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类型凝胶层析法.ppt

  • 上传人:HR专家
  • 文档编号:6628649
  • 上传时间:2019-04-18
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    1、第七章 凝胶层析(色谱) (Gel chromatography),1,凝胶层析(gel chromatography)也称:分子筛层析分子排阻层析凝胶过滤凝胶色谱等,是指混合物随流动相经过凝胶层析柱时,由于各组分流经体积的差异,使不同分子量的组分得以分离的层析方法。,简介 凝胶色谱是以各种多孔性凝胶填料为固定相,利用流动相中所含各种组分的相对分子质量不同而达到物质分离的一种技术。突出优点是:凝胶不带电荷、吸附力弱、不需再生处理可反复使用、操作条件温和、对分离成分不变性和破坏、对高分子物质有很好的分离效果。,4,第一节 凝胶层析的基本原理,凝胶层析的分离过程是在装有多孔物质填料的柱中进行的。柱

    2、的总体积为VA,它包括填料的骨架体积VGM,填料的孔体积Vi(内水体积)以及填料颗粒之间的体积V0(外水体积)。 VA=Vi+V0+VGM,1、外水体积:指凝胶柱中凝胶颗粒周围空间的体积,即凝胶颗粒间液体流动相的体积。(用Vo表示)2、内水体积:指凝胶颗粒中孔穴的体积,即凝胶层析中固定相体积。(用Vi表示)3、骨架体积:指凝胶颗粒实际骨架体积。(用VGM表示)4、柱的总体积:指凝胶柱所能容纳的总体积。(用VA表示)5、洗脱体积:指将样品中某一组分洗脱下来所需洗脱液的体积。(用Ve 表示),则: Vt=Vo+Vi+Vg,流动相体积,固定相体积,总体积,7,8,原理,当具有一定分子量分布的高聚物溶

    3、液从柱中通过时,较小的分子在柱中停留时间比大分子停留的时间要长,于是样品各组分即按分子大小顺序而分开,最先淋出的是最大的分子。Ve=V0+Vi Kd,1、比孔穴孔径大的分子不能扩散到孔穴内部,完全被排阻在孔外,只能在凝胶颗粒外的空间随流动相向下流动,它们经历的流程短,流动速度快,所以首先流出;2、较小的分子则可以完全渗透进入凝胶颗粒内部,经历的流程长,流动速度慢,所以最后流出;3、分子大小介于二者之间的分子在流动中部分渗透,渗透的程度取决于它们分子的大小,所以它们流出的时间介于二者之间。,也叫凝胶过滤层析,凝胶过滤层析过程示意图,小分子,大分子,凝胶基质,凝胶珠,分子越大的组分越先流出,分子越

    4、小的组分越后流出。这样样品经过凝胶层析后,各个组分便按分子从大到小的顺序依次流出,从而达到了分离的目的。,13,(一)平衡排除理论,当溶质层流过一个填料颗料这段距离时,溶质分子已多次进出于填料的孔,达到平衡。 平衡条件只是在流速很慢时的一个极端情况。,14,(二)扩散分离理论,溶质分子在流经色谱柱的过程中,在流动相和固定相之间没有达到平衡,存在着流速依赖性。,聚苯乙烯和苯乙烯样品淋出曲线的流速依赖性 1流速为0.65ml/min; 2流速为2.0ml/min溶剂为甲苯,15,(三)流动分离理论,红细胞在毛血细管中流动时比血浆流得快。 较大的分子较先通过或绕过这个填料颗粒,使溶质能按其大小进行分

    5、离。,16,分离过程,三种不同分子量物质的混合样品用某种规格的凝胶柱进行分离。 样品加入,以水或其他溶液进行洗脱,即得洗脱曲线 。,17,分离过程,最先流出物质A,A分子量最大,完全不能进入颗粒内部,只能从颗粒间隙流过, “全排阻”。其流经体积最小,等于外水体积V0。最后流出物质C,它分子量最小,其分子可以自由进出凝胶颗粒, “全渗入”。流经体积是外水体积与内水体积之和V0+Vi。物质B分子量介于渗入限与排阻限之间,其分子能够部分地进入凝胶颗粒中。 “部分排阻”或“部分渗入”。流径体积Ve是全部外水体积加上内水体积的一部分,即Ve=V0+KdVi,18,分配系数Kd,排阻系数:当Kd=1时,洗

    6、脱体积Ve=V0+Vi,为全渗入。 当Kd=0时,洗脱体积Ve=V0,为全排阻。 0Kd1时,洗脱体积Ve=Vo+KdVi,为部分渗入。,19,物质的Kd值,20,凝胶层析的特点,(1)凝胶层析操作简便,所需设备简单。 (2)分离效果较好,重复性高。 (3)分离条件缓和。 (4)应用广泛。 (5)分辨率不高,分离操作较慢。,21,第二节 凝胶的结构和性质,一、葡聚糖凝胶 (Sephadex) 二、修饰葡聚糖凝胶 (Modified Sephadex) 三、聚丙烯酰胺凝胶 (Bio-Gel P) 四、琼脂糖类凝胶 (Sepharose ) 五、多孔玻璃微球 (Bio-glas) 六、疏水性凝胶(

