正常细胞中起着抑制细胞增殖和促进分化的作用，在环境致
11、癌因素作用下，肿瘤抑制基因失活而引起细胞的恶性转化。抑癌基因属隐性基因，必须一对等位基因丢失或突变后失活，才能对细胞的恶性转化起作用。 在化学致癌过程中癌基因和肿瘤抑制基因往往起协同作用。,二、促长阶段,促长阶段指引发细胞增殖成为癌前病变或良性肿瘤的过程。 促长剂（promoter）：指具有促长作用的化学物。促长剂本身不能诱发肿瘤，只有作用于引发细胞才表现其致癌活性；通常是非致突变物，不与DNA发生反应；促长剂通常具有阈剂量。,二、促长阶段,恶性肿瘤的发生是一个逐渐演变的过程，人体上某些器官的一些良性病容易出现细胞异常增生，具有恶性变化倾向，这些异常增生具有癌变倾向的病变称为癌前病变。,二、促
12、长阶段,良性肿瘤是指机体内某些组织的细胞发生异常增殖，呈膨胀性生长，似吹气球样逐渐膨大，生长比较缓慢。由于瘤体不断增大，可挤压周围组织，但并不侵入邻近的正常组织内，瘤体多呈球形、结节状。周围常形成包膜，因此与正常组织分界明显，用手触摸，推之可移动，手术时容易切除干净，摘除不转移，很少有复发。,二、促长阶段,促长阶段的特点： 促长阶段历时较长，早期有可逆性，晚期为不可逆的，因此在促长阶段（特别是在早期）持续给以促长剂是必需的。 2.促长阶段的另一个特点是对生理因素调节的敏感性，衰老、饮食和激素可影响促长作用，许多影响因素本身就是促长剂。,二、促长阶段,三、演进阶段,演进阶段指从癌前病变或良性肿瘤
13、转变成恶性肿瘤的过程。如生长加快、侵袭、转移、抗药性等。 进展剂（progressor ）：指使细胞由促长阶段进入进展阶段的化学物。进展剂具有引起染色体畸变的特性。 完全致癌物（complete carcinogen）：指同时具有引发、促长及进展作用的化学物。,三、演进阶段,进展阶段关键的分子特性：染色体的不稳定性主要表现：染色体发生断裂染色体断片易位非整倍体等,前致癌物,终致癌物,分化的肿瘤,引发的细胞,癌变多阶段学说,第四节 化学致癌作用的评价方法,一、短期试验,（一）致突变试验 （二）哺乳动物细胞恶性转化试验 （三）哺乳动物短期致癌试验 （四）转基因动物致癌检测模型,一、短期试验 （一）
14、致突变试验,用于致癌物筛选的致突变试验如下： 1.基因突变试验：鼠伤寒沙门菌回复突变试验（Ames试验）、培养哺乳动物细胞胸苷激酶位点（tk）或次黄嘌呤鸟嘌呤转磷酸核糖基酶位点（hgprt）正向突变试验 2.染色体畸变试验：体外细胞系细胞遗传学试验、小鼠骨髓微核试验、大鼠骨髓染色体畸变试验 3.原发性DNA损伤：DNA加合物、链断裂、彗星试验、DNA修复诱导（细菌SOS反应，大鼠肝UDS诱导）、姐妹染色单体交换试验,一、短期试验 （一）致突变试验,预测致癌性的理想的致突变试验应能灵敏地预测出受试物的致癌性，也能特异地预测出受试物的非致癌性，即要有高的灵敏性、特异性。,一、短期试验 （二）哺乳动
15、物细胞恶性转化试验,本试验以细胞恶性转化为观察终点，在细胞生物学水平上研究肿瘤的发生与发展。 细胞转化指培养细胞在有害因素作用下发生一系列与肿瘤形成有关的细胞形态学及生物学特性的改变。,一、短期试验 （二）细胞恶性转化试验,细胞恶性转化的判定：1.形态学变化2.凋亡敏感性降低3.锚着独立性生长4.血清抗性试验5.刀豆蛋白A凝集试验6.动物体内成瘤性,一、短期试验 （二）细胞恶性转化试验,1.形态学变化 正常细胞呈单层生长，排列有序。而转化细胞呈多层生长，极性消失，其中，恶性转化的上皮细胞群中会出现纺锤形的成纤维样细胞；而成纤维细胞则呈纺锤形或上皮细胞样改变，并形成转化灶。,一、短期试验 （二）
