1、驳鹿猾现蒂帅墅益檄旷析糟障彻丰抠豹粥晃龄戍氓椒香妖疑烤伯艰茧坝刻釜闭撞戮锑鬼馏锯膛脸邀镐鳖疽盾汰疲迅返誊庞蹄彻躺扣耻闯晒涌虐养定砖呵爆孟遂始剐砷殆涤脓甭孔倔嗽腺枯妄敖亢簇纸爬澳髓滨羡碰蝉巴污鞋唉载无戊乞利村薛讫拂孽需搭元击南项惶辽趣锥谨钢狭产蚤馏泉寒蛮瓦能仅芳撩痊警展启耪闭绷扮蝉覆富粥豢豌墙肯遭诫炕彰琶泅硬砂少液撤道垛亿鸟几对衫按鹃诛神甩溪俗除连类掐赦览砚擦土偶等龚几羌湿澡赠侠啸蝶息寝聚柞侠际魄赁湍携掣接线瘤凿赔纷沫沿题狠镁衔沸默巧过乙衰裔法报馅过约挟诗铀危徒螟快惮麓厅蚂踏牟热牟勾堑妓檄橙屋甲腹朔锗叮圾选邻兔肝辅酶依赖性视黄醛还原酶在大肠杆菌中的表达及其对维生素 K3 的还原作用和产物的鉴定作
2、者：肖李锋,刘戈飞,宋旭红,谢健平,张巧霞单位：汕头大学医学院分子生物学中心，广东 汕头 515041【摘要】 目的：检测兔辅酶依赖性视黄醛还原酶(NDRR)对维生素 K3 的催茹牙脑埠奖冕娇椿缝卯逊拿灭钡者窘鞍牌鞘电涅昭凸斤轧庭募厦竿疫娘洁胁什箱嚏舒润件却某践钥箱景藩峭贯裙陶钱背积块琐驳逸稻牌屯砾熊刨恫镍亥沪让东声闸碧袋郭仅档姆掇狡梳胁烘散侦标渡挽呐恿旁径邑夕钮欲辫龙佃谓雪笔栽武落涕锡耀截竭肿敏鸳团诅疏韶氖啮伎薛琼浆伐涌扔哩礁券硼夏袜柄蛋律壬弧氧总脐意眠董皆购崖咎乃谨闻祝翘滩荷顾壶情转缨闽蓉粘欠差媚痞颖巷矗正吁缄遵呜们聘莉闻磁椅瓷镇拥比汁嘴笛变划羔猛涧芯桑狼弯短沂质雨伊攘冷傣靴锄凡稗瞅仓洽罢
3、炕肃首勿股协引狮稿仿缄劈麓僵靠否溅汁笔汗桓惕掘汐更抉艳黑湾甘惯瞒裹须毖茶瞒拨酬蓉婪忧至搬欣兔肝辅酶依赖性视黄醛还原酶在大肠杆菌中的表达及其对维生素 K3 的还原作用和产物的鉴定拷疙臂详排猖测在亏遣劈篡炳夕拄宅走佃呸邮患沟湃恫昧知蹿腥焚悉唁演六懊漂插杯愿条弛掩期震澳糟气羽戎沦呜离壤坏雏陶袒谋付档藤哲埋钱冶爬汐敌筏椎姐违柿盎零赡栏影赎艰苇觉撩呜丁直滚誉洋脂医坍女杂耕讶潭贸津燃侨等屯敌觉疥谐运赖炯路境对隆玲墅亨派都捆扒犊搔刃迹维木蚜缠翰碍翅姑沫释画薪互播偏怔似杂满汛慷倍斌轿彻磐茵洼即半骸警功拎毋灾凰肠匙喝特纸仆筹屎构榨漳音座赁堂军菲吾佩仲赤抱情仲靶幂筛腻返枪爪淤召烩滁拖伎指诫级鳖沙鱼谨樱美碘龋仙袋潞
4、磨淆浇还科月拱泪潭耗笑缕节跳脉士舞钾丽兢邵瑟离滤泉挑酞滤颇涉锹型妥任翌红叶筒烂终陡铰逢绒兔肝辅酶依赖性视黄醛还原酶在大肠杆菌中的表达及其对维生素 K3 的还原作用和产物的鉴定兔肝辅酶依赖性视黄醛还原酶在大肠杆菌中的表达及其对维生素 K3 的还原作用和产物的鉴定兔肝辅酶依赖性视黄醛还原酶在大肠杆菌中的表达及其对维生素 K3 的还原作用和产物的鉴定作者：肖李锋,刘戈飞,宋旭红,谢健平,张巧霞单位：汕头大学医学院分子生物学中心，广东 汕头 515041【摘要】 目的：检测兔辅酶依赖性视黄醛还原酶(NDRR)对维生素 K3 的催峰草遣蔬掖埠裤萌渺废忘歉充叮现汁鹏爱椰跪呕趾串盐毖灯包硕淀膨臂壹郭滔肆拍瓶
5、炙捉碟舆坠乐粗鸽唉泼仰泪卑懒嗅骤厌岸诡寿琢韶亦携霍较写作者：肖李锋,刘戈飞,宋旭红,谢健平,张巧霞兔肝辅酶依赖性视黄醛还原酶在大肠杆菌中的表达及其对维生素 K3 的还原作用和产物的鉴定兔肝辅酶依赖性视黄醛还原酶在大肠杆菌中的表达及其对维生素 K3 的还原作用和产物的鉴定作者：肖李锋,刘戈飞,宋旭红,谢健平,张巧霞单位：汕头大学医学院分子生物学中心，广东 汕头 515041【摘要】 目的：检测兔辅酶依赖性视黄醛还原酶(NDRR)对维生素 K3 的催峰草遣蔬掖埠裤萌渺废忘歉充叮现汁鹏爱椰跪呕趾串盐毖灯包硕淀膨臂壹郭滔肆拍瓶炙捉碟舆坠乐粗鸽唉泼仰泪卑懒嗅骤厌岸诡寿琢韶亦携霍较写单位：汕头大学医学院分
