1、中国组织工程研究 第 21 卷 第 4 期 20170208 出版Chinese Journal of Tissue Engineering Research February 8, 2017 Vol.21, No.4ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH 499www.CRTER.org研究原著丁晓伟，女，1983 年生，河北省石家庄市人，汉族，硕士，主治医师，主要从事手外伤和脑血管病的康复治疗。通讯作者：赵忠海，主任医师，沈阳医学院附属中心医院康复医学科，辽 宁省沈阳市 110024中图分类号:R318文献标识码:A文章编号:2095-4344(
2、2017)04-00499-06稿件接受：2016-12-07Ding Xiao-wei, Master, Attending physician, Department of Rehabilitation, Affiliated Central Hospital of Shenyang Medical University, Shenyang 110024, Liaoning Province, ChinaCorresponding author: Zhao Zhong-hai, Chief physician, Department of Rehabilitation, Affiliate
3、d Central Hospital of Shenyang Medical University, Shenyang 110024, Liaoning Province, China不同浓度厄贝沙坦对前成骨细胞分化和矿化的影响丁晓伟 1，徐 湲 2，闵 泽 1，千勇洙 1，何志丹 1，徐 洋 1，刘倩倩 1，赵忠海 1 (沈阳医学院附属中心医院， 1康复医学科， 2中心实验室，辽宁省沈阳市 110024)引用本文 ： 丁晓伟，徐湲，闵泽，千勇洙，何志丹，徐洋，刘倩倩，赵忠海 . 不同浓度厄贝沙坦对前成骨细胞分化和矿化的影响 J.中国组织工程研究， 2017， 21(4):499-504.DO
4、I:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.04.002 ORCID: 0000-0001-6605-5432(赵忠海)文章快速阅读：文题释义：厄贝沙坦：为血管紧张素受体拮抗剂，是常用的治疗高血压和心力衰竭的药物。厄贝沙坦主要通过诱导监测骨吸收、增加骨密度发挥作用，其不仅可在骨痂形成中发挥作用，同时也可抑制成骨细胞的基质钙化。多年来，关于厄贝沙坦与促进成骨细胞分化的研究较少，目前仍集中在动物水平。最近的研究表明，厄贝沙坦在成骨细胞分化过程发挥重要调节作用，可改善骨质疏松。Runt 相关转录因子 2：对骨髓间充质干细胞向成骨细胞的分化有一定的促成骨效应。Runt 相关转录因子
5、 2基因的缺失将导致骨发育不良或骨发育终止，可见 Runt 相关转录因子 2 基因是成骨细胞分化的控制基因，也是骨形成过程中的控制基因。Runt 相关转录因子 2 能调节多种成骨细胞的特异性标志物的增殖分化和表达。摘要背景：有研究发现，血管紧张素受体拮抗剂对骨的保护作用强于较血管紧张素转换酶抑制剂。目的：观察不同浓度血管紧张素受体拮抗剂厄贝沙坦对小鼠前成骨细胞分化和矿化的影响。方法：选取对数生长期小鼠前体成骨细胞株 MC3T3-E1，分 4 组培养，分别加入含 0(对照) ，0.001，0.01，0.1 mmol/L 厄贝沙坦的成骨诱导培养基培养。诱导培养 10 d，采用碱性磷酸酶染色观察细胞
6、分化情况；诱导培养 21 d，采用茜素红染色观察细胞矿化情况；诱导培养 1，4，7 ，14，21 d，RT-PCR 检测细胞成骨细胞内骨钙素、碱性磷酸酶、Runt 相关转录因子 2mRNA 的相对表达量。结果与结论：碱性磷酸酶染色：0.001，0.01，0.1 mmol/L 厄贝沙坦组碱性磷酸酶活性均高于对照组(P 0.05)，其中以 0.01 mmol/L 效果最明显；茜素红染色：0.001 ，0.01 ，0.1 mmol/L 厄贝沙坦组钙结节数量及面积均高于对照组(P 0.05)，其中以 0.01 mmol/L 效果最明显；RT-PCR 检测：0.01 mmol/L 厄贝沙坦组诱导培养不同
