1、第十章 有机高分子基质的高效液相色谱分离柱填料,首先回顾几个问题,HPLC方法的主要特点有那些？ HPLC的主要设备分哪几部分？,HPLC方法的主要特点,分离效率高，选择性好，适于各种多元组分复杂化合物的分离 应用范围广：无机物有机物，天然物质合成产物，小分子-大分子，一般化合物到生物活性物质 分离机理各异，色谱柱、淋洗体系和操作参数选择广泛 分离纯化+分析检测 样品量从痕量到大规模制备，实现在线监测和自动化操作。,HPLC的关键设备,专用的高压输液系统; 高灵敏检测系统; 高效分离柱其中分离柱是色谱的中心,是最为关键的部分,与经典色谱的比较,HPLC分离填料：,有机基质,多糖型凝胶,高聚物树
2、脂,无机基质,硅胶,氧化锆,氧化铝,多孔玻璃,羟基磷灰石,石墨化碳黑,基质微球天然多糖或合成单体或交联剂 负载样品的能力强，色谱容量高 耐酸碱、具化学稳定性，柱寿命长，易再生 不易产生非特异性吸附作用,一、HPLC色谱柱的关键在于填料,物理结构色谱动力学 （粒度与粒度分布、孔径与孔径分布、颗粒强度和表观形态柱效率、穿透性） 化学结构色谱热力学 （连接在基质上的官能团或链段样品保留值、选择性）,1、HPLC色谱柱填料在物理结构上的要求: 颗粒大小合适，粒度分布较窄; 颗粒强度适应高速高压操作; 多孔型的孔径大小和孔径分布适宜,避免复杂的微孔结构; 一定的溶胀及收缩水平。,常见的液相色谱填料类型,
3、目前的主要发展方向(研究热点): 颗粒单分散的填料; 贯穿性超大孔结构的填料; 小颗粒的非多孔填料。,2、HPLC色谱柱填料在化学结构上的要求 特定的选择性; 良好的化学稳定性及热稳定性; 避免不可逆吸附。 不同填料的化学结构是通过对基质材料的化学改性而实现的。,离子交换色谱填料 颗粒表面携带季铵基、DEAE基、磺酸基、羧基等强弱阴阳离子集团。 反相色谱填料 C18、C8烷基等疏水性集团 正相色谱填料 羟基、氨基、氰基等弱疏水性集团 亲和色谱填料 蛋白质、抗体、激素、抗菌素、酶等具有生物特异性的配基,二、有机高分子类型的HPLC填料基质树脂,基质材料决定填料物理结构和化学结构:颗粒大小与分布,
4、颗粒强度,孔径大小,孔结构形态,颗粒内部的化学结构及其稳定性, 直接影响对颗粒的表面(包括内孔表面)的化学修饰。可分为: 多糖型 聚合物型,（一）多糖型基质材料,1.葡聚糖系: 高交联的羟丙基化葡聚糖,其颗粒刚性好,粒度小而且分布范围窄（1023m）;Sephasorb HP Uitrafine 用于中低压色谱和高效色谱 烯丙基葡聚糖与N,N-亚甲基双丙烯酰胺交联共聚而成的凝胶。Sephacryl系列(S-100HR,S-200HR,S-300HR)属于高效凝胶，较高流速下使用,2.琼脂糖系: Sepharose与2,3-二溴丙醇反应生成琼脂糖凝胶 Sepharose CL(CL-2B,CL-
5、4B,CL-6B) 高度偶联琼脂糖凝胶Sepharose Fast Flow (Sepharose 6FF, Sepharose 4FF) 高效琼脂糖凝胶Sepharose high Performance Superdax(葡聚糖与交联琼脂糖的结合)：快流速 Superose(珠状琼脂糖经两次交联)：高效凝胶,（二）聚合物型基质材料,交联聚苯乙烯树脂:苯乙烯与二乙烯苯的交联共聚物(PS-DVB)，是应用最为广泛的一类基质树脂。 交联聚甲基丙烯酸酯类树脂:以甲基丙烯酸的甲脂、丁酯、羟基乙酯、环氧丙酯等化合物为单体制备的交联高聚物。,三、填料性能评价,填料的物化性质指标 填料的色谱性能表征,1、
6、物化性质指标: a.颗粒大小及其分布(dp); b.比表面积S(m2/g)； c .骨架密度g(g/ml)、溶剂吸收量Sr(ml/g)、溶胀因子f; d.比孔体积Vp(ml/g); e.孔度； f.孔径大小及分布； g.化学结构与化学性质。,2、色谱性能表征: 保留值： 保留时间(TR),保留体积(VR),容量因子(K) 选择性：相邻二物质保留时间之比,与固定相、流动相及温度有关。 柱效率：理论塔板数(N)，或理论塔板高度(H)表示。 填充柱的总空隙度和穿透性： 分离度(R)：相邻两色谱峰的保留值之差与各自峰底宽度一半之和的比值。,四、反相HPLC高分子填料 Reversed Phase Ch
