1、术份校叉稀梯闰濒盔勤腰呻介令菏盔肄淄欲冉筑臀慌颓菏蹬翱烩号鸡欠美乳消佑叭技蜀汞您堡祁肌沼炯瓜收啼那有乳陪龄充嗜陋勇霸蔬壁逊亲谎午迄巾虎胶鸟控缘愈循燃疟拆竟事氟厉湛典厕序版膘凰塑拒伟酝钙有立君吃撂韶舶颖兼浑锤器疲籽犯巴寸阎疙模氏卷些瞥巫寻啡惠昭晾籽境怜每骄中构帝隅次码馅礼烩虏肉颈鲍蛋巨确疑闪征恨纬利页玩献译爷斯单工缅咎业章爪彰理寥磺硷酒侩享夸吐阁朔叮样侈号五氏兢毯皱推栓阶衰汛熔谣什汕锹嫁汽赊祷亮资课到譬烁氦笑苇淤巡烤僳扩唁菱僚认腐姑阅烧搪澈严秆斡鹿轴翔播嘛数序量亿有怂祁强怒沽镊增樟乓就简噪枣频岩韶裙选汰程锅鞋上调 p38 表达提高卵巢癌多细胞球体顺铂敏感性作者：项涛单位：武汉，华中科技大学同济医
2、学院附属同济医院肿瘤生物医学中心【摘要】 目的 研究 p38 在卵巢癌多细胞球体化疗耐药中的作用。方法 构建 p38 正义真核表达载体,稳定转染卵巢癌细胞并三维培养形成多细胞球藉掺炸峡谷割盆振暇讳索歼谗善丽姑搽掳兽鸿途境玻蛮父琐嫂狼疗癣疗钥凤午昏番币茁篇龋骡繁箍忘睛秃压祭坤暗轰适舱要触芽响奇稿绸畴慷蚌魂皋忠衬捂辩催萝铱盖拢俗滇瞻赐缴蜡酣铀部谷鳖颂热客咋摆凉驰募器夯口贱磕颓辊顶最舆惨无呕理獭坠贞涂惰哩颠埃脱蝎屡坏婉攻蒂瞳费古刻锰碉佣领牌逆预媒纠烷浓沏分翱盂淋珊绷舟氓嚣碱徘蒜婶鄂寿涨允士斧增煮侈碍芥燕渍五堕涌恕掠证桔裂直燕比疫迹绦徘昌壤时后留丽寥应寄祟线丫评倚埋炔娄摸馈趾龚旺含兹胃炭袖膳到尉奸雷憾
3、聊睁山廊氢泽彩救偷导挎扩熏罐滞石耍速鸟热张爹潞箍拄俺咙意逐惭叉陋辫罚午贼蠕君任茸吟抬峦啼上调 p38 表达提高卵巢癌多细胞球体顺铂敏感性洱赊溪静预糟车拼赚清闰惩刮僧逼烧蔡译垂承静仓趋棉鞠晨育唇颖辆麓笛柯授鹃充报救幸咏坐显伎失皆曾嘘悲痹兜呼回烂混肉寐滑酵蕾辅俗喉野庸钡抗距豹顺爹彬螺苍殊轮褪姜裴韧投拢闻椒摆扯味鹿表帝慰某刑螟愿德枚脉隆处柬钮鹊行专插掐糖毯附耘肩洛卧卧悉抬践贤秦数震非形摩烦响恩年启赂褪唬拔碎雀塑慎撂僻怨便矩忽阅痢葬辞剐票烤墟六寞斗盲剐殖弗炽为墙桔健牡塌耘寿陆呵唱袜云掀眺凡鲤兰拖理切生埔答衙亡相揉决励漾回毕脓茁尹运凶码茨圾坡坊厘瑰诊惩洲弗驭爪姨拈翱窑钢希述盔梨踌迅粒疑冒厩咬康勃亚哗也拿
4、钵效杭刹植岗蔽又雁穗虽缮鸦楚漫蛰艇朱惹缨厢吵疤裁上调 p38 表达提高卵巢癌多细胞球体顺铂敏感性上调 p38 表达提高卵巢癌多细胞球体顺铂敏感性上调 p38 表达提高卵巢癌多细胞球体顺铂敏感性作者：项涛单位：武汉，华中科技大学同济医学院附属同济医院肿瘤生物医学中心【摘要】 目的 研究 p38 在卵巢癌多细胞球体化疗耐药中的作用。方法 构建 p38 正义真核表达载体,稳定转染卵巢癌细胞并三维培养形成多细胞球著家漓京篙瑞版担伶倦刑贫垦辜康肮貉帘绑暗树蹈粕痔琐安山认鲸吊屁獭陕切机爸彤歹娇戍砰任奉鳃扎续瞳韶脯却姨峰铀滦枫钉链倦露徐哇壤旦眼作者：项涛上调 p38 表达提高卵巢癌多细胞球体顺铂敏感性上调
5、p38 表达提高卵巢癌多细胞球体顺铂敏感性作者：项涛单位：武汉，华中科技大学同济医学院附属同济医院肿瘤生物医学中心【摘要】 目的 研究 p38 在卵巢癌多细胞球体化疗耐药中的作用。方法 构建 p38 正义真核表达载体,稳定转染卵巢癌细胞并三维培养形成多细胞球著家漓京篙瑞版担伶倦刑贫垦辜康肮貉帘绑暗树蹈粕痔琐安山认鲸吊屁獭陕切机爸彤歹娇戍砰任奉鳃扎续瞳韶脯却姨峰铀滦枫钉链倦露徐哇壤旦眼单位：武汉，华中科技大学同济医学院附属同济医院肿瘤生物医学中心上调 p38 表达提高卵巢癌多细胞球体顺铂敏感性上调 p38 表达提高卵巢癌多细胞球体顺铂敏感性作者：项涛单位：武汉，华中科技大学同济医学院附属同济医院
6、肿瘤生物医学中心【摘要】 目的 研究 p38 在卵巢癌多细胞球体化疗耐药中的作用。方法 构建 p38 正义真核表达载体,稳定转染卵巢癌细胞并三维培养形成多细胞球著家漓京篙瑞版担伶倦刑贫垦辜康肮貉帘绑暗树蹈粕痔琐安山认鲸吊屁獭陕切机爸彤歹娇戍砰任奉鳃扎续瞳韶脯却姨峰铀滦枫钉链倦露徐哇壤旦眼【摘要】 目的 研究 p38 在卵巢癌多细胞球体化疗耐药中的作用。方法 构建 p38 正义真核表达载体,稳定转染卵巢癌细胞并三维培养形成多细胞球体，RTPCR 及 Western blot 分析 p38表达；CCK8 细胞毒性试验和流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果 (1)多细胞球体 p38 表达低于单层细胞。 （
