1、主讲教师：肖 小 华,实验学时：6 学时,实验名称：微波辅助提取-高效液相色谱法测定蔬果中的维生素C含量,实验目的、内容及要求,高效液相色谱简介,HPLC的使用与维护,High Performance Liquid Chromatography,一、高效液相色谱法,历史回顾； 基本原理与概念； HPLC定性与定量方法； HPLC仪器组成。,一、历史回顾,色谱法早在1903年由俄国植物学家茨维特分离植物色素时采用；,40年代，TLC，纸色谱，柱层析； 50年代，GC出现使色谱具备分离和在线分析功能； 60年代末 HPLC出现，使色谱分析范围进一步扩大；,1新型固定相和检测器 2联用仪器：GC-M
2、S，HPLC-MS 3智能化发展,1937-1972年，35年中有12个Nobel奖是与色谱研究相关的！,固定相CaCO3颗粒 流动相石油醚,色谱（Chromatography）一词来源于希腊语中 “chroma”=color; “graphein”=write,二、基本原理,当流动相中携带的混合物流经固定相时，与固定相发生相互作用。由于混合物中各组分在性质和结构上的差异，与固定相之间产生的作用力的大小、强弱不同，随着流动相的移动，混合物在两相间经过反复多次的分配平衡，各组分被固定相保留的时间不同，从而按一定次序由固定相中流出。,与适当的柱后检测方法结合，实现混合物中各组分的分离与检测；两相及
3、两相的相对运动构成了色谱法的基础。,色谱法分类1按两相分子的聚集状态分：,2按固定相的固定方式分：,3按分离机制分：,优点：“三高”、“一快”、“一广”,缺点：,一些基本概念,1. 分配系数(partition factor) K,组分在固定相和流动相间发生的吸附、脱附，或溶解、挥发的过程叫做分配过程。在一定温度下，组分在两相间分配达到平衡时的浓度比，称为分配系数，用K 表示，即：,分配系数是色谱分离的依据。,2. 分配比 (partition radio) k,是指在一定温度下，组分在两相间分配达到平衡时的质量比。在实际工作中，常用来表征色谱分配平衡过程。,1、分配系数与分配比都是与组分及固
4、定相的热力学性质有关的常数，随分离柱温度、柱压的改变而变化；2、分配系数与分配比都是衡量色谱柱对组分保留能力的参数，数值越大，该组分的保留时间越长；3、分配比可以由实验测得。,分配比也称：容量因子(capacity factor) 或 容量比,容量因子与分配系数的关系,式中为相比。容量因子越大，保留时间越长；VM为流动相体积，即柱内固定相颗粒间的空隙体积；VS为固定相体积，对不同类型色谱柱， VS的含义不同；气-液色谱柱： VS为固定液体积；气-固色谱柱： VS为吸附剂表面容量；,分配比与保留时间的关系,保留因子(retention factor)：,us：组分在分离柱内的线速度；u：流动相在
5、分离柱内的线速度；保留因子RS也可以用质量分数表示：,若组分和流动相通过长度为L的分离柱，需要的时间分别为tR和tM，则：,由以上各式，可得： tR = tM(1+k),3. 色谱流出曲线（色谱图）,混合组分的分离过程及检测器对各组份在不同阶段的响应,关于色谱图的几个基本术语,1、基线无试样通过检测器时，检测到的信号即为基线。2、保留值,保留时间（tR）：组分从进样到柱后出现浓度极大值时所需的时间；,死时间（tM）：不与固定相作用的气体或液体的保留时间；调整保留时间(tR)：tR= tRtM,也可用体积表示，对应为保留体积、死体积和调整保留体积,3、相对保留值r21,组分2与组分1调整保留值之
6、比：r21 = tR2 / tR1= VR2 / VR1,相对保留值只与柱温和固定相性质有关，与其他色谱操作条件无关，它表示了固定相对这两种组分的选择性。,色谱流出曲线的意义：色谱峰数=样品中单组份的最少个数；色谱保留值定性依据；色谱峰高或面积定量依据；色谱保留值或区域宽度色谱柱分离效能评价指标；色谱峰间距固定相或流动相选择是否合适的依据。,4、区域宽度,用来衡量色谱峰宽度的参数，有三种表示方法： （1）标准偏差()：即0.607倍峰高处色谱峰宽度的一半。 （2）半峰宽(W1/2)：色谱峰高一半处的宽度 W1/2 =2.354 （3）峰底宽(Wb)：Wb=4 ,5. 分离度(Resolutio
7、n, R),同时反映色谱柱效能和选择性的一个综合指标。也称总分离效能指标或分辨率。其定义为：,利用此式，可直接从色谱流出曲线上求出分离度R。,R 越大，相邻组分分离越好。当R=1.5时，分离程度可达99.7%，因此R=1.5通常用作是否分开的判据。,三、HPLC定性与定量,1、定性方法a、保留时间b、与结构表征的检测器联用,2、定量方法a、峰高与峰面积b、外标法c、内标法,四、HPLC仪器组成,早期液相色谱，包括Tswett的工作，都是在直径15cm, 长50500cm的玻璃柱中进行的。为保证有一定的柱流速，填充的固定相颗粒直径多在150200 m范围内。即使这样，流速仍然很低(1 mL/mi