    7、hydrophobic gels),22,一、葡聚糖凝胶 (Sephadex),商品名为Sephadex G类。 交联葡聚糖的基本骨架是葡聚糖。 再经3-氯-1,2-环氧丙烷为交联剂,形成三维网状结构的高分子化合物。 其交联度是通过交联剂的加量及反应条件来控制的。,交联葡聚糖凝胶的化学结构,葡聚糖凝胶网孔大小可通过调节交联剂和葡聚糖的配比及反应条件来控制。交联度越大,网孔越小,吸水膨胀就越小。交联度越小,网孔越大,吸水膨胀就越大 。,G类葡聚糖凝胶常用G-X代表,X数字既代表交联度,也代表特水量。X数字越小,交联度越大,网孔越小,适用于分离低分子质量生化产品。X数字越大,交联度越小,网孔越大,

    8、适用于分离高分子生化产品。X数字也代表凝胶的持水量,如G-25表示1g干胶持水2.5mL,G-100表示 1g干胶持水10mL,依次类推。,25,Sephadex G,编号意义:1、吸液量;2、溶涨时间;3、凝胶孔径;4、分离范围蛋白质、多糖,26,葡聚糖凝胶性能与编号的关系,27,葡聚糖凝胶(G类)的规格,28,葡聚糖凝胶(G类)特点,1、孔径。 2、稳定性。 3、吸附作用。 4、芳香族化合物和杂环化合物。,1、Sephadex在水、盐、碱、弱酸以及有机溶液中都比较稳定,可以多次重复使用。2、稳定工作pH为210,强酸溶液和氧化剂会使交联的糖苷键水解断裂。3、在高温下稳定,可煮沸消毒,在10

    9、0 C下40 min对凝胶的结构和性能都没有明显的影响。,性质与特点,4、含有羟基,呈弱酸性,有可能与分离物中的一些带电基团(尤其是碱性蛋白)发生吸附作用。但一般在离子强度大于0.05的条件下,几乎没有吸附作用。5、有各种颗粒大小(粗、中、细、超细)可以选择,一般粗颗粒流速快,但分辨率较差;细颗粒流速慢,但分辨率高。6、机械稳定性相对较差,不耐压,分辨率高的细颗粒要求流速较慢,所以不能实现快速而高效的分离。,31,保存,保存的方法有干法、湿法和半缩法三种。 湿法:加入一定量的防腐剂置于冰箱中作短期保存(6个月以内)。 常用0.02%叠氮化钠、0.02%三氯叔丁醇、20%乙醇等。 干法:用浓度逐

    10、渐升高的乙醇分步处理洗净的凝胶,脱水收缩,抽滤,用6080吹干。 半缩法:,32,二、修饰葡聚糖凝胶 (Modified Sephadex),(一)亲脂性葡聚糖凝胶(Lipophilic Sephadex)骨架结构上引入一些有机基团,如甲基、羟丙基,使呈亲脂性,同时保留亲水性。这种凝胶既亲脂又亲水,可在多种有机溶剂中膨胀。这种凝胶在pH2的不含氧化剂的溶液中稳定。用低级醇为溶剂时,对芳香族、杂环族化合物仍有吸附作用。但用氯仿时则可去除对上述化合物的吸附作用,而对含羟基与羧基的化合物却有吸附作用 。,国产Sephadex LH20可用于分子筛层析、吸附层析和分配层析。很适用于脂肪酸、甘油脂、类固

    11、醇、维生素、激素类生化产品的分离。洗脱剂可用单一有机溶剂如甲醇、氯仿等,也可用混合溶剂如氯仿与甲醇的混合液。,(二)葡聚糖凝胶离子交换剂,在G类凝胶上引入一些酸性或碱性基团后,则制得各种葡聚糖凝胶离子交换剂 。,如引入磺乙基(SE-Sephadex)、羧甲基(CM-Sephadex)及二乙胺基乙基(DEAE-Sephadex A)等。葡聚糖凝胶离子交换剂具有离子交换和分子筛双重作用。其结构多孔、疏松、非特异性吸附很少,层析时流速易控制,特别适用于蛋白质、酶、激素、多核苷酸等的分离纯化,以及生化制剂的除热原。,35,交联葡聚糖离子交换剂,36,(三)Supperdex系凝胶 由高交联度多孔琼脂糖