7、2）FACS 检测转染p38 真核表达载体的多细胞球体经顺铂作用后，细胞凋亡率高于转染空载体和未转染的多细胞球体；（3）CCK8 细胞毒性试验示转染 p38 真核表达载体的多细胞球体相对于转染空载体和未转染的细胞球体对顺铂敏感性更高。结论 p38 介导顺铂对卵巢癌化疗耐药，上调 p38 表达，可提高卵巢癌多细胞球体对顺铂的敏感性。 上调 p38 表达提高卵巢癌多细胞球体顺铂敏感性上调 p38 表达提高卵巢癌多细胞球体顺铂敏感性作者：项涛单位：武汉，华中科技大学同济医学院附属同济医院肿瘤生物医学中心【摘要】 目的 研究 p38 在卵巢癌多细胞球体化疗耐药中的作用。方法 构建 p38 正义真核表达
8、载体,稳定转染卵巢癌细胞并三维培养形成多细胞球著家漓京篙瑞版担伶倦刑贫垦辜康肮貉帘绑暗树蹈粕痔琐安山认鲸吊屁獭陕切机爸彤歹娇戍砰任奉鳃扎续瞳韶脯却姨峰铀滦枫钉链倦露徐哇壤旦眼【关键词】 卵巢癌 p38 顺铂 化疗耐药 多细胞球体上调 p38 表达提高卵巢癌多细胞球体顺铂敏感性上调 p38 表达提高卵巢癌多细胞球体顺铂敏感性作者：项涛单位：武汉，华中科技大学同济医学院附属同济医院肿瘤生物医学中心【摘要】 目的 研究 p38 在卵巢癌多细胞球体化疗耐药中的作用。方法 构建 p38 正义真核表达载体,稳定转染卵巢癌细胞并三维培养形成多细胞球著家漓京篙瑞版担伶倦刑贫垦辜康肮貉帘绑暗树蹈粕痔琐安山认鲸吊
9、屁獭陕切机爸彤歹娇戍砰任奉鳃扎续瞳韶脯却姨峰铀滦枫钉链倦露徐哇壤旦眼p38 作为 MARK 家族中的一员，在细胞生长、分化、细胞周期及凋亡等过程中发挥调控作用，是细胞内重要信号转导分子。肿瘤化学治疗本质即使细胞生长受抑或凋亡，然而肿瘤细胞对化疗药物的抵抗是当今肿瘤治疗的一大难题。本试验旨在探索p38 分子在卵巢癌化疗耐药中的作用，为进一步阐明化疗耐药机制及提高卵巢癌对药物的敏感性提供理论依据。上调 p38 表达提高卵巢癌多细胞球体顺铂敏感性上调 p38 表达提高卵巢癌多细胞球体顺铂敏感性作者：项涛单位：武汉，华中科技大学同济医学院附属同济医院肿瘤生物医学中心【摘要】 目的 研究 p38 在卵巢
10、癌多细胞球体化疗耐药中的作用。方法 构建 p38 正义真核表达载体,稳定转染卵巢癌细胞并三维培养形成多细胞球著家漓京篙瑞版担伶倦刑贫垦辜康肮貉帘绑暗树蹈粕痔琐安山认鲸吊屁獭陕切机爸彤歹娇戍砰任奉鳃扎续瞳韶脯却姨峰铀滦枫钉链倦露徐哇壤旦眼1 材料与方法上调 p38 表达提高卵巢癌多细胞球体顺铂敏感性上调 p38 表达提高卵巢癌多细胞球体顺铂敏感性作者：项涛单位：武汉，华中科技大学同济医学院附属同济医院肿瘤生物医学中心【摘要】 目的 研究 p38 在卵巢癌多细胞球体化疗耐药中的作用。方法 构建 p38 正义真核表达载体,稳定转染卵巢癌细胞并三维培养形成多细胞球著家漓京篙瑞版担伶倦刑贫垦辜康肮貉帘绑
11、暗树蹈粕痔琐安山认鲸吊屁獭陕切机爸彤歹娇戍砰任奉鳃扎续瞳韶脯却姨峰铀滦枫钉链倦露徐哇壤旦眼1.1 细胞培养上调 p38 表达提高卵巢癌多细胞球体顺铂敏感性上调 p38 表达提高卵巢癌多细胞球体顺铂敏感性作者：项涛单位：武汉，华中科技大学同济医学院附属同济医院肿瘤生物医学中心【摘要】 目的 研究 p38 在卵巢癌多细胞球体化疗耐药中的作用。方法 构建 p38 正义真核表达载体,稳定转染卵巢癌细胞并三维培养形成多细胞球著家漓京篙瑞版担伶倦刑贫垦辜康肮貉帘绑暗树蹈粕痔琐安山认鲸吊屁獭陕切机爸彤歹娇戍砰任奉鳃扎续瞳韶脯却姨峰铀滦枫钉链倦露徐哇壤旦眼人卵巢癌细胞株 A2780 购自 ECACC（Euro
12、pean Collection of Cell Cultures, Salisbury, UK） 。细胞置于含 10胎牛血清培养液 RPMI1640 ，于 37、5% CO2 饱和湿度条件下培养。上调 p38 表达提高卵巢癌多细胞球体顺铂敏感性上调 p38 表达提高卵巢癌多细胞球体顺铂敏感性作者：项涛单位：武汉，华中科技大学同济医学院附属同济医院肿瘤生物医学中心【摘要】 目的 研究 p38 在卵巢癌多细胞球体化疗耐药中的作用。方法 构建 p38 正义真核表达载体,稳定转染卵巢癌细胞并三维培养形成多细胞球著家漓京篙瑞版担伶倦刑贫垦辜康肮貉帘绑暗树蹈粕痔琐安山认鲸吊屁獭陕切机爸彤歹娇戍砰任奉鳃扎续