8、n)，分析时间仍然很长！当加压增加流速(真空或空气泵)时，尽管分析时间减少，但柱塔板高度H min也相应增加了！或者说柱效下降了。为了解决分析时间及柱效问题，最为有效地增加柱效的唯一方法是减小填充物的粒径（310 m ）！,粒径减小，液体流过所需压力增大-高压装置,分析对象及范围：GC分析只限于气体和低沸点的稳定化合物，这些物质占有机物总数的20%；HPLC可以分析高沸点、高分子量的稳定或不稳定化合物，这类物质占有机物总数的80%。 流动相的选择：GC采用的流动相中为有限的几种“惰性”气体，只起运载作用，对组分作用小；HPLC采用的流动相为液体或各种液体的混合，可供选择的机会多。它除了起运载作
9、用外，还可与组分作用，并与固定相对组分的作用产生竞争，即流动相对分离的贡献很大，可通过溶剂来控制和改进分离。 操作温度：GC需高温；HPLC通常在室温下进行。,HPLC与GC的比较,1. 仪器结构,HPLC仪器包括：高压输液装置;进样系统;分离系统;检测系统;此外还配有梯度淋洗、自动进样和数据处理装置。,2、主要部件,(1) 高压输液泵 主要部件之一，压力：150350105 Pa。 为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（10m），液体的流动相高速通过时，将产生很高的压力，因此高压、高速是高效液相色谱的特点之一。 应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特性,(2)梯度淋洗装置,外梯度:
10、 利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室，混合后进入色谱柱。,内梯度:一台高压泵, 通过比例调节阀,将两种或多种不同极性的溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合。,(3) 进样装置,包括自动进样和手动进样装置；流路中为高压力工作状态； 通常使用耐高压的六通阀进样装置,其结构如图：,(4) 色谱分离柱,柱体为直型不锈钢管，常规内径16 mm，柱长540 cm。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。,(5) 液相色谱检测器,a. 紫外检测器 应用最广，对大部分有机化合物有响应。特点：灵敏度高；线性范围宽；流通池小（1 mm 10 mm ，容积 8 L）；对流动相的流速和温度
11、变化不敏感；波长可选，易于操作；可用于梯度洗脱。,b. 光电二极管阵列检测器,紫外检测器的重要进展 光电二极管阵列检测器：1024个二极管阵列，各检测特定波长，计算机快速处理，三维立体谱图。,c. 示差折光检测器,除紫外检测器之外应用最多的检测器；可连续检测参比池和样品池中流动相之间的折光指数差值。差值与浓度呈正比；,通用型检测器（每种物质具有不同折光指数） 灵敏度低、对温度敏感、不能用于梯度洗脱偏转式、反射式和干涉型三种,二、HPLC使用与基本维护,a) 色谱柱,是液相色谱分析的核心组件； 根据分析对象的性质选取合适的色谱柱，如正相色谱柱、反相色谱柱、离子交换色谱柱等；,正相色谱：流动相极性
12、小于固定相极性，极性小的先流出，适于极性组分分离；如硅胶柱、羟基、氰基等。 反相色谱：流动相极性大于固定相极性，极性大的先流出，适于非极性组分分离；如烷基键合硅胶柱C8、C18等。,1-方法建立,正相色谱和反相色谱出峰顺序相反,时间，min,硅胶-烷基键合相中烷基链长对反相色谱分离的影响 1-尿嘧啶；2-苯酚；3-乙酰苯；4-硝基苯；5-苯甲酸甲酯；6-甲苯,可见：反相键合色谱中，键合相碳链越长，分离效果越好。,b) 流动相,按流动相组成分：单组分和多组分； 按极性分：极性、弱极性、非极性； 按使用方式分：固定组成淋洗和梯度淋洗。 常用溶剂： 己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。采