    12、与葡聚糖共价结合而成。 (四)Sephacryl系凝胶 是由烯丙烷基葡聚糖经甲叉双丙烯酰胺共价交联制成的。 理化稳定性好,为硬性凝胶,可耐高压灭菌。,37,Supperdex系凝胶,38,Sephacryl系凝胶,39,三、聚丙烯酰胺凝胶,商品名为生物凝胶-P(Bio-Gel P)。 该凝胶由丙烯酰胺组成;以亚甲基双丙烯酰胺为交联剂,聚合而成。只要控制单体用量和交联剂的比例,就能得到不同型号的凝胶。特点:1、孔径;2、稳定性、强度;3、无非特异吸附,保存方便;4、编号反映出它的分离界限。,在聚丙烯酰胺凝胶的合成过程中,单体和交联剂的配比可以任意改变。以(T)代表100mL凝胶溶液中含有的单体和

    13、交联剂总克数,称为凝胶浓度。而其中交联剂占单体和交联剂总量的百分比称为交联度,以(C)表示,交联度越大,网孔越小,交联度越小,则网孔越大。聚丙烯酰胺凝胶全是由碳一碳骨架构成,稳定性较好,适合于做凝胶层析的载体。只有在极端pH条件下酰胺键才被水解为羧基,使凝胶带有一定的离子交换基团,故一般只在pH211的范围内使用。,像Sephadex一样,商品聚丙烯酰胺为颗粒状的干粉,它有十分明显形成块状并粘附在一起的倾向,在溶剂中能自动溶胀成胶。,根据聚丙烯酰胺凝胶的溶胀性质和分离范围的不同,可分成10种类型。各种类型均以英文字母P和阿拉伯数字表示,从Bio-Gel P-2至Bio-Ge1 P-300。P后

    14、面的阿拉伯数字乘以1000即相当于排阻限度(按球蛋白或肽计算)。目前,美国Bio-Rad Laboratories生产并出售多种规格的Bio-Gel P。,42,聚丙烯酰胺凝胶的性质,生物凝胶的编号反映出它的分离界限。 如Bio-Gel P-100。,43,四、琼脂糖类凝胶 (Sepharose ),(一)琼脂糖凝胶 结构是由-D-半乳糖与3,6-脱水-L-半乳糖以-1,3-和-1,4-糖苷键相间连接而成的链状分子。,Sepharose,琼脂糖凝胶(agarose gel)可以分离葡聚糖凝胶和生物胶所不能分离的大分子,使凝胶层析的分离区间扩大到大分子和病毒颗粒,其最大范围可达相对分子质量108

    15、,但是由于琼脂有强烈的吸附作用,给使用造成了困难,后来,从琼脂中分离出两个组分,一个组分为带负电荷的琼脂果胶,含有磺酸基和羧基;另一组分叫琼脂糖,它不含有带电基团,其结构是有-D-吡喃半乳糖和3,6脱水-L-吡喃半乳糖相结合的链状多糖。,这种琼脂糖被用来进行凝胶层析,它既具有琼脂凝胶相同的分离区间,又没有吸附作用。但其稳定性远不如葡聚糖凝胶和生物胶P,强酸强碱能引起结构破坏。最好使用条件控制在pH 49之间,温度040,超出此范围,可能被破坏。,46,琼脂糖凝胶特点:,1、没有共价键的交联。 2、孔径依赖于琼脂糖的浓度。 3、琼脂糖凝胶的化学稳定性较差。 4、非特异性吸附力低。 5、分离范围大

    16、。 6、颗粒强度差。,琼脂糖的商品名称有:Sepharose(瑞典)Bio-gel A(美国)Segavac(英国)Gelarose(丹麦)等多种,因生产厂家不同名称各异。,琼脂糖凝胶是由琼脂中分离出来的天然凝胶。它的商品名因生产厂家不同而异。,瑞典的商品名称为Sepharose,有3种型号,即Sepharose 2B,4B和6B(同中国相同)。阿拉伯数字表示凝胶中干胶的百分含量。,美国的为BioGA,有6个型号,即Bio-G 0.5M,1.5M,5M,15M,50M和150M。阿拉伯数字乘以106表示排阻限度。,。,英国的称为Sagavac,又分为Sagavac 2F,4F,6F,8F,10

    17、F和2C,4C,6C,8C,10C。前面的阿拉伯数字表示凝胶中干胶的百分数,F代表粉末状,C代表颗粒状。,丹麦的称为Gelarose,有5种类型,即2,4,6%,8和10。,琼脂糖凝胶做成珠状后不再脱水干燥,否则不能再溶胀恢复原有形状,因此商品大都以含水状态供应,并应在湿态保存。一般悬浮在l0-3 mo1/L EDTA和0.02%叠氮化钠溶液中。百分数表示干胶量。,51,琼脂糖凝胶分离范围,琼脂糖凝胶有3个规格:Sepharose2B、4B、6B分别表示琼脂糖浓度为2%,4%,6%。,52,几种蛋白质Kav值,53,(二)架桥琼脂糖凝胶(Sepharose CL),架桥琼脂糖凝胶为琼脂线性分子