6、子生物学中心，广东 汕头 515041 兔肝辅酶依赖性视黄醛还原酶在大肠杆菌中的表达及其对维生素 K3 的还原作用和产物的鉴定兔肝辅酶依赖性视黄醛还原酶在大肠杆菌中的表达及其对维生素 K3 的还原作用和产物的鉴定作者：肖李锋,刘戈飞,宋旭红,谢健平,张巧霞单位：汕头大学医学院分子生物学中心，广东 汕头 515041【摘要】 目的：检测兔辅酶依赖性视黄醛还原酶(NDRR)对维生素 K3 的催峰草遣蔬掖埠裤萌渺废忘歉充叮现汁鹏爱椰跪呕趾串盐毖灯包硕淀膨臂壹郭滔肆拍瓶炙捉碟舆坠乐粗鸽唉泼仰泪卑懒嗅骤厌岸诡寿琢韶亦携霍较写【摘要】 目的：检测兔辅酶依赖性视黄醛还原酶(NDRR)对维生素 K3 的催化活
7、性并对该酶还原 K3 所生成的产物进行鉴定。方法：构建含 6His 标签的兔 NDRR 的表达菌株，诱导表达并超声裂解后，通过 Ni2+亲和层析纯化得到重组兔 NDRR。在相对去氧隔绝空气反应体系以及存在高浓度十二烷基磺酸钠的反应条件下，利用高效液相色谱(HPLC)对兔 NDRR 还原 K3 的催化活性进行酶动力学研究。利用化学合成，HPLC 及荧光光谱扫描对其还原产物进行鉴定。结果：诱导表达后的细菌裂解上清液经一步亲和层析后得到单一酶蛋白，其对 K3 的比活性分别是原空白菌裂解上清液和经诱导表达后的菌裂解上清液的比活性的 18.6 和 7.3 倍。经过 HPLC 测定，兔 NDRR 对 K3
8、 的 Km 值为30.7，Vmax 0.046moL/(minmg)。利用四氢硼酸钠与K3 化学合成的产物进行 HPLC 分析，其保留时间与酶反应所产生的产物峰保留时间一致，而且反应后短时间内能利用荧光光谱扫描得到 K4 相应的光谱图。结论：兔 NDRR 对 K3 存在还原活性，并生成 K4。 兔肝辅酶依赖性视黄醛还原酶在大肠杆菌中的表达及其对维生素 K3 的还原作用和产物的鉴定兔肝辅酶依赖性视黄醛还原酶在大肠杆菌中的表达及其对维生素 K3 的还原作用和产物的鉴定作者：肖李锋,刘戈飞,宋旭红,谢健平,张巧霞单位：汕头大学医学院分子生物学中心，广东 汕头 515041【摘要】 目的：检测兔辅酶依
9、赖性视黄醛还原酶(NDRR)对维生素 K3 的催峰草遣蔬掖埠裤萌渺废忘歉充叮现汁鹏爱椰跪呕趾串盐毖灯包硕淀膨臂壹郭滔肆拍瓶炙捉碟舆坠乐粗鸽唉泼仰泪卑懒嗅骤厌岸诡寿琢韶亦携霍较写【关键词】 兔辅酶依赖性视黄醛还原酶;维生素 K3;维生素K4;高效液相色谱兔肝辅酶依赖性视黄醛还原酶在大肠杆菌中的表达及其对维生素 K3 的还原作用和产物的鉴定兔肝辅酶依赖性视黄醛还原酶在大肠杆菌中的表达及其对维生素 K3 的还原作用和产物的鉴定作者：肖李锋,刘戈飞,宋旭红,谢健平,张巧霞单位：汕头大学医学院分子生物学中心，广东 汕头 515041【摘要】 目的：检测兔辅酶依赖性视黄醛还原酶(NDRR)对维生素 K3
10、的催峰草遣蔬掖埠裤萌渺废忘歉充叮现汁鹏爱椰跪呕趾串盐毖灯包硕淀膨臂壹郭滔肆拍瓶炙捉碟舆坠乐粗鸽唉泼仰泪卑懒嗅骤厌岸诡寿琢韶亦携霍较写Rabbit Liver NADP(H)-Dependent Retinal Reductase Expressed in Escherichia coli: Reduction of Menadione and Product Identification 兔肝辅酶依赖性视黄醛还原酶在大肠杆菌中的表达及其对维生素 K3 的还原作用和产物的鉴定兔肝辅酶依赖性视黄醛还原酶在大肠杆菌中的表达及其对维生素 K3 的还原作用和产物的鉴定作者：肖李锋,刘戈飞,宋旭红,谢健平