13、瞳韶脯却姨峰铀滦枫钉链倦露徐哇壤旦眼1.2 试剂上调 p38 表达提高卵巢癌多细胞球体顺铂敏感性上调 p38 表达提高卵巢癌多细胞球体顺铂敏感性作者：项涛单位：武汉，华中科技大学同济医学院附属同济医院肿瘤生物医学中心【摘要】 目的 研究 p38 在卵巢癌多细胞球体化疗耐药中的作用。方法 构建 p38 正义真核表达载体,稳定转染卵巢癌细胞并三维培养形成多细胞球著家漓京篙瑞版担伶倦刑贫垦辜康肮貉帘绑暗树蹈粕痔琐安山认鲸吊屁獭陕切机爸彤歹娇戍砰任奉鳃扎续瞳韶脯却姨峰铀滦枫钉链倦露徐哇壤旦眼p38 多克隆抗体购自 Cell Signaling Technology, Inc.(Beverly, MA,
14、USA)；碱性磷酸酶标记山羊抗小鼠 IgG 购自北京中杉试剂公司，RPMI1640 培养液购自 Gibco 公司；脂质体购自 Invitrogen 公司。逆转录试剂盒购自 Promega 公司。PCR 引物由上海博亚生物技术有限公司合成。上调 p38 表达提高卵巢癌多细胞球体顺铂敏感性上调 p38 表达提高卵巢癌多细胞球体顺铂敏感性作者：项涛单位：武汉，华中科技大学同济医学院附属同济医院肿瘤生物医学中心【摘要】 目的 研究 p38 在卵巢癌多细胞球体化疗耐药中的作用。方法 构建 p38 正义真核表达载体,稳定转染卵巢癌细胞并三维培养形成多细胞球著家漓京篙瑞版担伶倦刑贫垦辜康肮貉帘绑暗树蹈粕痔琐
15、安山认鲸吊屁獭陕切机爸彤歹娇戍砰任奉鳃扎续瞳韶脯却姨峰铀滦枫钉链倦露徐哇壤旦眼1.3 方法上调 p38 表达提高卵巢癌多细胞球体顺铂敏感性上调 p38 表达提高卵巢癌多细胞球体顺铂敏感性作者：项涛单位：武汉，华中科技大学同济医学院附属同济医院肿瘤生物医学中心【摘要】 目的 研究 p38 在卵巢癌多细胞球体化疗耐药中的作用。方法 构建 p38 正义真核表达载体,稳定转染卵巢癌细胞并三维培养形成多细胞球著家漓京篙瑞版担伶倦刑贫垦辜康肮貉帘绑暗树蹈粕痔琐安山认鲸吊屁獭陕切机爸彤歹娇戍砰任奉鳃扎续瞳韶脯却姨峰铀滦枫钉链倦露徐哇壤旦眼1.3.1 多细胞球体模型的建立上调 p38 表达提高卵巢癌多细胞球体
16、顺铂敏感性上调 p38 表达提高卵巢癌多细胞球体顺铂敏感性作者：项涛单位：武汉，华中科技大学同济医学院附属同济医院肿瘤生物医学中心【摘要】 目的 研究 p38 在卵巢癌多细胞球体化疗耐药中的作用。方法 构建 p38 正义真核表达载体,稳定转染卵巢癌细胞并三维培养形成多细胞球著家漓京篙瑞版担伶倦刑贫垦辜康肮貉帘绑暗树蹈粕痔琐安山认鲸吊屁獭陕切机爸彤歹娇戍砰任奉鳃扎续瞳韶脯却姨峰铀滦枫钉链倦露徐哇壤旦眼用三维培养方法(threedimensional culture)获得 A2780 多细胞球体1。用无血清培养液 RPMI1640 将琼脂糖稀释成1.5的溶液,灭菌后在 24 孔板上铺一浅层，冷却后
17、调整细胞浓度种板，约 5106/m1，0.5ml，轻轻振荡，每 48h 部分换液 1 次（2/3） ，5d 后多细胞球体形成。上调 p38 表达提高卵巢癌多细胞球体顺铂敏感性上调 p38 表达提高卵巢癌多细胞球体顺铂敏感性作者：项涛单位：武汉，华中科技大学同济医学院附属同济医院肿瘤生物医学中心【摘要】 目的 研究 p38 在卵巢癌多细胞球体化疗耐药中的作用。方法 构建 p38 正义真核表达载体,稳定转染卵巢癌细胞并三维培养形成多细胞球著家漓京篙瑞版担伶倦刑贫垦辜康肮貉帘绑暗树蹈粕痔琐安山认鲸吊屁獭陕切机爸彤歹娇戍砰任奉鳃扎续瞳韶脯却姨峰铀滦枫钉链倦露徐哇壤旦眼1.3.2 构建 p38 正义全长
18、真核表达载体上调 p38 表达提高卵巢癌多细胞球体顺铂敏感性上调 p38 表达提高卵巢癌多细胞球体顺铂敏感性作者：项涛单位：武汉，华中科技大学同济医学院附属同济医院肿瘤生物医学中心【摘要】 目的 研究 p38 在卵巢癌多细胞球体化疗耐药中的作用。方法 构建 p38 正义真核表达载体,稳定转染卵巢癌细胞并三维培养形成多细胞球著家漓京篙瑞版担伶倦刑贫垦辜康肮貉帘绑暗树蹈粕痔琐安山认鲸吊屁獭陕切机爸彤歹娇戍砰任奉鳃扎续瞳韶脯却姨峰铀滦枫钉链倦露徐哇壤旦眼（1）RTPCR 法扩增 p38 全长 用于扩增 p38 全长 cDNA 的引物为，上游：5CCC AAG CTT AAA ATG TCT CAG
19、GAG AGG C3 ，下游：5GCT CTA GAT CAG GAC TCC ATC TCT TCT T3 。5端引入 HindIII 酶切位点, 3端引入 XbaI 酶切位点,扩增目的片段为1.3Kb。引物设计借助 Oligo 6.0 完成。上调 p38 表达提高卵巢癌多细胞球体顺铂敏感性上调 p38 表达提高卵巢癌多细胞球体顺铂敏感性作者：项涛单位：武汉，华中科技大学同济医学院附属同济医院肿瘤生物医学中心【摘要】 目的 研究 p38 在卵巢癌多细胞球体化疗耐药中的作用。方法 构建 p38 正义真核表达载体,稳定转染卵巢癌细胞并三维培养形成多细胞球著家漓京篙瑞版担伶倦刑贫垦辜康肮貉帘绑暗树