    18、经1,3-二溴丙醇交联的凝胶。它的凝胶孔径均匀,机械强度明显加大。对热和化学物质的稳定性大大增加,在pH314范围内稳定。,54,Sepharose CL的性质,55,(三)超胶(Utro-gel ACA),所谓超胶是琼脂糖与聚丙烯酰胺的混合凝胶。 商品名称后面的编号为两位数,各表示混合胶中聚丙烯酰胺与琼脂糖的百分浓度。,56,(四) Superose系凝胶,是由珠状琼脂糖经两次交联制得的可用于HPLC的高速凝胶过滤介质。 有6%和12%两个规格。,57,五、多孔玻璃微球(Bio-glas),特点:1、化学稳定性高、强度大。2、对糖类、蛋白质等物质有吸附作用。3、编号表示其孔径, 越大,分离分

    19、子量也越大。,58,六、疏水性凝胶(hydrophobic gels),常见的有:聚甲基丙烯酸酯凝胶和聚苯乙烯凝胶。Styragel商品, 分离范围为1 60040 000 000。生物珠(Bio-Bead S),适于分离分子量较小的物质。 分离不溶水的有机物质。,59,常用的商品化凝胶介质,60,一,第三节 凝胶层析的实验条件和操作,61,62,凝胶层析的实验条件和操作,一、凝胶的选择和处理 二、凝胶层析柱的设计和制备 三、凝胶层析操作 四、主要参数测算,63,一、凝胶的选择和处理,(一)凝胶的选择选择适宜的凝胶是取得良好分离效果的最根本的保证。选取何种凝胶及其型号、粒度,一方面要考虑凝胶的

    20、性质,包括凝胶的分离范围(渗入限与排阻限)还有它的理化稳定性、强度、非特异吸附性质等;另一方面还要注意到分离目的和样品的性质。,凝胶粒度的大小对分离效果有直接的影响。般来说,细粒凝胶柱流速低,但洗脱峰窄,分辨率高,多用于精制分离或分析等。粗粒凝胶柱流速高,但洗脱峰平坦,分辨率低,多用于粗制分离,脱盐等。下图表示在同一流速下不同粒度的Sephadex G-25柱的洗脱效果。,凝胶粒度与洗脱效果的关系图,对生物样品来说,经常遇到的是两种分离形式。一种是只将分子量极为悬殊的两类物质分开,如蛋白质与盐类,称作类分离或组分离。另一类则是要将分子量相差不很大的大分子物质加以分离,如分离血清球蛋白与白蛋白,

    21、这叫做分级分离。后者对实验条件和操作要求都比较高。下面以最常用的葡聚糖凝胶类为例,分别加以讨论 。,66,将分子量极为悬殊的两类物质分开,如蛋白质与盐类,称作类分离或组分离。将分子量相差不大的大分子物质加以分离,如分离血清球蛋白与白蛋白,这叫做分级分离。,1类分离,目的是分开样品中分子量悬殊的“较大分子组”和“较小分子组”两类物质,并不要求分离分子量相近的组分。,选择凝胶时,应使样品中大分子组的分子量大于其排阻限,而小分子组的分子量小于渗入限。也就是说大分子的分配系数Kd= 0,小分子的Kd1。这样能取得最好的分离效果。,例如从蛋白质溶液中除去无机盐。我们知道,蛋白质的分子量都大于5000D,

    22、而无机盐的分子量一般在几十到几百之间。所以常选用Sephadex G-25凝胶作为分离固定相,因为它的分离范围是10005000D。被分离的两组物质的分子量正好落在分离范围的两侧。大分子组为全排阻,而小分子组为全渗入,其Kd值的差可达最大值1。对于分子量小于5000D的肽类进行脱盐操作则常选用Sephadex G-15凝胶。,69,1类分离,(1)使大分子的分配系数Kd=0; (2)小分子的Kd=1。选用Sephadex G-25凝胶,分离范围1 0005 000。,2分级分离,目的是分开分子量不很悬殊的大分子物质。选择凝胶型号时必须使各种物质的Kd值尽可能相差大一些。为此,首先决不能使它们的

    23、分子量都分布在凝胶分离范围的一侧,也就是Kd不要都接近于0或1,而要使组分的分子量尽可能分布在凝胶分离范围的两侧,或接近两侧的位置。如果样品中含有3个组分的话,最好一个接近全排阻,另一个接近全渗入,第三个为部分渗入,且分子量大于渗入限的3倍,并小于排阻限的13。,因为分子量如与渗入限比较靠近,该组分分子在凝胶颗粒中运动所受的约束很小,不易与低分子组分分开。如分子量与排阻限比较靠近则不易与高分子组分分开。如用Sephadex G-200分离血清蛋白质的效果要比Sephadex G-150为好。但也有人选用G-150,那是因为G-200强度太低不便操作的缘故(见下图)。,不同分离范围的葡聚糖凝胶上