7、romatography,RPC,反相色谱（原理参照P237） ：非极性固定相，极性流动相，强极性组分先洗脱出来。,1.目前RPC分离柱以硅胶基质的键合相填料为主，特别是键合C18，C8烷基以及苯基填料。 特点：传质快，刚性好，柱效高，选择性好。 不足：pH28，容易使蛋白质失活（残留的硅羟基）,广泛使用的是微球形交联聚苯乙烯树脂，另有带C18烷基侧链的聚丙酰胺、聚甲基丙烯酸的烷基酯化物、聚乙烯醇的酯化物，C18烷基键合的聚乙烯醇。优点：pH范围较广，表面有较强的疏水性,主要厂家,日本：东洋-曹达Tosoh-TSK 瑞士：Hamilton,汉密尔顿, 英国：高聚物实验室Polymer Lab
8、美国：Bio-Rad伯乐 瑞典：安捷伦Agilent详见：P194表101,被分离样品的分子量大小与填料的孔径选择 如PLRPS填料： 孔径10nm，适于分离1520个氨基酸长度的肽类； 孔径30nm，适于分离中等分子量的球形蛋白质； 孔径100nm，适于分离较大的球形蛋白质或纤维状结构的化合物； 孔径400nm，适于分离很大分子量的蛋白质。,三氟乙酸(TFA ),在IEC中,高分子类型填料表现更大的优越性。大致有3类： 多糖基质的离子交换层析介质 聚合物基质的高效离子交换色谱填料 高聚物型离子交换色谱填料,五、离子交换HPLC填料 Ion exchange chromatography IE
9、C,1.多糖基质的离子交换层析介质 传统的多糖类软质凝胶制得强弱阴阳离子交换介质：具有很好亲水性和生物相容性； 高交联度多糖类凝胶填料：还适于较高压力和流速下操作。,2.聚合物基质的高效离子交换色谱填料 交联共聚的苯乙烯-二乙烯苯 聚甲基丙烯酸酯; 4-乙烯吡啶共聚物 特点：高交联大孔结构,良好的刚性和小而均匀的粒度,a.多孔树脂的IEC填料: 柱效、穿透性、分离度、负载量、回收率的性能优异 Mono Beads 系列：包括Mono Q, Mono S, Mono P SOURCE系列:15Q,15S,30Q,30S 贯流色谱填料POROS系列 羟基化聚醚凝胶：如TSK gel DEAE-5P
10、W,SP-5PW,CM-5PW等 交联聚甲基丙烯酸羟基乙酯:亲水,大孔,b.非多孔树脂的IEC填料: 羟基化聚醚,交联聚苯乙烯,交联聚甲基丙烯酸酯,交联琼脂糖等。优点:颗粒小,均匀,刚性好,色谱穿透性强,流速适应范围宽。避免了固相内的吸附与扩散，因此具有高柱效,高分离度和高样品回收率的特点。,c.薄壳型树脂的IEC填料: 优点:柱效高,选择性好,分离度高,穿透性好,回收高,流速快等,有机高分子类型的疏水HPLC填料 Hydrophobic interaction chromatography,HIC,HIC:填料表面具有弱疏水性,蛋白质的疏水基团与填料表面之间产生弱的疏水性相互作用。高浓度盐条
11、件下,蛋白质与疏水固定相的吸附能力高,随着盐浓度的下降,吸附能力下降。当淋洗液离子强度逐渐降低时,蛋白质样品按其疏水性的不同依次被洗脱。,常见淋洗液有(NH4)2SO4, NH4Ac, NaCl,磷酸盐等,其中(NH4)2SO4是最广泛应用的。 与RPC比较在原理上的区别及其优缺点?,六、疏水色谱HPLC填料,一般是亲水性基质,或在合成的非亲水性基质上连接一定的亲水基团，然后引入疏水性基团,主要有丁基、辛基、苯基等以及聚乙二醇。 其基质可以是多糖类,也可以是各类高分子多聚物,包括交联聚苯乙烯树脂、硅胶、羟基化聚醚树脂、交联甲基丙烯酸酯类。 HIC填料绝大多数是多孔结构,主要是超大孔结构，也可以
12、是非多孔结构的。 P206表10-4,七、有机高分子类型的空间排阻HPLC填料 Size exclusion chromatography, SEC,SEC填料特征： 填料的性质必须与溶质和淋洗体系相匹配,可以被淋洗剂所浸润； 填料和试样尽可能不发生任何基团之间的相互作用,即尽可能避免非空间排阻效应； 填料的多孔结构是SEC建立的基础；,SEC填料的色谱特征：除了柱效,选择性,分离度,穿透性等一般色谱表征外,尚需要满足以下指标： 排阻极限; 分离范围; 固流相比,凝胶填料主要类型,多糖类 传统的软质凝胶:葡聚糖,琼脂糖,聚丙烯酰胺型凝胶 高交联的多糖类凝胶:Superdex,Superose, Sephacryl, Sepharose CL 高聚物型 多孔交联聚甲基丙烯酸酯类树脂,交联聚乙烯醇树脂,亲水化处理的交联聚苯乙烯树脂,羟基化聚醚类.(表10-7 P213),凝胶渗透色谱 Gel permeation chromatography, GPC,有机溶济为流动相 THF四氢呋喃,有机高分子类型生物亲和HPLC填料 Affinity chromatography, AFC,优点:高选择性,能有效保持生物分子的高级结构稳定性,活性样品的回收率。 按其基质不同分:多糖型和高聚物型。 按其所带配体对被分离物质的选择性特征可分为通用型和专用型。,