7、时间点的碱性磷酸酶、Runt 相关转录因子 2、骨钙素 mRNA 相对表达量均高于对照组(P 0.05)；结果表明：0.01 mmol/L 厄贝沙坦可显著促进成骨细胞的分化和矿化。关键词：组织构建；骨细胞；厄贝沙坦；成骨细胞；分化；矿化；碱性磷酸酶染色主题词：成骨细胞；细胞分化；碱性磷酸酶；组织工程Effects of different concentrations of irbesartan on the differentiation and mineralization of preosteoblasts Ding Xiao-wei1, Xu Yuan2, Min Ze1, Qian
8、Yong-zhu1, He Zhi-dan1, Xu Yang1, Liu Qian-qian1, Zhao Zhong-hai1 (1Department of Rehabilitation, 2Central Laboratory, Affiliated Central Hospital of Shenyang Medical University, Shenyang 110024, Liaoning Province, China)AbstractBACKGROUND: Angiotensin II receptor antagonists have been found to exer
9、ct a stronger protective effect on bone than angiotensin converting enzyme inhibitors.OBJECTIVE: To investigate the effect of different concentrations of irbesartan (angiotensin II receptor antagonist) on the differentiation and mineralization of mouse preosteoblasts. METHODS: Mouse preosteoblast ce
10、ll lines MC3T3-E1 in logarithmic phase were selected and cultured in the osteogenic induction medium containing 0 (control group), 0.001, 0.01, 0.1 mmol/L irbesartan, respectively. Ten days later, the cell differentiation was observed by alkaline phosphatase staining. The mineralization was 厄贝沙坦促进小鼠
11、前成骨细胞的分化和矿化小鼠前体成骨细胞株 MC3T3-E1分别加入含 0(对照)，0.001，0.01，0.1 mmol/L 厄贝沙坦的成骨诱导培养基培养分别进行碱性磷酸酶染色、茜素红染色及 RT-PCR 检测结果表明：0.01 mmol/L厄贝沙坦可显著促进成骨细胞的分化和矿化丁晓伟，等 . 不同浓度厄贝沙坦对前成骨细胞分化和矿化的影响P.O. Box 10002, Shenyang 110180 www.CRTER.org500 500www.CRTER.orgobserved by alizarin red staining after 21 days of culture. mRNA
12、expressions of osteocalcin, alkaline phosphatase and Runt-associated transcription factor 2 in osteoblasts were detected by real-time PCR at 1, 4, 7, 14 and 21 days of culture. RESULTS AND CONCLUSION: The activity of alkaline phosphatase in all the irbesartan groups (0, 0.001, 0.01, 0.1) was higher