    24、,血清蛋白的层析图,73,2分级分离,(1)使各种物质的Kd值尽可能相差大。 (2)不使分子量分布在凝胶分离范围的一侧。 (3)分子量大于渗入限的3倍,并小于排阻限的1/3。 如用Sephadex G-200分离血清蛋白质的效果要比Sephadex G-150为好。,74,(二)凝胶粒度的选择,细粒凝胶柱流速低,洗脱峰窄,分辨率高,用于精制分离或分析。粗粒凝胶柱流速高,洗脱峰平坦,分辨率低,用于粗制分离,脱盐。,凝胶颗粒大小一般分为粗、中、细和超细四类。颗粒越细,分离效果越好,因为它容易达到平衡,但流速慢。颗粒越粗,流速越快,会使区带扩散,使洗脱峰变平变宽。在一般柱层析中,使用干颗粒直径在70

    25、m左右较合适。对于在水中保存的凝胶如琼脂粉凝胶颗粒直径应在150m左右。凝胶颗粒大小要均匀,这样流速稳定,效果较好。,76,(三)凝胶的预处理,使用前须溶涨,使干胶颗粒充分吸收溶剂,并达到平衡。干胶以10倍以上吸液量的溶剂浸泡。 热法溶涨(水浴中加热溶胀)。,葡聚糖凝胶和生物胶多以干粉形式保存,使用前需用水或洗脱缓冲液充分溶账。在室温下让其充分溶账胀达到平衡,通常需要较长时间。较快的做法是将干胶往水里加,边加边搅,以防凝胶结块,然后放到沸水浴中加热接近100,几个小时就可以使其溶胀,还可起到除去颗粒内部气泡和杀菌作用。,78,二、凝胶层析柱的设计和制备,(一)层析柱的选择 层析柱长度与直径的比

    26、值称作“柱比”。对于类分离,柱床体积一般为样品溶液体积的5倍,柱比5:1到10:1即可。对于分级分离,则要求柱床体积大于样品体积25倍以上,甚至多达100倍。柱比在25至100之间。,79,凝胶柱床大小与所需凝胶量的关系,80,(二)凝胶柱的装填,常用的支持物有棉花、玻璃纤维、玻璃珠、垂熔玻璃等。空柱中应留约1/5的水或溶剂。不断搅拌下使胶粒均匀沉降,使不发生凝胶分层和胶面倾斜。,一般选用细长的柱作凝胶过滤。进行脱盐时,柱高50cm比较合适;分级分离时,100cm就足够了。,一般是在柱内先装入约1/3高度的水或缓冲液,然后将溶胀好的凝胶在搅拌成稀浆的情况下慢慢倒入柱内,使其自然沉降。如此连续操

    27、作,可以得到一个均匀的柱床。柱装得不好往往造成洗脱区带加宽,甚至使一些本来可以分开的区带重叠。如装柱时的操作压力太大,会使凝胶床压得太实,从而降低流速。,层析柱(a)自制简易层祈柱(1玻璃管;2.橡皮塞;3尼龙网);(b)普通商品柱;(c)双底板层析柱(1.洗脱液进出口;2.多孔底板;3柱床;4恒温水进口;5恒温水出口;6可调节的塞子),层析系统连接示意图 1密封橡皮塞;2恒压管;3.恒压瓶;4.层析流出液;5可调螺旋夹;6.自动收集器; 7.核酸一蛋白质检测仪,BS100自动部分收集器安装圈 1反全阀;2.换管臂;3.滴管;4、5.换管臂固定螺丝;6.竖杆;7.竖杆囤定螺丝;8.报警板;9.

    28、试管;10收集盘;11.时间选挥旋钮;12.时间选择固定螺钉;13.自动开关;14.指示灯;15.电源开关;16换向开关(逆、顺);17手动开关,85,(三)凝胶床的检查和维护,观察有无凝胶分层、沟流和气泡等现象。有色物质溶液过柱,观察柱床有无沟流,色带是否平整。 检查物质为蓝色葡聚糖。,新柱装好后,要用洗脱缓冲液平衡,一般用35倍体积的缓冲液在恒压下流过柱床。,新装好的柱要检验其均匀性可用带色的高分子物质如蓝色葡聚糖-2000配成2mg/mL的溶液过柱,观察色带是否均匀下降。也可以对光检查,看其是否均匀或有无气泡存在。,87,操作压,层析柱由于进出口之间液位压力差形成的对凝胶颗粒的压力称作“