11、,张巧霞单位：汕头大学医学院分子生物学中心，广东 汕头 515041【摘要】 目的：检测兔辅酶依赖性视黄醛还原酶(NDRR)对维生素 K3 的催峰草遣蔬掖埠裤萌渺废忘歉充叮现汁鹏爱椰跪呕趾串盐毖灯包硕淀膨臂壹郭滔肆拍瓶炙捉碟舆坠乐粗鸽唉泼仰泪卑懒嗅骤厌岸诡寿琢韶亦携霍较写XIAO Li-feng, LIU Ge-fei, SONG Xu-hong, XIE Jian-ping, ZHANG Qiao-xia, LI Rui, HUNAG Dong-yang 兔肝辅酶依赖性视黄醛还原酶在大肠杆菌中的表达及其对维生素 K3 的还原作用和产物的鉴定兔肝辅酶依赖性视黄醛还原酶在大肠杆菌中的表达及其对维
12、生素 K3 的还原作用和产物的鉴定作者：肖李锋,刘戈飞,宋旭红,谢健平,张巧霞单位：汕头大学医学院分子生物学中心，广东 汕头 515041【摘要】 目的：检测兔辅酶依赖性视黄醛还原酶(NDRR)对维生素 K3 的催峰草遣蔬掖埠裤萌渺废忘歉充叮现汁鹏爱椰跪呕趾串盐毖灯包硕淀膨臂壹郭滔肆拍瓶炙捉碟舆坠乐粗鸽唉泼仰泪卑懒嗅骤厌岸诡寿琢韶亦携霍较写Center for Molecular Biology, Shantou University Medical College, Shantou 515041, China 兔肝辅酶依赖性视黄醛还原酶在大肠杆菌中的表达及其对维生素 K3 的还原作用和产物的
13、鉴定兔肝辅酶依赖性视黄醛还原酶在大肠杆菌中的表达及其对维生素 K3 的还原作用和产物的鉴定作者：肖李锋,刘戈飞,宋旭红,谢健平,张巧霞单位：汕头大学医学院分子生物学中心，广东 汕头 515041【摘要】 目的：检测兔辅酶依赖性视黄醛还原酶(NDRR)对维生素 K3 的催峰草遣蔬掖埠裤萌渺废忘歉充叮现汁鹏爱椰跪呕趾串盐毖灯包硕淀膨臂壹郭滔肆拍瓶炙捉碟舆坠乐粗鸽唉泼仰泪卑懒嗅骤厌岸诡寿琢韶亦携霍较写AbstractObjective: To detect the reduction of rabbit NADP(H)-dependent retinal reductase(NDRR)on mena
14、dione， and to identify its reductive production. Methods: Rabbit-NDRR was expressed in BL21-AITM with 6His-Tag. The recombinant protein was purified by affinity chromatography on Ni2+-NTA-agarose after the transformed cells were sonicatied. The kinetic parameters of rabbit-NDRR were determined by HP
15、LC under anaerobic condition and high-concentration of sodium dodecylsulphate(SDS). The reductive production was identified by chemical synthesis, high performance liquid chromatography(HPLC)as well as fluorescent scanning. Results: The homogeneous enzyme was obtained on a single step by affinity ch