13、than that in the control group (P 0.05), which was the most obvious in 0.01 mmol/L. The number and area of calcium nodules in each irbesartan group were significantly higher than those in the control group (P 0.05), especially in 0.01 mmol/L. Compared with the control group, 0.01 mmol/L irbesartan s
14、ignificantly upregulated the mRNA expressions of osteocalcin, alkaline phosphatase and Runt-associated transcription factor 2 (P 0.05). These results suggest that 0.01 mmol/L irbesartan significantly promotes the differentiation and mineralization of osteoblasts.Subject headings: Osteoblasts; Cell D
15、ifferentiation; Alkaline Phosphatase; Tissue EngineeringCite this article: Ding XW, Xu Y, Min Z, Qian YZ, He ZD, Xu Y, Liu QQ, Zhao ZH. Effects of different concentrations of irbesartan on the differentiation and mineralization of osteoblasts. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2017;21(4):499-504.0 引言
16、 Introduction成骨细胞是骨形成的主要功能细胞，负责骨基质的合成、分泌和矿化。骨不断地进行着重建，骨重建过程包括破骨细胞贴附在旧骨区域，分泌酸性物质溶解矿物质，分泌蛋白酶消化骨基质，形成骨吸收陷窝；其后，成骨细胞移行至被吸收部位，分泌骨基质，骨基质矿化而形成新骨。破骨与成骨过程的平衡是维持正常骨量的关键。血管紧张素转化酶抑制剂和血管紧张素受体拮抗剂一般被用于高血压治疗，很少有临床试验能够证明血管紧张素II 受体在减少骨质疏松骨折风险中的作用，有研究通过比较血管紧张素受体拮抗剂和血管紧张素转化酶抑制剂对去卵巢大鼠骨密度的影响发现，血管紧张素受体拮抗剂具有比血管紧张素转化酶抑制剂更大的骨
17、保护作用。同时有证据表明，血管紧张素转换酶抑制剂对骨的作用已被混淆，使用血管紧张素受体拮抗剂类药物可提高高血压及正常血压大鼠的骨密度，改善骨质量 1。有研究显示，血管紧张素可刺激骨桥蛋白的表达。骨桥蛋白由成骨细胞、骨细胞及破骨细胞等分泌，参与骨基质矿化和吸收。李广悦等 2实验研究显示， 10-8-10-6 mol/L血管紧张素II能够在蛋白水平上刺激成骨骨桥蛋白表达，并随着血管紧张素II 作用浓度的提高，骨桥蛋白表达显著增加，并随着作用时间的延长，骨桥蛋白表达量也明显增加。研究拟通过对小鼠前体成骨细胞株MC3T3-E1应用血管紧张素II 受体拮抗剂(厄贝沙坦)，观察其对成骨细胞分化及矿化的影响
18、。1 材料和方法 Materials and methods 1.1 设计 分组对比，体外细胞学观察实验。1.2 时间及地点 实验于2014年6月至2015年12月在沈阳医学院附属中心医院完成。1.3 材料 小鼠前体成骨细胞株MC3T3-E1购自上海生命科学研究院细胞资源中心；高糖a-MEM培养基、胎牛血清(杭州四季青公司)；厄贝沙坦(杭州制药有限公司)；倒置显微镜(日本Olympus公司)。1.4 实验方法成骨细胞系 MC3T3-E1的传代培养及分化能力检测 ：按照90%DMEM+体积分数10% 胎牛血清的比例配制普通培养基，将细胞在普通培养基、37 、体积分数5%CO 2条件下培养，二三天