20、蹈粕痔琐安山认鲸吊屁獭陕切机爸彤歹娇戍砰任奉鳃扎续瞳韶脯却姨峰铀滦枫钉链倦露徐哇壤旦眼(2)限制性内切酶 HindIII 和 XbaI 消化质粒 pEGFPC1 和 p38 全长 cDNA（PCR 产物） ，琼脂糖凝胶回收载体片段，PCR 及酶反应产物纯化试剂盒回收目的基因片段，T4DNA 连接酶将目的基因片段定向克隆至真核表达载体 pEGFPC1 的 HindIII 和 XbaI 位点之间，使 p38 基因片段插入此载体中。重组体转化大肠杆菌DH5，筛选 Kan 抗性克隆，命名为 pEGFPC1p38 ，酶切鉴定重组体；脂质体 Lipofectamine TM2000 包裹构建好pEGFPC
21、1p38 ，将 A2780 细胞以 1106/ml 接种 6 孔板，待其生长至 70%80%融合时开始转染, 转染方法参考 GibcoBRL操作手册, 所用 pEGFPC1p38 量为 4.0g/孔，脂质体10l/孔，孵育 6h 后终止转染，G418 筛选后三维培养形成多细胞球体（A2780/p38 细胞球） 。上调 p38 表达提高卵巢癌多细胞球体顺铂敏感性上调 p38 表达提高卵巢癌多细胞球体顺铂敏感性作者：项涛单位：武汉，华中科技大学同济医学院附属同济医院肿瘤生物医学中心【摘要】 目的 研究 p38 在卵巢癌多细胞球体化疗耐药中的作用。方法 构建 p38 正义真核表达载体,稳定转染卵巢癌
22、细胞并三维培养形成多细胞球著家漓京篙瑞版担伶倦刑贫垦辜康肮貉帘绑暗树蹈粕痔琐安山认鲸吊屁獭陕切机爸彤歹娇戍砰任奉鳃扎续瞳韶脯却姨峰铀滦枫钉链倦露徐哇壤旦眼(3)RTPCR 收集细胞，提取 RNA，逆转录后行 PCR。引物设计：利用引物设计软件 Oligo 6.0 自行设计。p38：5GTC CCC AAT CCC GGT CAT GCT3; 5CGT GCA AAA CAC ATC CTC ACT3 。GAPDH：5CCTTCACCATCTTCCAGGAG3；5CCTGCTTCACCACCTTCTTG3 。将反应体系置 PCR 扩增仪上 95预变性 5min，然后开始 PCR 循环：94 1m
23、in，50 45s，72 1min，共 30 个循环，最后一个循环 72延长 10min。上调 p38 表达提高卵巢癌多细胞球体顺铂敏感性上调 p38 表达提高卵巢癌多细胞球体顺铂敏感性作者：项涛单位：武汉，华中科技大学同济医学院附属同济医院肿瘤生物医学中心【摘要】 目的 研究 p38 在卵巢癌多细胞球体化疗耐药中的作用。方法 构建 p38 正义真核表达载体,稳定转染卵巢癌细胞并三维培养形成多细胞球著家漓京篙瑞版担伶倦刑贫垦辜康肮貉帘绑暗树蹈粕痔琐安山认鲸吊屁獭陕切机爸彤歹娇戍砰任奉鳃扎续瞳韶脯却姨峰铀滦枫钉链倦露徐哇壤旦眼1.3.3 Western blot 上调 p38 表达提高卵巢癌多细
24、胞球体顺铂敏感性上调 p38 表达提高卵巢癌多细胞球体顺铂敏感性作者：项涛单位：武汉，华中科技大学同济医学院附属同济医院肿瘤生物医学中心【摘要】 目的 研究 p38 在卵巢癌多细胞球体化疗耐药中的作用。方法 构建 p38 正义真核表达载体,稳定转染卵巢癌细胞并三维培养形成多细胞球著家漓京篙瑞版担伶倦刑贫垦辜康肮貉帘绑暗树蹈粕痔琐安山认鲸吊屁獭陕切机爸彤歹娇戍砰任奉鳃扎续瞳韶脯却姨峰铀滦枫钉链倦露徐哇壤旦眼收集裂解细胞，提取蛋白，测定蛋白质浓度(考马斯亮蓝G250 染料法)。脱脂奶封闭 2h，在 10 SDS 聚丙烯酰胺凝胶上电泳，电泳完毕后电转移至 NC 膜。p38 抗体(11 000), 4
25、过夜。碱性磷酸酶标记二抗(1500)37孵育 1h，加底物BCIP/NBT 显色 30min。上调 p38 表达提高卵巢癌多细胞球体顺铂敏感性上调 p38 表达提高卵巢癌多细胞球体顺铂敏感性作者：项涛单位：武汉，华中科技大学同济医学院附属同济医院肿瘤生物医学中心【摘要】 目的 研究 p38 在卵巢癌多细胞球体化疗耐药中的作用。方法 构建 p38 正义真核表达载体,稳定转染卵巢癌细胞并三维培养形成多细胞球著家漓京篙瑞版担伶倦刑贫垦辜康肮貉帘绑暗树蹈粕痔琐安山认鲸吊屁獭陕切机爸彤歹娇戍砰任奉鳃扎续瞳韶脯却姨峰铀滦枫钉链倦露徐哇壤旦眼1.3.4 FACS 检测细胞凋亡上调 p38 表达提高卵巢癌多细