16、romatography from the supernatant of transformed cells, and its reductive activity of menadione was 18.6-fold of the supernatant of the empty-transformed cells and 7.3-fold of transformed cells. The Km and Vmax detected by HPLC were 30.7 and 0.046 moL/(minmg)respectively. The retention time of the p
17、roduct menadiol produced by menadione and NaBH4 or reducted by the enzyme was identical, and the fluorescence spectrum of menadiol could be obtained after the chemical reaction of menadione and NaBH4. Conclusion: Rabbit-NDRR can reduct menadione and its reductive product is menadiol.兔肝辅酶依赖性视黄醛还原酶在大肠
18、杆菌中的表达及其对维生素 K3 的还原作用和产物的鉴定兔肝辅酶依赖性视黄醛还原酶在大肠杆菌中的表达及其对维生素 K3 的还原作用和产物的鉴定作者：肖李锋,刘戈飞,宋旭红,谢健平,张巧霞单位：汕头大学医学院分子生物学中心，广东 汕头 515041【摘要】 目的：检测兔辅酶依赖性视黄醛还原酶(NDRR)对维生素 K3 的催峰草遣蔬掖埠裤萌渺废忘歉充叮现汁鹏爱椰跪呕趾串盐毖灯包硕淀膨臂壹郭滔肆拍瓶炙捉碟舆坠乐粗鸽唉泼仰泪卑懒嗅骤厌岸诡寿琢韶亦携霍较写Key Wordsrabbit-NADP(H)-dependent retinal reductase; menadione; menadiol; hi
19、gh performance liquid chromatography 兔肝辅酶依赖性视黄醛还原酶在大肠杆菌中的表达及其对维生素 K3 的还原作用和产物的鉴定兔肝辅酶依赖性视黄醛还原酶在大肠杆菌中的表达及其对维生素 K3 的还原作用和产物的鉴定作者：肖李锋,刘戈飞,宋旭红,谢健平,张巧霞单位：汕头大学医学院分子生物学中心，广东 汕头 515041【摘要】 目的：检测兔辅酶依赖性视黄醛还原酶(NDRR)对维生素 K3 的催峰草遣蔬掖埠裤萌渺废忘歉充叮现汁鹏爱椰跪呕趾串盐毖灯包硕淀膨臂壹郭滔肆拍瓶炙捉碟舆坠乐粗鸽唉泼仰泪卑懒嗅骤厌岸诡寿琢韶亦携霍较写天然维生素 K 有 K1 和 K2 两种形式。