19、更换1次培养基，待细胞长至 80%左右进行细胞传代及细胞冻存处理。 细胞传代 ：待细胞融合度达到80%左右时，可进行细胞传代，先吸取旧培养基，沿培养瓶壁缓缓注入适量PBS，充分洗涤后将洗涤液吸出，再次重复上述洗涤过程后将洗涤液吸出，滴加0.25%胰蛋白酶1.0 -2.0 mL，将贴壁的梭形细胞消化成单个球形细胞，倒置显微镜低倍视野下观察细胞消化情况，当约80% 细胞变成球形，少量贴壁细胞呈漂浮状可停止消化，加入与消化液等量的培养基终止消化。以吸管吹打混匀消化终止液，将仍然贴壁的细胞吹打进入悬浮状态，顺序可按照至上而下、从左到右，培养瓶底面的各处均需进行吹打，动作尽量轻柔避免造成不必要的细胞损失
20、，吹打结束后可置于倒置显微镜下观察细胞状态。将含有大量细胞的消化液移入离心管中，800 r/min离心 5 min，离心结束后，离心管底部可见淡黄色或灰白色的细胞团块，将上清液吸出后重新加入新的培养基，再次吹打混匀，最后将细胞悬浮液平均加入新的培养瓶中继续培养，根据细胞数量，采用一传二或一传三的方式传代。细胞冻存 ：事先配置好冻存液，冻存液一般现配现用，即将体积分数90%胎牛血清+10%DMSO混匀，总量根据所冻存的细胞数而定，一般每根容积为2 mL的冻存管可用于冻存1 mL细胞悬浮液。具体步骤同上，直至离心结束，将离心管中的上清吸出，尽量吸净上清液，加入事先配置好的 冻 存 液 ， 吹 打
21、混 匀 后 分 装 入 冻 存 管 中 ， 封 口 后 采用 逐 渐 降 温 冻 存 法 降 温 至 -196 ： 4 30 min， -20 2 h， -80 过夜，置入液氮中长期保存。诱导培养基的配制 ：抗坏血酸：以双蒸水为溶剂溶解50 mg抗坏血酸，定容至10 mL，配成5 g/L的抗坏血酸母液，0.22 m滤膜过滤后避光 4 封口保存，使用时，每100 mL培养基加入1 mL抗坏血酸母液，培养基终浓度为 50 mg/L； -磷酸甘油酸钠：以双蒸水为溶剂溶解丁晓伟，等 . 不同浓度厄贝沙坦对前成骨细胞分化和矿化的影响ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: Z
22、LKHAH 501www.CRTER.org2.3 g -磷 酸 甘 油 酸 钠 ， 定 容 至 10 mL， 配 成 1 mol/L的母 液 ， 0.22 m滤膜过滤后4 封口保存，使用时，每100 mL培养基加入1 mL -磷酸甘油酸钠母液，培养基的终浓度为 10 mmol/L； 地 塞 米 松 ： 以 为 溶 剂 溶 解 地 塞 米松 3.925 mg， 定容至10 mL，配成 10-6 mol/mL的母液，0.22 m膜过滤后4 封口保存，使用时，每100 mL培养基加入0.1 mL地塞米松母液，培养基终浓度为 10-8 mol/L。 小鼠前成骨细胞的成骨诱导 ：将前成骨细胞以90%D
23、MEM+体积分数10%胎牛血清培养基进行培养，待细胞铺满培养面40%-50%时，可更换为诱导培养基。更换为成骨培养基后，部分前成骨细胞可出现死亡，细胞密度较高部位细胞死亡率稍低，而细胞密度较低部位细胞死亡率较高。以诱导培养基培养24 h后，更换为含不同浓度厄贝沙坦的诱导培养基0(对照)，0.001，0.01，0.1 mmol/L进行分组培养。1.5 主要观察指标RT-PCR检测成骨细胞骨钙素、碱性磷酸酶、 Runt相关转录因子 2mRNA的相对表达量 ：为了证实厄贝沙坦对成骨细胞分化功能有一定的影响作用，在含不同浓度厄贝沙坦诱导培养基诱导培养第1， 4，7，14，21天，将成骨细胞以110 4
24、/孔的密度接种于六孔板上，通过real-timePCR技术分别检测出各组骨钙素、碱性磷酸酶、Runt相关转录因子2mRNA 的相对表达量。 细胞总的RNA提取： 将六孔板的培养基弃去，用无菌PBS冲洗1次，在每个孔的细胞中加入Trizol试剂1 mL，在冰块上放置5 min，用枪头吹打二三次。将各孔裂解液吸到1.5 mL的EP 管中，每个EP管中加入氯仿 0.2 mL，然后用力震荡15 s，在30 下孵育 3 min，4 12 000g离心15 min。离心后液体可分为3层，将上层无色液体吸入另一新的EP 管中，加入同样体积的异丙醇0.4-0.5 mL，均匀混和，在15 下孵育30 min，然
25、后 4 下以12 000g离心10 min。 弃去上清，在沉淀中加入 1 mL体积分数75% 的乙醇，涡旋震荡30 s， 4 下 7 500g离心5 min。弃掉上清，管内沉淀物在超净的工作台鼓风静置干燥5 min。在沉淀中加入DEPC水 20 L溶解，分装每管5 L，保存在-70 冰箱；反转录：根据每个样品总 RNA的浓度，将每个样品的总RNA浓度稀释到100 g/L。在 0.2 mL PCR管 中 加 入 0.2 g总 RNA， Oligo(dT)18引 物 0.2 g，加入DEPC水处理，使总的体积达到8 L，在 4 下8 000 r/min 瞬时离心后，在 PCR仪内70 下孵育 5