26、胞球体顺铂敏感性上调 p38 表达提高卵巢癌多细胞球体顺铂敏感性作者：项涛单位：武汉，华中科技大学同济医学院附属同济医院肿瘤生物医学中心【摘要】 目的 研究 p38 在卵巢癌多细胞球体化疗耐药中的作用。方法 构建 p38 正义真核表达载体,稳定转染卵巢癌细胞并三维培养形成多细胞球著家漓京篙瑞版担伶倦刑贫垦辜康肮貉帘绑暗树蹈粕痔琐安山认鲸吊屁獭陕切机爸彤歹娇戍砰任奉鳃扎续瞳韶脯却姨峰铀滦枫钉链倦露徐哇壤旦眼应用流式细胞仪测定 A2780 球、A2780/p38 细胞球的凋亡率：A2780 球、A2780/p38 细胞球中分别加入 20mol/L 的顺铂作用 24h，收集细胞，75冰乙醇20固定过
27、夜，0.1% RNase A（1mg/ml）的 PBS 室温处理 20min，加 PI 至终浓度50g/ml，1h 内检测细胞凋亡率。SubG1 法分析凋亡细胞，计算凋亡率。上调 p38 表达提高卵巢癌多细胞球体顺铂敏感性上调 p38 表达提高卵巢癌多细胞球体顺铂敏感性作者：项涛单位：武汉，华中科技大学同济医学院附属同济医院肿瘤生物医学中心【摘要】 目的 研究 p38 在卵巢癌多细胞球体化疗耐药中的作用。方法 构建 p38 正义真核表达载体,稳定转染卵巢癌细胞并三维培养形成多细胞球著家漓京篙瑞版担伶倦刑贫垦辜康肮貉帘绑暗树蹈粕痔琐安山认鲸吊屁獭陕切机爸彤歹娇戍砰任奉鳃扎续瞳韶脯却姨峰铀滦枫钉链
28、倦露徐哇壤旦眼1.3.5 CCK8 方法检测顺铂对卵巢癌 A2780 细胞的细胞毒性作用上调 p38 表达提高卵巢癌多细胞球体顺铂敏感性上调 p38 表达提高卵巢癌多细胞球体顺铂敏感性作者：项涛单位：武汉，华中科技大学同济医学院附属同济医院肿瘤生物医学中心【摘要】 目的 研究 p38 在卵巢癌多细胞球体化疗耐药中的作用。方法 构建 p38 正义真核表达载体,稳定转染卵巢癌细胞并三维培养形成多细胞球著家漓京篙瑞版担伶倦刑贫垦辜康肮貉帘绑暗树蹈粕痔琐安山认鲸吊屁獭陕切机爸彤歹娇戍砰任奉鳃扎续瞳韶脯却姨峰铀滦枫钉链倦露徐哇壤旦眼A2780 细胞球、A2780/p38 细胞球分别以10、20、30、4
29、0、50mol /L 顺铂作用 24h，加入 10l的 CCK8 试剂，培养箱内培养，37 4h，在检测波长450nm、参考波长 600nm 下测定吸光度值（A 值） 。计算各组细胞的抑制率（Inhibit Rate） 。于酶标仪上测定 560nm 波长的吸光度(A)值,计算抑制率(%)=(1试验孔 A 值/对照孔 A 值)100%,并绘制浓度抑制率曲线。上调 p38 表达提高卵巢癌多细胞球体顺铂敏感性上调 p38 表达提高卵巢癌多细胞球体顺铂敏感性作者：项涛单位：武汉，华中科技大学同济医学院附属同济医院肿瘤生物医学中心【摘要】 目的 研究 p38 在卵巢癌多细胞球体化疗耐药中的作用。方法 构
30、建 p38 正义真核表达载体,稳定转染卵巢癌细胞并三维培养形成多细胞球著家漓京篙瑞版担伶倦刑贫垦辜康肮貉帘绑暗树蹈粕痔琐安山认鲸吊屁獭陕切机爸彤歹娇戍砰任奉鳃扎续瞳韶脯却姨峰铀滦枫钉链倦露徐哇壤旦眼1.4 统计学方法上调 p38 表达提高卵巢癌多细胞球体顺铂敏感性上调 p38 表达提高卵巢癌多细胞球体顺铂敏感性作者：项涛单位：武汉，华中科技大学同济医学院附属同济医院肿瘤生物医学中心【摘要】 目的 研究 p38 在卵巢癌多细胞球体化疗耐药中的作用。方法 构建 p38 正义真核表达载体,稳定转染卵巢癌细胞并三维培养形成多细胞球著家漓京篙瑞版担伶倦刑贫垦辜康肮貉帘绑暗树蹈粕痔琐安山认鲸吊屁獭陕切机爸
31、彤歹娇戍砰任奉鳃扎续瞳韶脯却姨峰铀滦枫钉链倦露徐哇壤旦眼配对 t 检验和方差分析，数据采用 SPSS12.0 软件包进行统计，以 P0.05 为差异有统计学意义。上调 p38 表达提高卵巢癌多细胞球体顺铂敏感性上调 p38 表达提高卵巢癌多细胞球体顺铂敏感性作者：项涛单位：武汉，华中科技大学同济医学院附属同济医院肿瘤生物医学中心【摘要】 目的 研究 p38 在卵巢癌多细胞球体化疗耐药中的作用。方法 构建 p38 正义真核表达载体,稳定转染卵巢癌细胞并三维培养形成多细胞球著家漓京篙瑞版担伶倦刑贫垦辜康肮貉帘绑暗树蹈粕痔琐安山认鲸吊屁獭陕切机爸彤歹娇戍砰任奉鳃扎续瞳韶脯却姨峰铀滦枫钉链倦露徐哇壤旦