13、用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。,在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据。采用正相液-液分配分离时：首先选择中等极性溶剂，若组分的保留时间太短，降低溶剂极性，反之增加。也可在低极性溶剂中，逐渐增加其中的极性溶剂，使保留时间缩短。 常用溶剂的极性顺序：水(最大) 甲酰胺 乙腈 甲醇 乙醇 丙醇 丙酮 二氧六环 四氢呋喃 甲乙酮 正丁醇 乙酸乙酯 乙醚 异丙醚 二氯甲烷氯仿溴乙烷苯四氯化碳二硫化碳环己烷己烷煤油(最小),选择流动相时应注意的几个问题,（1）尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。,
14、（2）避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶剂破坏氧化铝固定相等。,（3）试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉淀并在柱中沉积。,（4）流动相同时还应满足检测器的要求。当使用紫外检测器时，流动相不应有紫外吸收。,溶剂(流动相)组成对色谱分离的影响,1：9,10-蒽醌；2：2-甲基-9,10-蒽醌；3：2-乙基-9,10-蒽醌；4：1,4-二甲基-9,10-蒽醌；5：2-特丁基甲基-9,10-蒽醌；,70%CH3OH +30H2O,60%CH3OH +40H2O,50%CH3OH +50H2O,40%CH3OH +60H2O,由于分析物组成复杂，以某一组
15、成的流动相可能使部分待测物得到好的分离，但同时出使其它待测物的分离不令人满意！实际工作中采用程序升温（GC）和梯度淋洗（LC）来解决这个问题。,色谱分离中的问题-梯度洗脱,2-简单维护,1、 为什么溶剂和样品要过滤? 溶剂和样品过滤非常重要，它会对色谱柱、仪器起到保护作用，消除由于污染对分析结果的影响。 色谱柱：由于填料颗粒很细，色谱柱内腔很小，溶剂和样品中的细小颗粒会使色谱柱和毛细管容易堵塞。 仪器：溶剂和样品中的细小颗粒会增加进样阀的堵塞和磨损，同时也会增加泵头内的蓝宝石活塞杆和活塞的磨损。,样品过滤头的类型： 30 mm内径：适用于大进样量的过滤，材料有纤维素,醋酸纤维，聚四氟乙烯。处理
16、样品体积少于50 L。 13 mm内径：适用于范围广的过滤，材料为纤维素。 3 mm内径：适用于小进样量的过滤，处理样品体积为7 L。滤膜类型： 聚四氟乙烯滤膜：适用于所有溶剂，酸和盐，并无任何可溶物。 醋酸纤维滤膜：不适用于有机溶剂；适用于水溶液。 尼龙66滤膜：适用于绝大多数有机溶剂和水溶液，可用于强酸，70%乙醇、二氯甲烷、不适用于二甲基甲酰胺。 再生纤维素滤膜：具有蛋白吸收低，同样适用水溶性样品和有机溶剂。,2、 流动相使用前为什么要脱气？流动相使用前必须进行脱气处理 ，以除去其中溶解的气体（如O2），防止在洗脱过程中当流动相由色谱柱流至检测器时，因压力降低而产生气泡。气泡会增加基线的
17、噪音，造成灵敏度下降，甚至无法分析。溶解的氧气还会导致样品中某些组份被氧化，柱中固定相发生降解而改变柱的分离性能。若用FLD，可能会造成荧光猝灭。 常用的脱气方法有： 氦气脱气法：利用氦气的溶解度比空气低，连续吹氦脱气，效果较好，但成本高。 加热回流法：效果较好，但操作复杂，且有毒性挥发污染。 抽真空脱气法：易抽走有机相。 超声脱气法：流动相用超声波振荡10-15 min，此法效果最差。 在线真空脱气法：利用膜渗透技术， 在线脱气，智能控制，无需额外操作，成本低，脱气效果明显优于以上几种方法，并适用于多元溶剂体系。,3、如何防止溶剂瓶内溶剂过滤器的堵塞及堵塞后的处理 溶剂的污染以及藻类的生长会
18、堵塞溶剂过滤器，从而影响泵的运行，尤其水溶液或磷酸盐缓冲液（pH = 4-7）。以下几种方法可以有效防止溶剂瓶内溶剂过滤器的堵塞。 A：严格执行溶剂过滤。 B：勿使用多日存放的蒸馏水及磷酸盐缓冲液 C：如果应用许可，可在溶剂中加入0.0001-0.001M的叠氮化钠. D: 在溶剂瓶内溶剂的上方小流量连续吹氩气，隔绝空气。 E： 避免使溶剂瓶暴露在直射阳光下，尽量使用琥珀色的溶剂瓶盛放水溶液或磷酸盐缓冲液。 堵塞后的处理法方法： 将过滤头从组件中取下，在硝酸（10%-35%）中浸泡1 h，然后用二次蒸馏水冲洗干净并超声处理。,三、高效液相色谱实验,实验目的； 实验内容； 实验要求。,1.实验目的,1、掌握高效液相色谱法（HPLC）的基本原理和仪器结构； 2、熟悉HPLC方法建立； 3、了解HPLC的发展和应用趋势。,2.实验内容,微波辅助萃取（MAE）,实际样品测定,Vc的标准曲线绘制,2.实验要求,预习：回答What? Why? How?随机提问方式； 蔬果样品可自备； 迟到必究； 善始善终完成实验。,实验成绩：预习10%+实验40%+报告30%+考试20%,谢 谢！,