26、min， 之 后 迅 速 放 置 冰 盒 上冷 却 。 加 去 5RTase Buffer (250 mmol/L Tris-HCl(pH=8.3)， 250 mmol/L KCl， 20 mmol/L MgCl2，50 mmol/L DTT)4 L，10 mmol/L dNTPmix (dATP、dCTP、dGTP 、dTTP ，各10 mmol/L) 2L，瞬时离心后，在PCR仪内 37 下孵育 5 min。以上的实验步骤均在冰上操作完成。将1 L RertAiddTM M-MLV Revserse Tramscriptase(200 U/L) 瞬时离心后，在 PCR仪内43 下孵育1 h
27、。之后 70 10 min终止反应，所得的即为cDNA，放置于-20 冰箱内保存备用；目的PCR片段扩增：用实用定量引物进行RT-PCR，在0.2 mLPCR管逐步加入 2.0 g cDNA，10RT-PCR 扩增缓冲液 2.0 L，dNT (dATP、 dCTP、 dGTP、 dTTP， 各10 mmol/L) 1.5 L， 1.0 L上游引物(10 mmol/L)，1.0 L下游引物 (10 mmol/L)，Tap酶0.2 L，加RNase Free水到总体积为20 L。以上的步骤应在冰上操作。瞬时离心后，将PCR反应液放置在 RT-PCR反应仪器上进行PCR扩增反应，RT-PCR 反应条
28、件为：95 预变性10 s；95 变性5 s，退火30 s，共 40个循环；熔解曲线 95 60 s，55 30 s，95 30 s，1 个循环。以-actin 作为内参来估计初始拷贝数，反应的特异性通过溶解曲线来分析，用2 -Ct法来计算细胞相关基因的相对表达量，用于统计学的分析。碱性磷酸酶及茜素红染色 ：茜素红染色液的配制：称取14.41 g茜素红溶解于100 mL去离子水中，充分搅拌混匀后，将pH值调整为4.1，过滤备用； 碱性磷酸酶染色工作液的配置：将33 L BC2P与66 L NBT混合，PBS补足至 10 mL。用PBS洗细胞3 次，加入适量40 g/L多聚甲醛，室温避光固定30
29、 min，同时按照操作说明配制碱性磷酸酶染液。30 min后PBS 洗细胞3次，分别加入碱性磷酸酶染液( 含不同浓度厄贝沙坦诱导培养基诱导培养第10天 )和茜素红染液( 含不同浓度厄贝沙坦诱导培养基诱导培养第21天) 。碱性磷酸酶染色于室温环境下，避光染色15 min。茜素红染色于37 环境中孵育30 min。之后使用PBS和双蒸水交替冲洗细胞3 次。倒置显微镜观察染色效果并拍照。1.6 统计学分析 采用SPSS 18.0 for windows软件进行统计学处理，计数资料采用 2检验，计量资料采用Error!s表示，采用t 检验，当P 0.05时表示差异有显著性意义。2 结果 Results
30、2.1 厄贝沙坦对成骨细胞碱性磷酸酶mRNA 相对表达量RT-PCR 引物：引物 正向引物 反向引物-actin 5-AGA TGT GGA TCA GCA AGC AG-35-GCG CAA GTT AGG TTT TGT CA-3碱性磷酸酶 5-GCA GCT TGG TGC ACA CCT AG-35-GAG ACA TTT TCC CGT TCA CC-3Runt 相关转录因子25-CCG GCA AGA TGA GCG AGG TCA-35-GTG GGT TGA GAA GCG GCT CT-3骨钙素 5-ATG AGG ACC CTC TCT CTG CT-35-GGA GCT
31、GCT GTG ACA TCC AT-3丁晓伟，等 . 不同浓度厄贝沙坦对前成骨细胞分化和矿化的影响P.O. Box 10002, Shenyang 110180 www.CRTER.org502www.CRTER.org的影响 0.001，0.01，0.1 mmol/L厄贝沙坦组培养细胞第1，4 ，7 ，14天的碱性磷酸酶mRNA水平高于对照组(P 0.05)；培养第21天时，仅0.01 mmol/L厄贝沙坦组碱性磷酸酶mRNA水平高于对照组(P 0.05)，见图1。2.2 厄贝沙坦对成骨细胞Runt 相关转录因子2 mRNA相对表达量的影响 0.01，0.1 mmol/L厄贝沙坦组培养第1