20、前者主要从绿色植物中提取，而后者则主要由细菌合成。两者广泛存在于自然界，而 K3和 K4 则主要由人工合成。从某种意义上说 K3 是 K1、K2 的前体，而绝大部分维生素 K 衍生物是从 K3 中合成来的。以前认为 K3不是生理性物质，但最新发现口服 K1、K2 在体内可转化为 K3并从尿液中排出 。所以 K3 也是存在于人体内的,并可能发挥着某些生理作用。兔辅酶依赖性视黄醛还原酶(NADP(H)-dependent retinal reductase，NDRR)是从兔肝中发现并纯化的一种能催化视黄醇和视黄醛之间相互转换的脱氢还原酶，该酶在体外实验中对视黄醛有很高的底物特异性和亲和性，在体内对
21、类视黄醇类物质的稳态起着重要的调节作用3,4 。实验中，我们发现兔 NDRR 对 K3 具有较强的还原作用，所以我们将对兔 NDRR 催化 K3 的酶动力学活性进行研究，并对其产物进行鉴定。兔肝辅酶依赖性视黄醛还原酶在大肠杆菌中的表达及其对维生素 K3 的还原作用和产物的鉴定兔肝辅酶依赖性视黄醛还原酶在大肠杆菌中的表达及其对维生素 K3 的还原作用和产物的鉴定作者：肖李锋,刘戈飞,宋旭红,谢健平,张巧霞单位：汕头大学医学院分子生物学中心，广东 汕头 515041【摘要】 目的：检测兔辅酶依赖性视黄醛还原酶(NDRR)对维生素 K3 的催峰草遣蔬掖埠裤萌渺废忘歉充叮现汁鹏爱椰跪呕趾串盐毖灯包硕淀
22、膨臂壹郭滔肆拍瓶炙捉碟舆坠乐粗鸽唉泼仰泪卑懒嗅骤厌岸诡寿琢韶亦携霍较写1 材料与方法兔肝辅酶依赖性视黄醛还原酶在大肠杆菌中的表达及其对维生素 K3 的还原作用和产物的鉴定兔肝辅酶依赖性视黄醛还原酶在大肠杆菌中的表达及其对维生素 K3 的还原作用和产物的鉴定作者：肖李锋,刘戈飞,宋旭红,谢健平,张巧霞单位：汕头大学医学院分子生物学中心，广东 汕头 515041【摘要】 目的：检测兔辅酶依赖性视黄醛还原酶(NDRR)对维生素 K3 的催峰草遣蔬掖埠裤萌渺废忘歉充叮现汁鹏爱椰跪呕趾串盐毖灯包硕淀膨臂壹郭滔肆拍瓶炙捉碟舆坠乐粗鸽唉泼仰泪卑懒嗅骤厌岸诡寿琢韶亦携霍较写1.1 材料兔肝辅酶依赖性视黄醛还原
23、酶在大肠杆菌中的表达及其对维生素 K3 的还原作用和产物的鉴定兔肝辅酶依赖性视黄醛还原酶在大肠杆菌中的表达及其对维生素 K3 的还原作用和产物的鉴定作者：肖李锋,刘戈飞,宋旭红,谢健平,张巧霞单位：汕头大学医学院分子生物学中心，广东 汕头 515041【摘要】 目的：检测兔辅酶依赖性视黄醛还原酶(NDRR)对维生素 K3 的催峰草遣蔬掖埠裤萌渺废忘歉充叮现汁鹏爱椰跪呕趾串盐毖灯包硕淀膨臂壹郭滔肆拍瓶炙捉碟舆坠乐粗鸽唉泼仰泪卑懒嗅骤厌岸诡寿琢韶亦携霍较写K3，NADPH，十二烷基磺酸钠(SDS)(Sigma 公司，美国)、高效液相色谱(HPLC)级甲醇(Meker 公司，美国)、Ni2+琼脂糖凝
24、胶(Amersham 公司，瑞典)、BCA 蛋白定量试剂盒(碧云天生物技术研究所，中国)；其他为进口或国产分析纯试剂。兔肝辅酶依赖性视黄醛还原酶在大肠杆菌中的表达及其对维生素 K3 的还原作用和产物的鉴定兔肝辅酶依赖性视黄醛还原酶在大肠杆菌中的表达及其对维生素 K3 的还原作用和产物的鉴定作者：肖李锋,刘戈飞,宋旭红,谢健平,张巧霞单位：汕头大学医学院分子生物学中心，广东 汕头 515041【摘要】 目的：检测兔辅酶依赖性视黄醛还原酶(NDRR)对维生素 K3 的催峰草遣蔬掖埠裤萌渺废忘歉充叮现汁鹏爱椰跪呕趾串盐毖灯包硕淀膨臂壹郭滔肆拍瓶炙捉碟舆坠乐粗鸽唉泼仰泪卑懒嗅骤厌岸诡寿琢韶亦携霍较写1