    29、操作压”。,88,层析床横截面所允许的最大压力,89,三、凝胶层析操作,(一)样品和加样 蛋白质类样品浓度:不大于4%。加样时应尽量减少样品的稀释,及凝胶床面的搅动。,样品粘度对洗脱曲线的影响 柱:交联葡聚糖G-25,485cm; 流速180ml/h; 样品:0.1%血红蛋白+1.0%氯化钠; (1)相对粘度为0.118; (2)相对粘度为0.042; (3)相对粘度为0.010,加样,由于凝胶层析的稀释作用,似乎样品浓度应尽可能大才好,但样品浓度过大往往导致粘度增大,而使层析分辨率下降(下图)。一般要求样品粘度小于0.01Pas(帕斯卡秒),这样才不致于对分离造成明显影响。对蛋白质类样品浓度

    30、以不大于4为宜。如果样品浑浊,应先过滤或离心除去颗粒后上柱。分析用量一般为每100mL床体积加样品12mL,制备用量一般为每100 mL床体积加样品2030 mL,这样可使样品的洗脱体积小于样品各组分之间的分离体积,获得较满意的分离效果。,91,常用方法,(1)直接将样品加到层析床表面。(2)样品比重高。,样品黏度对洗脱曲线的影响,(1)加葡萄糖2 000,使终浓度为5%,相对粘度11.8;(2)加葡萄糖2 000,使终浓度为2.5%,相对粘度4.2; (3)加葡萄糖2 000,使终浓度为1%.,样品与柱床体积比例悬殊时分离效果好,但过少的样品量不但会造成设备和器材的浪费,降低工作效率,还会造

    31、成样品稀释。,样品上柱是凝胶层析中最关键的一步。理想的样品色带应是狭窄且平直的巨型色谱带。为了做到这一点,应尽量减少加样时样品的稀释以及样品的非平流流经凝胶层析床体。反之将造成色谱带扩散、紊乱,严重影响分离效果。,加样时应尽量减少样品的稀释,及凝胶床面的搅动。这一点在分级分离时尤为重要,应严格按一定的操作程序进行,通常有下列三种方法: 1直接将样品加到层析床表面; 2利用两种液体比重不同而分层的原理,将高比重样品加入床表面低比重的洗脱液之中,样品就慢慢均匀地下沉于床表面,再打开出口,使样品渗入层析; 3.可用微量泵控制。,95,(二)洗脱与收集,1、洗脱剂。 2、流速(操作压、型号、粒度)。

    32、3、分部收集器。,为了防止柱床体积的变化,造成流速降低及重复性下降。整个洗脱过程中始终保持一定的操作压,并不超限是很必要的。流速不宜过快且要稳定。洗脱液的成分也不应改变,以防凝胶颗粒的涨缩引起柱床体积变化或流速改变。在许多情况下可以用水作洗脱剂,但为了防止非特异吸附,避免一些蛋白质在纯水中难以溶解(析出沉淀),以及蛋白质稳定性等问题的发生,常采用缓冲盐溶液进行洗脱。离子浓度至少0.02mol/L方可获得较好的结果,因为凝胶含有少量羧基,会吸附少量阳离子而排斥少量阴离子。洗脱用盐等介质应比较容易除去才好,通常,氨水、醋酸、甲酸铵等易发挥的物质用得较多。对一些吸附较强的物质也可采用水和有机溶剂(如

    33、水-甲醇,水-丙酮等)的混合物进行洗脱。,洗脱剂的流速对分离效果也有很大影响,下图显示了同一凝胶柱在不同流速下的洗脱曲线。可见较快的流速下得到的冼脱峰也宽。流速低洗脱峰窄而高。也就是说,流速较低,分辨率较高,样品稀释较轻。,流速对洗脱曲线的影响,凝胶层析拄洗脱的三部分示意图,洗脱时的流速与操作压有关,与凝胶的型号和粒度也有关,在同样的操作压下洗脱时往往编号小的葡聚糖凝胶,以及颗粒粗的凝胶流速大;编号大的,粒度细的流速慢。对于某种凝胶来说,在一定范围内,操作压加大,流速加快。对强度较大的凝胶,如Sephadex G-1050,在相当大的柱压范围内流速()与操作压(F)成正比,与柱长(L)成反比:

    34、,= K PL,而对于强度差的凝胶,符合以上公式压力范围很小。进一步加大压力时,由于凝胶颗粒变形流速反而降低常见的几种葡聚糖凝胶柱床承受压力与洗脱流速的关系见下图。,几种葡聚糖凝胶拄床承受压力图,各种层析柱装置的操作压(或静水压) (a)(b)操作压等于柱或贮液器内液面和出水接管末端的高度差;(c)(d)压力的大小是由恒压瓶内空气入口管的底部至出口接管末端的高度计算。向下(c)或向上(d)移动出水管无关紧要,欲达到流速恒定的目的,可自制恒压加液装置(下图),更可靠的是使用微量恒流泵。,凝胶层析恒压加液装置,103,(三)凝胶柱的再生,反冲。重新装柱。,在洗脱过程中,所有组分一般都可被洗脱下来,