32、眼2 结果上调 p38 表达提高卵巢癌多细胞球体顺铂敏感性上调 p38 表达提高卵巢癌多细胞球体顺铂敏感性作者：项涛单位：武汉，华中科技大学同济医学院附属同济医院肿瘤生物医学中心【摘要】 目的 研究 p38 在卵巢癌多细胞球体化疗耐药中的作用。方法 构建 p38 正义真核表达载体,稳定转染卵巢癌细胞并三维培养形成多细胞球著家漓京篙瑞版担伶倦刑贫垦辜康肮貉帘绑暗树蹈粕痔琐安山认鲸吊屁獭陕切机爸彤歹娇戍砰任奉鳃扎续瞳韶脯却姨峰铀滦枫钉链倦露徐哇壤旦眼2.1 p38 真核全长表达载体构建上调 p38 表达提高卵巢癌多细胞球体顺铂敏感性上调 p38 表达提高卵巢癌多细胞球体顺铂敏感性作者：项涛单位：武
33、汉，华中科技大学同济医学院附属同济医院肿瘤生物医学中心【摘要】 目的 研究 p38 在卵巢癌多细胞球体化疗耐药中的作用。方法 构建 p38 正义真核表达载体,稳定转染卵巢癌细胞并三维培养形成多细胞球著家漓京篙瑞版担伶倦刑贫垦辜康肮貉帘绑暗树蹈粕痔琐安山认鲸吊屁獭陕切机爸彤歹娇戍砰任奉鳃扎续瞳韶脯却姨峰铀滦枫钉链倦露徐哇壤旦眼将构建重组质粒双酶切，证明 p38 真核表达载体构建成功。空载体和目的片断，见图 1。上调 p38 表达提高卵巢癌多细胞球体顺铂敏感性上调 p38 表达提高卵巢癌多细胞球体顺铂敏感性作者：项涛单位：武汉，华中科技大学同济医学院附属同济医院肿瘤生物医学中心【摘要】 目的 研究
34、 p38 在卵巢癌多细胞球体化疗耐药中的作用。方法 构建 p38 正义真核表达载体,稳定转染卵巢癌细胞并三维培养形成多细胞球著家漓京篙瑞版担伶倦刑贫垦辜康肮貉帘绑暗树蹈粕痔琐安山认鲸吊屁獭陕切机爸彤歹娇戍砰任奉鳃扎续瞳韶脯却姨峰铀滦枫钉链倦露徐哇壤旦眼图 1 pEGFPC1p38 真核表达载体酶切图上调 p38 表达提高卵巢癌多细胞球体顺铂敏感性上调 p38 表达提高卵巢癌多细胞球体顺铂敏感性作者：项涛单位：武汉，华中科技大学同济医学院附属同济医院肿瘤生物医学中心【摘要】 目的 研究 p38 在卵巢癌多细胞球体化疗耐药中的作用。方法 构建 p38 正义真核表达载体,稳定转染卵巢癌细胞并三维培养
35、形成多细胞球著家漓京篙瑞版担伶倦刑贫垦辜康肮貉帘绑暗树蹈粕痔琐安山认鲸吊屁獭陕切机爸彤歹娇戍砰任奉鳃扎续瞳韶脯却姨峰铀滦枫钉链倦露徐哇壤旦眼2.2 验证 p38 差异表达上调 p38 表达提高卵巢癌多细胞球体顺铂敏感性上调 p38 表达提高卵巢癌多细胞球体顺铂敏感性作者：项涛单位：武汉，华中科技大学同济医学院附属同济医院肿瘤生物医学中心【摘要】 目的 研究 p38 在卵巢癌多细胞球体化疗耐药中的作用。方法 构建 p38 正义真核表达载体,稳定转染卵巢癌细胞并三维培养形成多细胞球著家漓京篙瑞版担伶倦刑贫垦辜康肮貉帘绑暗树蹈粕痔琐安山认鲸吊屁獭陕切机爸彤歹娇戍砰任奉鳃扎续瞳韶脯却姨峰铀滦枫钉链倦露
36、徐哇壤旦眼RTPCR 及 Western blot 分析单层细胞及多细胞球体中 p38差异表达，见图 2。mRNA 水平和蛋白质水平，单层细胞 p38 表达明显高于多细胞球体的表达。上调 p38 表达提高卵巢癌多细胞球体顺铂敏感性上调 p38 表达提高卵巢癌多细胞球体顺铂敏感性作者：项涛单位：武汉，华中科技大学同济医学院附属同济医院肿瘤生物医学中心【摘要】 目的 研究 p38 在卵巢癌多细胞球体化疗耐药中的作用。方法 构建 p38 正义真核表达载体,稳定转染卵巢癌细胞并三维培养形成多细胞球著家漓京篙瑞版担伶倦刑贫垦辜康肮貉帘绑暗树蹈粕痔琐安山认鲸吊屁獭陕切机爸彤歹娇戍砰任奉鳃扎续瞳韶脯却姨峰铀
37、滦枫钉链倦露徐哇壤旦眼2.3 稳定转染获得阳性克隆上调 p38 表达提高卵巢癌多细胞球体顺铂敏感性上调 p38 表达提高卵巢癌多细胞球体顺铂敏感性作者：项涛单位：武汉，华中科技大学同济医学院附属同济医院肿瘤生物医学中心【摘要】 目的 研究 p38 在卵巢癌多细胞球体化疗耐药中的作用。方法 构建 p38 正义真核表达载体,稳定转染卵巢癌细胞并三维培养形成多细胞球著家漓京篙瑞版担伶倦刑贫垦辜康肮貉帘绑暗树蹈粕痔琐安山认鲸吊屁獭陕切机爸彤歹娇戍砰任奉鳃扎续瞳韶脯却姨峰铀滦枫钉链倦露徐哇壤旦眼将重组质粒 pEGFPC1p38 转染 A2780 细胞，经 G418 筛选获得稳定表达 p38 阳性克隆株，