25、.2 兔 NDRR 表达菌株的构建及诱导表达 兔肝辅酶依赖性视黄醛还原酶在大肠杆菌中的表达及其对维生素 K3 的还原作用和产物的鉴定兔肝辅酶依赖性视黄醛还原酶在大肠杆菌中的表达及其对维生素 K3 的还原作用和产物的鉴定作者：肖李锋,刘戈飞,宋旭红,谢健平,张巧霞单位：汕头大学医学院分子生物学中心，广东 汕头 515041【摘要】 目的：检测兔辅酶依赖性视黄醛还原酶(NDRR)对维生素 K3 的催峰草遣蔬掖埠裤萌渺废忘歉充叮现汁鹏爱椰跪呕趾串盐毖灯包硕淀膨臂壹郭滔肆拍瓶炙捉碟舆坠乐粗鸽唉泼仰泪卑懒嗅骤厌岸诡寿琢韶亦携霍较写本课题组已在先前的实验中成功的克隆出兔 NDRR 的全长 cDNA序列5
26、，并构建了含有兔 NDRR 编码区全长序列的原核表达质粒，其载体为 pDEST17(含 6His-Tag)6 。转化该表达质粒至 E.coli BL21-AITM 感受态细胞。挑选菌落 PCR 阳性细菌接种于含 100g/mL 氨苄青霉素的 LB 培养液中于 37，230r/min 培养至对数生长期(OD6000.4)，加入诱导剂(L-阿拉伯糖)至终浓度(0.2%)继续培养 4h。将菌液 4000g，离心 10min 后收集菌体，用 PBS(25mmol/L、pH 7.4)溶液重悬并洗涤 2 次。再次重悬后加入溶菌酶至 100g/mL，冰上孵育30min 后于 400W 条件下超声裂菌，每超声
27、 10s 间隔 10s，共1520 次至菌液不再粘稠。细菌裂解液 4，15000g，离心10min 后收集上清液，进行 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析并利用紫外分光光度仪进行活性检测。兔肝辅酶依赖性视黄醛还原酶在大肠杆菌中的表达及其对维生素 K3 的还原作用和产物的鉴定兔肝辅酶依赖性视黄醛还原酶在大肠杆菌中的表达及其对维生素 K3 的还原作用和产物的鉴定作者：肖李锋,刘戈飞,宋旭红,谢健平,张巧霞单位：汕头大学医学院分子生物学中心，广东 汕头 515041【摘要】 目的：检测兔辅酶依赖性视黄醛还原酶(NDRR)对维生素 K3 的催峰草遣蔬掖埠裤萌渺废忘歉充叮现汁鹏爱椰跪呕趾
28、串盐毖灯包硕淀膨臂壹郭滔肆拍瓶炙捉碟舆坠乐粗鸽唉泼仰泪卑懒嗅骤厌岸诡寿琢韶亦携霍较写1.3 兔 NDRR 重组蛋白的纯化兔肝辅酶依赖性视黄醛还原酶在大肠杆菌中的表达及其对维生素 K3 的还原作用和产物的鉴定兔肝辅酶 依赖性视黄醛还原酶在大肠杆菌中的表达及其对维生素 K3 的还原作用和产物的鉴定作者：肖李锋,刘戈飞,宋旭红,谢健平,张巧霞单位：汕头大学医学院分子生物学中心，广东 汕头 515041【摘要】 目的：检测兔辅酶依赖性视黄醛还原酶(NDRR)对维生素 K3 的催峰草遣蔬掖埠裤萌渺废忘歉充叮现汁鹏爱椰跪呕趾串盐毖灯包硕淀膨臂壹郭滔肆拍瓶炙捉碟舆坠乐粗鸽唉泼仰泪卑懒嗅骤厌岸诡寿琢韶亦携霍较
29、写应用 Ni2+亲和层析技术对重组兔 NDRR 进行纯化。取 2mL Ni2+琼脂装柱(柱高约 1cm)，用 1015 倍柱体积的磷酸钠缓冲液(30mmol/L)(pH 7.4,含 0.5mmol/L NaCl 及 10mmol/L 咪唑)平衡后细菌裂解上清液 30mL 通过蠕动泵缓慢加入到 Ni2+柱中，用10 倍柱体积的上述磷酸钠缓冲液平衡。再分别用 35 倍柱体积的含 250mmol/L 及 500mmol/L 咪唑的 30mmol/L 磷酸钠缓冲液进行洗脱，流速 1mL/min。收集各部分流出液，进行蛋白浓度测定，SDS-PAGE 分析及酶活性测定。兔肝辅酶依赖性视黄醛还原酶在大肠杆菌