32、，4，7，14天的Runt相关转录因子2mRNA水平高于对照组(P 0.05)，0.001 mmol/L厄贝沙坦组培养第1，4，14天的Runt相关转录因子2 mRNA水平高于对照组(P 0.05)；培养 21天时，仅 0.01 mmol/L厄贝沙坦组Runt相关转录因子2 mRNA水平高于对照组(P 0.05)，见图2。2.3 厄贝沙坦 对成骨细胞骨钙素mRNA 相对表达量的影响 0.01 mmol/L厄贝沙坦组骨钙素 mRNA相对表达量始终高于对照组(P 0.05)，见图3。对照组 0.1 mmol/L 厄贝沙坦组0.01 mmol/L 厄贝沙坦组 0.001 mmol/L 厄贝沙坦组对照
33、组 0.1 mmol/L 厄贝沙坦组0.01 mmol/L 厄贝沙坦组 0.001 mmol/L 厄贝沙坦组0 d 1 d 4 d 7 d 14 d 21 d 0 d 1 d 4 d 7 d 14 d 21 d图 1 不同浓度厄贝沙坦对成骨细胞分化过程中碱性磷酸酶 mRNA表达水平的影响Figure 1 Effects of different concentrations of irbesartan on alkaline phosphatase mRNA expression during osteogenic differentiation图注：与对照组比较， aP 0.05。图 2 不
34、同浓度厄贝沙坦对成骨细胞分化过程中 Runt 相关转录因子2mRNA 表达水平的影响Figure 2 Effects of different concentrations of irbesartan on Runt-associated transcription factor 2 mRNA expression during osteogenic differentiation图注：与对照组比较， aP 0.05。成骨分化时间 成骨分化时间4.03.53.02.52.01.51.00.50碱性磷酸酶mRNA相对表达4.03.53.02.52.01.51.00.50Runt相关转录因子2mR
35、NA相对表达a a a aaa aaaaaaaa a a aaaaaaaaa图 4 各组成骨细胞碱性磷酸酶染色结果(400)Figure 4 Alkaline phosphatase staining results of osteoblasts in each group (400)图注：图中 A 为对照组，B-D 分别为0.1，0.01，0.001 mmol/L 厄贝沙坦组。各组细胞质内均可见颗粒状碱性磷酸酶，各浓度厄贝沙坦组胞质阳性颗粒数均较对照组多，其中以 0.01 mmol/L 厄贝沙坦组碱性磷酸酶阳性颗粒数最多。图 5 各组成骨细胞茜素红染色观察Figure 5 Osteoblas
36、ts in each group after alizarin red staining图注：图中 A 为对照组，B-D 分别为0.1，0.01，0.001 mmol/L 厄贝沙坦组。各浓度厄贝沙坦组钙结节数量及面积均较对照组多，其中0.01 mmol/L 厄贝沙坦组钙结节最多。对照组 0.1 mmol/L 厄贝沙坦组0.01 mmol/L 厄贝沙坦组 0.001 mmol/L 厄贝沙坦组0 d 1 d 4 d 7 d 14 d 21 d图 3 不同浓度厄贝沙坦对成骨细胞分化过程中骨钙素 mRNA 表达水平的影响Figure 2 Effects of different concentrati
37、ons of irbesartan on osteocalcin mRNA expression during osteogenic differentiation图注：与对照组比较， aP 0.05。成骨分化时间4.03.53.02.52.01.51.00.50骨钙素mRNA相对表达 aaaaaA B C DA B C D丁晓伟，等 . 不同浓度厄贝沙坦对前成骨细胞分化和矿化的影响ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH 503www.CRTER.org2.4 碱性磷酸酶染色 各 组 镜 下 细 胞 质 内 均 可 见 颗 粒 状碱 性 磷 酸 酶