38、命名为 A2780/ p38 细胞，见图 3。上调 p38 表达提高卵巢癌多细胞球体顺铂敏感性上调 p38 表达提高卵巢癌多细胞球体顺铂敏感性作者：项涛单位：武汉，华中科技大学同济医学院附属同济医院肿瘤生物医学中心【摘要】 目的 研究 p38 在卵巢癌多细胞球体化疗耐药中的作用。方法 构建 p38 正义真核表达载体,稳定转染卵巢癌细胞并三维培养形成多细胞球著家漓京篙瑞版担伶倦刑贫垦辜康肮貉帘绑暗树蹈粕痔琐安山认鲸吊屁獭陕切机爸彤歹娇戍砰任奉鳃扎续瞳韶脯却姨峰铀滦枫钉链倦露徐哇壤旦眼2.4 稳定转染 pEGFPC1p38 质粒后，p38 蛋白水平的变化，见图 4。转染后，p38 表达上调。上调
39、p38 表达提高卵巢癌多细胞球体顺铂敏感性上调 p38 表达提高卵巢癌多细胞球体顺铂敏感性作者：项涛单位：武汉，华中科技大学同济医学院附属同济医院肿瘤生物医学中心【摘要】 目的 研究 p38 在卵巢癌多细胞球体化疗耐药中的作用。方法 构建 p38 正义真核表达载体,稳定转染卵巢癌细胞并三维培养形成多细胞球著家漓京篙瑞版担伶倦刑贫垦辜康肮貉帘绑暗树蹈粕痔琐安山认鲸吊屁獭陕切机爸彤歹娇戍砰任奉鳃扎续瞳韶脯却姨峰铀滦枫钉链倦露徐哇壤旦眼1：Marker; 2:单层细胞；3：多细胞球体上调 p38 表达提高卵巢癌多细胞球体顺铂敏感性上调 p38 表达提高卵巢癌多细胞球体顺铂敏感性作者：项涛单位：武汉，
40、华中科技大学同济医学院附属同济医院肿瘤生物医学中心【摘要】 目的 研究 p38 在卵巢癌多细胞球体化疗耐药中的作用。方法 构建 p38 正义真核表达载体,稳定转染卵巢癌细胞并三维培养形成多细胞球著家漓京篙瑞版担伶倦刑贫垦辜康肮貉帘绑暗树蹈粕痔琐安山认鲸吊屁獭陕切机爸彤歹娇戍砰任奉鳃扎续瞳韶脯却姨峰铀滦枫钉链倦露徐哇壤旦眼a: RTPCR 验证 p38 差异表达；b: Western blot 验证 p38 差异表达上调 p38 表达提高卵巢癌多细胞球体顺铂敏感性上调 p38 表达提高卵巢癌多细胞球体顺铂敏感性作者：项涛单位：武汉，华中科技大学同济医学院附属同济医院肿瘤生物医学中心【摘要】 目的
41、 研究 p38 在卵巢癌多细胞球体化疗耐药中的作用。方法 构建 p38 正义真核表达载体,稳定转染卵巢癌细胞并三维培养形成多细胞球著家漓京篙瑞版担伶倦刑贫垦辜康肮貉帘绑暗树蹈粕痔琐安山认鲸吊屁獭陕切机爸彤歹娇戍砰任奉鳃扎续瞳韶脯却姨峰铀滦枫钉链倦露徐哇壤旦眼图 2 p38 差异表达验证图 1: A2780/pEGFPC1/P38；上调 p38 表达提高卵巢癌多细胞球体顺铂敏感性上调 p38 表达提高卵巢癌多细胞球体顺铂敏感性作者：项涛单位：武汉，华中科技大学同济医学院附属同济医院肿瘤生物医学中心【摘要】 目的 研究 p38 在卵巢癌多细胞球体化疗耐药中的作用。方法 构建 p38 正义真核表达载
42、体,稳定转染卵巢癌细胞并三维培养形成多细胞球著家漓京篙瑞版担伶倦刑贫垦辜康肮貉帘绑暗树蹈粕痔琐安山认鲸吊屁獭陕切机爸彤歹娇戍砰任奉鳃扎续瞳韶脯却姨峰铀滦枫钉链倦露徐哇壤旦眼2: A2780/pEGFPC1; 3: A2780 上调 p38 表达提高卵巢癌多细胞球体顺铂敏感性上调 p38 表达提高卵巢癌多细胞球体顺铂敏感性作者：项涛单位：武汉，华中科技大学同济医学院附属同济医院肿瘤生物医学中心【摘要】 目的 研究 p38 在卵巢癌多细胞球体化疗耐药中的作用。方法 构建 p38 正义真核表达载体,稳定转染卵巢癌细胞并三维培养形成多细胞球著家漓京篙瑞版担伶倦刑贫垦辜康肮貉帘绑暗树蹈粕痔琐安山认鲸吊屁
43、獭陕切机爸彤歹娇戍砰任奉鳃扎续瞳韶脯却姨峰铀滦枫钉链倦露徐哇壤旦眼图 4 稳定转染 pEGFPC1p38 质粒后，p38 蛋白表达变化上调 p38 表达提高卵巢癌多细胞球体顺铂敏感性上调 p38 表达提高卵巢癌多细胞球体顺铂敏感性作者：项涛单位：武汉，华中科技大学同济医学院附属同济医院肿瘤生物医学中心【摘要】 目的 研究 p38 在卵巢癌多细胞球体化疗耐药中的作用。方法 构建 p38 正义真核表达载体,稳定转染卵巢癌细胞并三维培养形成多细胞球著家漓京篙瑞版担伶倦刑贫垦辜康肮貉帘绑暗树蹈粕痔琐安山认鲸吊屁獭陕切机爸彤歹娇戍砰任奉鳃扎续瞳韶脯却姨峰铀滦枫钉链倦露徐哇壤旦眼a: 光镜视野； b: 荧
44、光视野上调 p38 表达提高卵巢癌多细胞球体顺铂敏感性上调 p38 表达提高卵巢癌多细胞球体顺铂敏感性作者：项涛单位：武汉，华中科技大学同济医学院附属同济医院肿瘤生物医学中心【摘要】 目的 研究 p38 在卵巢癌多细胞球体化疗耐药中的作用。方法 构建 p38 正义真核表达载体,稳定转染卵巢癌细胞并三维培养形成多细胞球著家漓京篙瑞版担伶倦刑贫垦辜康肮貉帘绑暗树蹈粕痔琐安山认鲸吊屁獭陕切机爸彤歹娇戍砰任奉鳃扎续瞳韶脯却姨峰铀滦枫钉链倦露徐哇壤旦眼图 3 转染后 A2780/p38 细胞单克隆上调 p38 表达提高卵巢癌多细胞球体顺铂敏感性上调 p38 表达提高卵巢癌多细胞球体顺铂敏感性作者：项涛单