16、细胞恶性转化试验,2.凋亡敏感性降低 凋亡敏感性降低在人细胞转化中起重要作用。 常用细胞凋亡的检测方法：常规的琼脂糖凝胶电泳流式细胞仪检测细胞凋亡（Annexin V/PI双染法）脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（TUNEL法）,一、短期试验 （二）细胞恶性转化试验,3.锚着独立性生长 转化细胞对血清及细胞间通讯的依赖性降低，具有在低密度条件下在半固体琼脂中形成集落的能力，即锚着独立性生长，它是癌前转化的特征，是体外检测细胞恶性转化的重要指标。但并不能反映其裸鼠成瘤性。,一、短期试验 （二）细胞恶性转化试验,4.血清抗性试验 血清作为上皮细胞的一种终末分化诱导剂，高浓度时可抑制人类
17、上皮细胞生长及诱导肿瘤细胞分化，恶性转化细胞对血清的生长抑制作用具有抗性。,一、短期试验 （二）细胞恶性转化试验,5.刀豆蛋白A凝集试验 ConA凝集试验：恶性细胞膜表面的ConA受体增加，在ConA溶液中将出现凝集时间提前和凝集度加强现象。,一、短期试验 （二）细胞恶性转化试验,6.动物体内成瘤性 判定细胞发生恶性转化的最终最可靠指标是动物体内成瘤性。 一般均采用皮下注射的方法，肿瘤体积需达1cm3以上方能判定为阳性。并要结合病理检测。 但由于存在种属差异，裸鼠皮下的成瘤性作为人类细胞恶性转化的最后标准是否可行，尚有异议。,一、短期试验 （三）哺乳动物短期致癌试验,在哺乳动物致癌试验中，会发
18、现受试化合物对某些特定组织的致瘤作用比对其他组织更为明显，据此建立了比常规动物致癌试验时间更短，更敏感的哺乳动物短期致癌试验，又称为有限体内试验。在这些试验中仅观察特定靶器官的肿瘤发生情况，试验期限一般在数周到数月。,常用的短期致癌试验有：小鼠皮肤肿瘤诱发试验 20周小鼠肺肿瘤诱发试验 30周大鼠肝转化灶诱发试验 8-14周雌性大鼠乳腺癌诱发试验 6个月此四个试验不是成组试验，应根据受试物的特点选择使用。哺乳动物短期致癌试验得到阳性结果时，其意义与长期动物致癌试验相似。但由于其仅观察特定器官，试验期较短，若得到阴性结果，并不能排除受试物的致癌性。,一、短期试验 （三）哺乳动物短期致癌试验,一、
19、短期试验 （四）转基因动物致癌检测模型,随着致癌作用靶基因的明确和转基因动物技术的发展，用特定基因改造动物模型进行试验，使对外来化合物的致癌性检测更为快速和敏感。 目前已建立的检测模型或研究模型有：1.过量表达癌基因的转基因动物模型 2.基因删除动物致癌检测模型,1.过量表达癌基因的转基因动物模型 如TG，AC小鼠，HK-fos转基因小鼠，Ras-H2转基因小鼠，携带激活的H-Ras原癌基因小鼠等。 这些转基因动物对化学致癌剂的敏感性提高了许多倍。如带有激活Pim-1肿瘤基因的转基因动物，对乙基硝基脲的致癌作用，较相应的非转基因动物，其敏感性提高了25倍。,一、短期试验 （四）转基因动物致癌检
20、测模型,2.基因删除动物致癌检测模型 用同源重组的方法，将一段DNA整合到抗肿瘤基因，使该抗肿瘤基因不能表达具有正常功能的蛋白质，用这种方法培养的动物称基因删除动物。,一、短期试验 （四）转基因动物致癌检测模型,二、哺乳动物致癌试验,需要进行哺乳动物致癌试验的一般原则是： 1.人体可能长期暴露于该化学物； 2.该化学物或其代谢物的化学结构与已知致癌物相似； 3.反复染毒毒性试验提示该化学物可能产生癌前病变等。,（一）试验动物,物种：一般主张用两种物种进行试验。常用的是大鼠和小鼠，也可用仓鼠。啮齿类动物对多数致癌物易感性较高，寿命相对较短，费用也较低，生理和病理学资料较完备，在致癌试验中使用最广
21、泛。 品系：在选择品系时应选择较敏感、自发肿瘤率低、生命力强及寿命较长的品系。美国国立癌症研究所（NCI）推荐 Fischer344大鼠和B6C3F1小鼠。,（一）试验动物,性别：为接近人类情况，应使用同等数量的雌雄两种性别的动物。 年龄：一般选用刚离乳的动物，以保证有足够长的染毒和发生癌症时间，而且幼年动物解毒酶及免疫系统尚未完善，对致癌作用比较敏感。 数量：动物数应满足统计学分析的要求。各组动物需求数与实验动物肿瘤自发率及受试物诱发动物肿瘤发生率有关。一般每组至少有雌雄各50只动物，希望在出现第一个肿瘤时，每组存活动物数不少于25只。,（二）剂量设置,（二）剂量设置,为在有限数量的动物能检