    35、所以装好柱后,可反复使用,无需特殊的再生处理。但多次使用后,凝胶颗粒可能逐渐沉积压紧,流速变慢。这时只需将凝胶自柱内倒出,重新填装。或使用反冲法,使凝胶松散冲起,然后自然沉降,形成新的柱床,这样流速会有所改善。,葡萄糖凝胶和琼脂糖凝胶都是碳水化合物,能被微生物(如细菌和霉菌)分解。聚丙烯酰胺凝胶本身不被微生物作用,但微生物还是能在此凝胶液中和凝胶床上生长,这样会破坏凝胶的特性,影响分离效果。为防止细菌生长和发酵,可用0.02叠氮化钠、0.05%三氯叔丁醇(仅在弱酸有效,也适用于其他离子交换剂)或0.002洗必泰、0.01醋酸苯汞(在弱碱中有效,也适用于其他阴离子交换剂)以及0.1molL氢氧化

    36、钠溶液等作防腐剂。层析前再用水或平衡液将防腐剂洗去。,凝胶用过后,有几种保存方法:,湿态保存:在水相中加防腐剂,或水洗到中性,高压灭菌封存(或低温存放);,半收缩保存:水洗后滤干,加70乙醇使胶收缩,再浸泡于70乙醇中保存;,干燥保存:水洗后滤干,依次用50、70、90、95乙醇脱水,再用乙醚洗去乙醇,干燥(或6080烘干)后保存。加乙醇时,切忌一上来就用浓乙醇处理,以防结块。,107,四、主要参数测算,V0及Vi的测算 Kd及Kav的值 分辨率R,108,(一)V0及Vi的测算,1重量法 Vt=Vo+Vi+Vg =/4d2h Vi=gWr Vo=Vt(Vi+Vg) Vg估算为1cm3/g干胶

    37、。 2过柱法已知物质的洗脱体积 Ve=Vo+KdVi如用全渗入(Kd=1)或全排阻(Kd=0)的物质过柱,测量其洗脱体积,计算该凝胶柱的V0值及Vi值。常用蓝色葡聚糖(Kd=0)及重铬酸钾(Kd=1)。,109,(二)分配系数测定,分配系数当测得某物质的Ve及Vt ,内水体积Vi及外水体积V0时,算出Kd及Kav的值。Kd及Kav Ve被认为是一种组分对于某一个凝胶柱的特征常数。,110,(三)分辨率,凝胶层析中,两物质(A和B)和分辨率(R)定义为:当R值1,两物质完全分开,小于1时则不能完全分离。 分离时较大柱床体积可增大Ve 。 减少(WA+WB)的方法是适当浓缩样品、选用小粒度凝胶、流

    38、速适当减慢等。,111,五、凝胶层析的扩展,(一)上行凝胶层析 利用流动和重力方向相反的上行层析法,即洗脱液向上流动的层析法。 反转柱 (二)增加有效床高 -提高分辨率(1)串联层析 :有效柱长 (2)循环层析:即在同一根或两根柱上,样品反复进行层析。,112,循环层析,图7.21 人血浆蓝蛋白的循环层析分离 柱:交联葡聚糖凝胶G-100,3.293cm;样品:5.2ml(3%);流速:20ml/h; 洗脱液:0.1mol/L pH8.0 Tris缓冲液(含0.5mol/L NaCl),简单的循环层析装置 选择阀用于选择待循环液或废液,样品从AD上柱,经BD洗脱,经检出的废液由EC排出, 需循

    39、环的物质由ED进入层析柱。,113,(三)薄层凝胶层析,用交联葡聚糖作为薄层层析的支撑载体,称“薄层凝胶层析”。 仅适用于分析 。 特点: 生化分析;设备简单,操作方便,分离迅速;分辨率高;同一薄板可同时分析数个样品。,114,第四节 色谱峰变宽的问题,样品的洗脱曲线不是一个窄的矩形峰,而是一个较宽的高斯峰。洗脱曲线:样品的分子量分布,仪器造成的峰加宽效应。,115,一、溶液通过色谱柱造成的峰加宽,Giddings提出的无规则行走模型。溶质分子本身的运动是无规则的。 (一)分子扩散 (二)涡流扩散 (三)流动相中传质阻力 (三)固定相中传质阻力,116,(一)分子扩散,浓度梯度(HETP)d=

    40、2Dm/V (HETP)d溶质分子纵向扩散对塔板高度的贡献 扰动因子,表示柱内填料对于溶质分子扩散的扰动作用。 Dm是溶质分子在流动相中的扩散系数;V流速。 (1)小而均匀的填料 (2)适当的溶剂 (3) 提高流速,117,(二)涡流扩散,与填料颗粒的形状,尤其是颗粒尺寸有关。(HETP)e=2dp dp填料颗粒的直径;是与填料及装填有关的常数。(1)小而均匀的填料 (2)粒度一致且装得均匀,118,(三)流动相中传质阻力,流动相在柱中的流速是不均匀的。 溶质分子有流速的梯度而导致溶质分子的浓度梯度,径向扩散。 (HETP)m=d2pV/Dm (1)填料装得规整、紧密。 (2) 采用粒度小的填