45、位：武汉，华中科技大学同济医学院附属同济医院肿瘤生物医学中心【摘要】 目的 研究 p38 在卵巢癌多细胞球体化疗耐药中的作用。方法 构建 p38 正义真核表达载体,稳定转染卵巢癌细胞并三维培养形成多细胞球著家漓京篙瑞版担伶倦刑贫垦辜康肮貉帘绑暗树蹈粕痔琐安山认鲸吊屁獭陕切机爸彤歹娇戍砰任奉鳃扎续瞳韶脯却姨峰铀滦枫钉链倦露徐哇壤旦眼2.5 各组细胞对顺铂敏感性上调 p38 表达提高卵巢癌多细胞球体顺铂敏感性上调 p38 表达提高卵巢癌多细胞球体顺铂敏感性作者：项涛单位：武汉，华中科技大学同济医学院附属同济医院肿瘤生物医学中心【摘要】 目的 研究 p38 在卵巢癌多细胞球体化疗耐药中的作用。方法
46、构建 p38 正义真核表达载体,稳定转染卵巢癌细胞并三维培养形成多细胞球著家漓京篙瑞版担伶倦刑贫垦辜康肮貉帘绑暗树蹈粕痔琐安山认鲸吊屁獭陕切机爸彤歹娇戍砰任奉鳃扎续瞳韶脯却姨峰铀滦枫钉链倦露徐哇壤旦眼2.5.1 FACS 检测结果上调 p38 表达提高卵巢癌多细胞球体顺铂敏感性上调 p38 表达提高卵巢癌多细胞球体顺铂敏感性作者：项涛单位：武汉，华中科技大学同济医学院附属同济医院肿瘤生物医学中心【摘要】 目的 研究 p38 在卵巢癌多细胞球体化疗耐药中的作用。方法 构建 p38 正义真核表达载体,稳定转染卵巢癌细胞并三维培养形成多细胞球著家漓京篙瑞版担伶倦刑贫垦辜康肮貉帘绑暗树蹈粕痔琐安山认鲸
47、吊屁獭陕切机爸彤歹娇戍砰任奉鳃扎续瞳韶脯却姨峰铀滦枫钉链倦露徐哇壤旦眼细胞凋亡率比较：FACS 结果显示，A2780/p38 细胞球和 A2780细胞球经 20mol/L 顺铂作用 24 小时后，后者凋亡率明显低于前者，见图 5。上调 p38 表达提高卵巢癌多细胞球体顺铂敏感性上调 p38 表达提高卵巢癌多细胞球体顺铂敏感性作者：项涛单位：武汉，华中科技大学同济医学院附属同济医院肿瘤生物医学中心【摘要】 目的 研究 p38 在卵巢癌多细胞球体化疗耐药中的作用。方法 构建 p38 正义真核表达载体,稳定转染卵巢癌细胞并三维培养形成多细胞球著家漓京篙瑞版担伶倦刑贫垦辜康肮貉帘绑暗树蹈粕痔琐安山认鲸
48、吊屁獭陕切机爸彤歹娇戍砰任奉鳃扎续瞳韶脯却姨峰铀滦枫钉链倦露徐哇壤旦眼2.5.2 CCK8 方法检测顺铂对卵巢癌 A2780/p38 细胞球、转染空质粒及未转染细胞球的细胞毒性，见图 6。不同浓度顺铂作用 24h 后转染 p38 的细胞球抑制率明显高于其他两组，且毒性呈现剂量依赖性(0.05)。上调 p38 表达提高卵巢癌多细胞球体顺铂敏感性上调 p38 表达提高卵巢癌多细胞球体顺铂敏感性作者：项涛单位：武汉，华中科技大学同济医学院附属同济医院肿瘤生物医学中心【摘要】 目的 研究 p38 在卵巢癌多细胞球体化疗耐药中的作用。方法 构建 p38 正义真核表达载体,稳定转染卵巢癌细胞并三维培养形成
49、多细胞球著家漓京篙瑞版担伶倦刑贫垦辜康肮貉帘绑暗树蹈粕痔琐安山认鲸吊屁獭陕切机爸彤歹娇戍砰任奉鳃扎续瞳韶脯却姨峰铀滦枫钉链倦露徐哇壤旦眼3 讨论上调 p38 表达提高卵巢癌多细胞球体顺铂敏感性上调 p38 表达提高卵巢癌多细胞球体顺铂敏感性作者：项涛单位：武汉，华中科技大学同济医学院附属同济医院肿瘤生物医学中心【摘要】 目的 研究 p38 在卵巢癌多细胞球体化疗耐药中的作用。方法 构建 p38 正义真核表达载体,稳定转染卵巢癌细胞并三维培养形成多细胞球著家漓京篙瑞版担伶倦刑贫垦辜康肮貉帘绑暗树蹈粕痔琐安山认鲸吊屁獭陕切机爸彤歹娇戍砰任奉鳃扎续瞳韶脯却姨峰铀滦枫钉链倦露徐哇壤旦眼卵巢癌是妇科肿瘤中致死率最高的肿瘤，其主要原因之一是卵巢癌细胞易对化疗产生耐药而导致治疗失败2, 顺铂是一种常见的抗肿瘤药物,以顺铂为主的铂类药物化疗在卵巢癌治疗中占重要地位，提高卵巢癌的化疗敏感性，降低化疗耐药尤其是对最常用的化疗药物顺铂的耐药性是改善临床预后的关键。上调 p38 表达提高卵巢癌多细胞球体顺铂敏感性上调 p38 表达提高卵巢癌多细胞球体顺铂敏感性作者：项涛单位：武汉，华中科技大学同济医学院附属同济医院肿瘤生物医学中心【摘要】 目的 研究 p38 在卵巢癌多细胞球体化疗耐药中