38、， 提 示 各 组 前 成 骨 细 胞 均 出 现 成 骨 分 化 ； 各浓 度 厄 贝 沙 坦 组 胞 质 阳 性 颗 粒 数 均 较 对 照 组 多 ， 其 中 以0.01 mmol/L厄 贝 沙 坦 组 碱性磷酸酶阳性颗粒数最多，见图4。2.5 茜素红染色 各组均可见被染成紫红色的钙结节，提示各组均可诱导出现矿化；各浓度厄贝沙坦组钙结节数量及面积均较对照组多，其中0.01 mmol/L厄贝沙坦组钙结节最多，见图5。3 讨论 Discussion实验取诱导第14天的成骨细胞进行碱性磷酸酶染色，各浓度药物组较对照组均有促成骨作用，0.01mmol/L厄贝沙坦组较其他浓度有较强的促成骨作用。实
39、验取诱导至 21 d的细胞进行茜素红染色，可见0.01mmol/L厄贝沙坦组钙化结节表达最为明显，提示0.01 mmol/L厄贝沙坦能显著提高促进钙盐沉积，促进成骨细胞矿化能力。与对照组相比，0.01 mmol/L厄贝沙坦组 Runt相关转录因子2 、碱性磷酸酶、骨钙素mRNA表达量明显增加 (P均 0.05)。近年来，动物和流行病学证据表明，高血压与钙离子的代谢异常有关，其主要是钙流失增加，增加了骨质疏松风险 3-4。血管紧张素转化酶抑制剂和血管紧张素受体拮抗剂是常用的治疗高血压和心力衰竭的药物。有研究证明，血管紧张素受体拮抗剂类药物在治疗高血压和正常血压骨质疏松大鼠中均可显著增加骨密度，降
40、低骨质疏松风险。但在人类临床实验中，关于血管紧张素受体拮抗剂类药物对骨骼影响的研究甚少。厄贝沙坦主要通过诱导监测骨吸收，增加骨密度发挥作用，其不仅可在骨痂形成中发挥作用，同时也可抑制成骨细胞的基质钙化。骨形成分为3个阶段：细胞增殖、细胞外基质的产生及矿化。在细胞增殖阶段，胶原蛋白开始产生，之后碱性磷酸酶、骨钙素表达逐渐增加，与矿化基质的分化及稳定相关，此后钙盐开始沉积 5-6。骨代谢主要包括骨形成和骨吸收，正常骨量的维持主要是通过成骨过程与破骨过程平衡实现的。成骨细胞可特异性分泌多种生物活性物质，这些活性物质可直或是间接地调节骨的形成和重建过程。它富含碱性磷酸酶和骨钙素，二者分别是成骨细胞早期
41、分化和晚期的分化标志 7。骨钙素成骨细胞晚期合成的，成骨细胞外基质钙化和骨钙素高度相关，是成骨骨细胞外基质特异性蛋白分化标志。实验通过实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)检测骨钙素mRNA的活性。实验中发现厄贝沙坦可促进骨钙素mRNA的表达。碱性磷酸酶活性、骨钙素和I型胶原的表达及矿化结节的检测是鉴定骨髓间充质干细胞成功分化为成骨细胞的主要标志 8-9。碱性磷酸酶可分解有机质中磷酸，增加局部无机磷酸盐浓度，促进矿化，是成骨细胞分化和功能成熟的前期标志 10，其活性越高，说明前期成骨细胞向成熟成骨细胞的分化越明显。实验实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)检测碱性磷酸酶的活性，发现厄贝沙坦
42、可促进碱性磷酸酶mRNA的表达。Runt相关转录因子2对骨髓间充质干细胞向成骨细胞的分化有一定的促成骨效应 11。 Runt相关转录因子2基因的缺失将导致骨发育不良或骨发育终止，可见 Runt相关转录因子2基因是成骨细胞分化的控制基因，也是骨形成过程中的控制基因。Runt相关转录因子2能调节多种成骨细胞的特异性标志物的增殖分化和表达 12。Valenti等 13研究发现，Runt相关转录因子2 表达相对较高情况下能促进新生成骨细胞的分化，Runt相关转录因子2基因与成骨细胞特异顺式作用元结合后，能够激活骨钙蛋白、骨桥素、骨涎蛋白和工型胶原基因的转录和表达。Runt相关转录因子2作为成骨细胞分化
43、的重要调节因子 14-15，在成骨细胞的诱导、复制和成熟的整个过程中发挥着重要作用。多数影响成骨细胞分化的信号通路及影响其分化的转录因子，都是通过直接影响 Runt相关转录因子 2的产生及和活化Runt相关转录因子2 的活性来发挥其相应生物学作用的。实验采用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)检测Runt相关转录因子2 mRNA的相对表达量，发现厄贝沙坦可促进Runt相关转录因子2 mRNA的表达。多年来，关于厄贝沙坦与促进成骨细胞分化的研究较少，目前仍集中在动物水平。最近的研究表明，厄贝沙坦在成骨细胞分化过程发挥重要调节作用，可改善骨质疏松。血管紧张素受体拮抗剂类药物发挥此作用主要通过专
