1、1. RNA 样品的制备和检测用 trizol 提取细粒棘球蚴的总 RNA2. mRNA 的纯化利用 Invirtrogen 的 Oligo(dT)25 磁珠进行 mRNA 纯化，具体步骤参照其说明书。3. 反转录第一链的合成按照 PrimeScriptTM 1st strand cDNA Synthesis Kit 说明书进行 PCR 反应4. 反转录第二条链的合成在 cDNA 第一链合成物混合物中加入 51ul 超纯水，加入 20ul 5X second strand buffer 和3ul dNTP mix (10mM),在冰上放置 5min，然后加入 1LRNaseH(2U/L) 和
2、5L DNA pol 1(10 U/L)混匀后，置于 162.5 小时，按照 QIAquick PCR Purification Kit 说明书进行纯化，最后将样品溶于 35L EB 溶液中。5. 末端修复取上一步纯化后的 DNA35 L ，加入 50L T4 DNA ligase buffer(2*)、4LdNTPs mix、 T4 DNA polymerase、Klenow DNA polymerase 和 T4PNK,在 20条件下反应30min，利用 OIAquick PCR Purification Kit 进行纯化后将样品溶于 EB 溶液中6. 3， 末端加 A取上一步纯化后的 D
3、NA Klenow buffer，加入 Klenow buffer、dATP、Klenow exo-，在37 下反应 30min，然后用 PCR 纯化试剂盒进行纯化，最后将样品溶于 EB 溶液中。7. 加衔接头取上一步纯化后的 DNA 加入 T4 DNA ligase buffer、Adapter oligo mixa 和 DNA ligase，在PCR 纯化试剂盒进行纯化，最后将样品溶于 EB 溶液中。8. 连接产物的胶回收纯化样品进行电泳，切取 250bp 到 300bp 的条带，放入称量好的 eppendorf 管中。按照QIAquick Gel Extraction Kit 说明书进行
4、胶纯化回收，回收产物溶于 EB 溶液中。9. PCR10. PCR 产物的胶回收纯化11. DNA 制备产物检测利用 Agligent 2100 bioanalyzer 仪进行检测，检测流程参照其说明书。12. DNA 测序DNA 测序用 Solexa 测序技术完成13. 组装组装时，将测序产生的 short read 从头组装成 conting，然后把 paired-end 数据比对到contig 上，如果有 paired-end 关系将两个 contig 连接起来，则认为这些 contigs 是一个scaffold 的片段，这样可以将多个 contigs 连接成 scaffold。利用 r
5、eads 对 scaffold 中的洞进行填补（gap filling） ，生成最终的 scaffold sequence。Scaffold 可以看作是转录本水平上的序列，对转录组的分析在 scaffold 水平上进行。具体过程：利用软件：solexa 的 soapdenovoA. 随即打散基因组，进行双端测序：扩增长度在 150-500bp 之间的短克隆，并直接测序B.将未处理（或者未经纠正的）reads 读入到内存中，并且用 deBruijin 图数据结构来表示 reads 间的 OverlapC.通过移除错误的连接，解决微小的重复来简化图：a.剪去短末端b.移除低覆盖度的边c.解决 re
6、ads 路径中得微小重复d.合并茎环：可能由于重复或者二倍体染色体组的混杂造成D.在简化图的基础上，我们在重复边界上打断连接，输出明确的序列作为 contigsE.我们重新用 reads 和 contigs 进行比对，使用双端信息来把单一的单一的 contigs 连接成scaffoldsF.最后，我们使用配对双端 resds 来填补 scaffolds 内部可能是由重复序列所造成的 Gap。希望对你理解有所帮助对组装结果分析（Contig 长度分布、Scaffold 长度分布、Unigene 长度分布）14. 数据分析A CDS（编码蛋白区域）的获得：将 scaffold 与 Nr 库比对获得
7、 scaffold 的 CDS 区域，对于没有比对到的 scaffold 则通过软件 ESTScan 预测来获得 scaffold 的 CDS 区域；蛋白功能和分类预测：将 scaffold-gene 和 COG 数据库进行比较，预测 scaffold-gene 可能的功能；scaffold-gene 代谢通路分析 : KEGG，京都基因与基因组百科全书 (KyotoEn 盯 dopediaofGenesandGenomes)，是系统分析基因功能，联系基因组信息和功能信息的知识库【24，25oKEGG 主要包括四个数据库:基因组信息存储在 GENES 数据库里;功能信息存储在 PATHWAY 数据库里;LIGAND 数据库包含化学物质、酶分子、酶反应等信息;而 BRITE(BiomolecularRelationsinInformationTransmissionandExpression)信息表达和传递的分子生物学关系数据库包含了与基因、蛋白和其他生物分子相关的网络计算和逻辑推理二元关系。