    41、料; (3)降低流速; (4) 选用合适的溶剂(溶质的扩散系数较大)。,119,(四)固定相中传质阻力,在色谱柱中溶质分子的一部分F在流动相中,而另一部分(1F)在固定相中。分子从固定相中脱离出来到流动相中去,而另一些分子则从流动相进入固定相中。结果: (1)溶质层变宽; (2)溶质层作为一个整体以FV的速度运动。,120,色谱柱内造成的峰加宽,填充介质粒度越小,峰加宽效应越小。,121,溶液在柱外产生的峰加宽,(一)连接管路 当液体流经细管时,径向速度梯度使矩形溶液脉冲变成抛物面形,并导致浓度的径向梯度。 减小管径 (二)检测池,122,二、峰宽的表示方法,W是峰宽,它是通过曲线的两个拐点的

    42、切线和基线交点之间的距离。拐点之间的距离等于2,称为峰的标准偏差。 是衡量峰的宽度的量。W=4,123,分离效果分离度,分离效果用两个峰的峰尖距离以及两个峰的峰宽来表示。 分离度Rs的定义为:选择性决定分离能力,表现在两个峰之间的距离上; 柱效决定峰的扩张程度,表现在峰宽W和标准偏差上。,124,分离能力:填料颗粒的孔径大小孔径分布溶质分子量分布。 柱效:溶质分子的扩散填料的粒度和分布填料颗粒的几何形状柱子的尺寸流速,125,第五节 凝胶层析的应用,一、脱盐和浓缩 二、分子量测定 三、分离纯化,126,一、脱盐和浓缩,脱盐用的凝胶多为大粒度的,高交联度的凝胶。交联度大,凝胶颗粒强度好;凝胶粒度

    43、大,流速高。样品体积最好小于内水体积的三分之一。,127,浓缩,采用包埋法 直接投入法,128,二、分子量测定,在凝胶的分离范围内,不同分子量的物质其洗脱体积Ve及分配系数Kd值随分子量增加而下降。对于一个特定凝胶柱,待测定物质的洗脱体积与分子量的关系符合公式Ve=-KlogM+C,129,分子量的测定,(1)求解法:(两个已知分子量的蛋白质过柱) Vel=CKlogM1 Ve2=CKlogM2 (2)标准曲线法:(先以3个以上已知分子量的标准蛋白过柱 ): 标准曲线法准确性较高。,130,Ve与分子量的关系,图7.29 一些球蛋白分子量与Ve的关系 柱:402.4cm;洗脱液;0.05mol

    44、/L Tris-HCl缓冲液pH7.5(含0.1molKCl) 1大豆胰蛋白酶抑剂;2细胞色素C二聚体;3胰凝乳蛋白酶原;4卵清蛋白;5血清白蛋白; 6血清白蛋白二聚体;7-球蛋白;8甲状腺球蛋白;9蔗糖;10胰高血糖素;11细胞色素C5611; 12细胞色素C5611;13核糖核酸酶;14-乳清蛋白;15肌红蛋白,131,三、凝胶层析在生化制药中的应用,(一)去热原 吸附的专一性不强。对SephadexG-25来说,氨基酸Kd值等于1,热原性物质Kd值都等于0。,132,(二)分离纯化,SephadexG-50纯化胰岛素,除去胰岛素中前胰岛素和其它大分子抗原物质。凝胶离子交换剂。DEAE-S

    45、ephadexA- 50精制透明质酸酶。,1、凝胶层析的分离原理有 、 、 。这三种分离原理是互相补充的,在通常情况下 起主导作用; 的作用随流速增加而加强;只有在流速很高时 才起作用。 2、琼脂糖凝胶的一个特征是分离的分子量范围非常大,其分离范围随着凝胶浓度上升而 ,颗粒强度随浓度上升而 。 3、凝胶粒度的大小对分离效果有直接的影响。一般来说,细粒凝胶柱流速低,洗脱峰窄,分辨率 ,多用于 等。粗粒凝胶柱流速高,洗脱峰平坦,分辨率 ,多用于 等。 4、在作分级分离时,为了提高分辨率,多采用比样品体积大 倍以上的柱体积,以上的柱比,较 吸液量、较 粒的凝胶固定相。 5、溶质通过色谱柱时造成的峰加宽效应包括 、 、 。 6、葡聚糖凝胶的孔径大小取决于 ,其越小,凝胶孔径 越 ;而琼脂糖凝胶的孔径却依赖于 。,

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