44、向阻断血管紧张素受体中AT1 受体，对成骨细胞的分化产生影响 16，目前，国内外的很多实验均证明，持续性应用血管紧张素受体拮抗剂类药物(调整了年龄和体重等影响因素后) 可显著增加股骨颈的骨密度。在中国女性和男性患者中 17-26，持续性应用血管紧张素转化酶抑制剂患者的股骨颈骨密度显著优于未用药者，同样的结果在长期血管紧张素受体拮抗剂药物应用的患者中也得到证实。综上所述，实验发现0.01 mmol/L厄贝沙坦促进成骨细胞增殖和分化的作用最为显著，在将来随着对其作用机制的进一步研究和生物科学技术的发展，对厄贝沙坦的有效调控可能会成为促进成骨细胞分化的一种新技术。作者贡献 ：第 一 作 者 进 行
45、实 验 设 计 ，实 验 实 施 为 第 一 作 者 ，实 验 评估 为 通 讯 作 者 ，资 料 收 集 为 第 一 作 者 ，第 一 作 者 成 文 ，通 讯 作 者 审 校 。利益冲突 ：所有作者共同认可文章无相关利益冲突。伦理问题 ：未涉及伦理冲突内容文章查重 ：文章出版前已经过 CNKI 反剽窃文献检测系统进行3 次 查 重。文章外审 ：文章经国内小同行外审专家审核，符合本刊发稿宗旨。作者声明 ：文章第一作者对研究和撰写的论文中出现的不端行为承担责任。论文中涉及的原始图片、数据(包括计算机数据库)记录及样本已按照有关规定保存、分享和销毁，可接受核查。丁晓伟，等 . 不同浓度厄贝沙坦对
46、前成骨细胞分化和矿化的影响P.O. Box 10002, Shenyang 110180 www.CRTER.org504www.CRTER.org文章版权 ：文章出版前杂志已与全体作者授权人签署了版权相关协议。开放获取声明 ：这是一篇开放获取文章，文章出版前杂志已与全体作者授权人签署了版权相关协议。根据知识共享许可协议“ 署名-非商业性使用-相同方式共享3.0” 条款，在合理引用的情况下，允许他人以非商业性目的基于原文内容编辑、调整和扩展，同时允许任何用户阅读、下载、拷贝、 传递、打印、检索、超级链接该文献，并为之建立索引，用作软件的输 入数据或其它任何合法用途。4 参考文献 Referen
47、ces1 Seo KW,Lee SJ,Ye BH,et al.Mechanical stretch enhances the expression and activity of osteopontin and MMP-2 via the Akt1/AP-1 pathways in VSMC.J Mol Cell Cardiol.2015;85:13-24.2 李广悦,谢芸,岳源,等.血管紧张素对小鼠成骨细胞骨桥蛋白和基质金属蛋白酶2 表达的影响 J.国际口腔医学杂志, 2013, 40(3):291-296.3 Resnick LM,Laragh JH,Sealey JE,et al.Div
48、alent cations in essential hypertension. Relations between serum ionized calcium,magnesium,and plasma renin activity.N Engl J Med. 1983;309(19):888-891.4 Cappuccio FP,Kalaitzidis R,Duneclift S,et al.Unravelling the links between calcium excretion,salt intake,hypertension,kidney stones and bone metab
49、o-lism.J Nephrol. 2000;13:169-177.5 Balcerzak M,Hamade E,Zhang L,et al.The roles of annexins andalkaline phosphatase in mineralization process.Acta Biochim Pol.2003;50(4):1019-1038. 6 Siggelkow H,Rebenstorff K,Kurre W,et al.Development of theosteoblast phenotype in primary human osteoblasts in culture:comparison with rat calvarial c