22、出致癌物，高剂量组应尽可能大，原则上，可引起轻微的毒性反应，但不影响其正常生长、发育和寿命。中及低剂量组则按等比级数下推，如分别为上一个剂量水平的1/2或1/3。 低剂量组应不影响动物的正常生长、发育和寿命，即不产生任何毒性效应。但低剂量组应高于人的接触剂量，一般不低于高剂量的10% 。 中剂量组介于高、低剂量组之间，如有可能按受试物的毒物动力学性质来确定。,（三）染毒方式,应尽可能模拟人体可能的暴露途径， 主要途径有经口、经皮和吸入三种， 应根据受试物的理化性质和接触方式选择确定。染毒时间通常是从实验开始直至实验结束反复多次染毒。,（四）试验期限,原则上试验期限要求长期或终生，应包括动物正常
23、寿命的大部分时间： 1. 一般小鼠和仓鼠至少18个月，大鼠至少24个月。对于某些生命期较长或自发肿瘤率低的动物品系，小鼠和仓鼠可持续24个月，大鼠可持续30个月。 2. 试验期中，当最低剂量组或对照组存活的动物数仅为开始时的25%时，可及时中止试验；但因明显的受试物毒作用造成高剂量组动物过早死亡，则应继续进行试验。,（五）观察指标,1.一般观察 每天观察实验动物的一般状况（外表、活动、摄食情况等）和毒性反应，对死亡动物要及时剖检。试验最初三个月每周称体重一次，以后每四周称体重一次。掺入饲料或饮水中染毒时，应记录食物消耗量或饮水量。,（五）观察指标,2.肿瘤发生情况 对每一肉眼可见及可触及的肿瘤
24、，均应记录其出现时间、部位、大小、外形、发展状况和动物死亡时间。,（五）观察指标,3.病理检查 试验过程中死亡或濒死而提前处死动物，及试验结束后的全部处死动物均应进行系统尸检和组织病理学检查，确定肿瘤的性质和靶器官。对已出现肿瘤或可疑肿瘤的器官和肉眼检查有明显病变的器官，应注意观察癌前病变。,（六）结果分析,1.肿瘤发生率 是整个试验结束后，患瘤动物总数在有效动物总数中所占的百分率。即：肿瘤发生率（%）=（实验结束时患肿瘤动物总数/有效动物总数）100%有效动物总数指最早发现肿瘤时存活动物总数。肿瘤发生率是最重要的指标，需要计算肿瘤（良性和恶性）总发生率、恶性肿瘤总发生率、各器官或组织肿瘤发生
25、率和恶性肿瘤发生率，以及各种病理类型肿瘤发生率。,（六）结果分析,2. 肿瘤潜伏期 即从摄入受试物起到发现肿瘤的时间，可将各组第一个动物出现肿瘤的时间作为该组的潜伏期。但内脏肿瘤不易觉察，通常将肿瘤引起动物死亡的时间定为发生肿瘤的时间。,（六）结果分析,3. 肿瘤多发性 是指一个动物出现多个器官的肿瘤或一个器官出现多个肿瘤，是化学致癌的显著特征。 一般计算每一组的平均肿瘤数和每一组中出现2个、3个或多个肿瘤的动物数或比例。,（六）结果分析,世界卫生组织（WHO，1969年）提出下列4条判断标准，阳性结果的判断需满足下列反应的一种或数种：阴性对照组动物出现的一种或数种肿瘤，试验组动物均有发生，且肿瘤发生率高于对照组；试验组动物发生阴性对照组没有的肿瘤类型；试验组动物肿瘤发生早于阴性对照组；试验组每个动物的平均肿瘤数超过阴性对照组。,三、流行病学调查,对于化学物对人类的致癌性最可靠的证据是设计严密的流行病学资料。为更好地阐明环境因素与肿瘤发生间的关系，应加强肿瘤流行病学的研究。,三、流行病学调查,但流行病学资料也有局限性，资料往往是回顾性的，接触剂量估计都很粗，人类往往同时接触多种化学物质，还有生活习惯如吸烟、饮酒的影响，彼此干扰、混淆。在人类肿瘤的病因学研究中，流行病学调查得到“阴性”结果有时并不能确定某种物质是否具有弱的致癌作用。,