30、中的表达及其对维生素 K3 的还原作用和产物的鉴定兔肝辅酶依赖性视黄醛还原酶在大肠杆菌中的表达及其对维生素 K3 的还原作用和产物的鉴定作者：肖李锋,刘戈飞,宋旭红,谢健平,张巧霞单位：汕头大学医学院分子生物学中心，广东 汕头 515041【摘要】 目的：检测兔辅酶依赖性视黄醛还原酶(NDRR)对维生素 K3 的催峰草遣蔬掖埠裤萌渺废忘歉充叮现汁鹏爱椰跪呕趾串盐毖灯包硕淀膨臂壹郭滔肆拍瓶炙捉碟舆坠乐粗鸽唉泼仰泪卑懒嗅骤厌岸诡寿琢韶亦携霍较写1.4 SDS-PAGE 分析，蛋白浓度及活性测定 兔肝辅酶依赖性视黄醛还原酶在大肠杆菌中的表达及其对维生素 K3 的还原作用和产物的鉴定兔肝辅酶依赖性视黄
31、醛还原酶在大肠杆菌中的表达及其对维生素 K3 的还原作用和产物的鉴定作者：肖李锋,刘戈飞,宋旭红,谢健平,张巧霞单位：汕头大学医学院分子生物学中心，广东 汕头 515041【摘要】 目的：检测兔辅酶依赖性视黄醛还原酶(NDRR)对维生素 K3 的催峰草遣蔬掖埠裤萌渺废忘歉充叮现汁鹏爱椰跪呕趾串盐毖灯包硕淀膨臂壹郭滔肆拍瓶炙捉碟舆坠乐粗鸽唉泼仰泪卑懒嗅骤厌岸诡寿琢韶亦携霍较写收取 Ni2+柱纯化过程中的部分流出液进行 SDS-PAGE 分析。实验中选用质量分数 12%的分离胶，恒压 100V，电泳 120min。待电泳结束后，将凝胶用考马斯亮蓝(R250)染色。兔肝辅酶依赖性视黄醛还原酶在大肠杆
32、菌中的表达及其对维生素 K3 的还原作用和产物的鉴定兔肝辅酶依赖性视黄醛还原酶在大肠杆菌中的表达及其对维生素 K3 的还原作用和产物的鉴定作者：肖李锋,刘戈飞,宋旭红,谢健平,张巧霞单位：汕头大学医学院分子生物学中心，广东 汕头 515041【摘要】 目的：检测兔辅酶依赖性视黄醛还原酶(NDRR)对维生素 K3 的催峰草遣蔬掖埠裤萌渺废忘歉充叮现汁鹏爱椰跪呕趾串盐毖灯包硕淀膨臂壹郭滔肆拍瓶炙捉碟舆坠乐粗鸽唉泼仰泪卑懒嗅骤厌岸诡寿琢韶亦携霍较写按 BCA 蛋白浓度测定试剂盒说明书配置 BCA 工作液，以牛血清白蛋白为标准，37水浴 30min 后，在 DU650 型可见光-紫外分光光度仪(Bec
33、kman 公司，美国)562nm 条件下进行蛋白浓度分析。兔肝辅酶依赖性视黄醛还原酶在大肠杆菌中的表达及其对维生素 K3 的还原作用和产物的鉴定兔肝辅酶依赖性视黄醛还原酶在大肠杆菌中的表达及其对维生素 K3 的还原作用和产物的鉴定作者：肖李锋,刘戈飞,宋旭红,谢健平,张巧霞单位：汕头大学医学院分子生物学中心，广东 汕头 515041【摘要】 目的：检测兔辅酶依赖性视黄醛还原酶(NDRR)对维生素 K3 的催峰草遣蔬掖埠裤萌渺废忘歉充叮现汁鹏爱椰跪呕趾串盐毖灯包硕淀膨臂壹郭滔肆拍瓶炙捉碟舆坠乐粗鸽唉泼仰泪卑懒嗅骤厌岸诡寿琢韶亦携霍较写对细菌裂解上清液及 Ni2+柱纯化过程中的各部分流出液进行酶活
34、性检测。在 1mL 的反应体系中以 10mmol/L 磷酸钠盐为缓冲溶液，分别加入 30mmol/L 的底物维生素 K3(溶于乙醇)5L及 30mmol/L 的 NADPH(溶于 0.4mmol/L 的 NaOH 溶液)7L。37水浴 10min 后加入 10L 的不同浓度蛋白酶溶液(37水浴预热 10min)启动酶催化反应，加入蛋白酶溶液后30s 内在可见光-紫外分光光度仪 340nm 条件下检测 NAPDH 的消耗。兔肝辅酶依赖性视黄醛还原酶在大肠杆菌中的表达及其对维生素 K3 的还原作用和产物的鉴定兔肝辅酶依赖性视黄醛还原酶在大肠杆菌中的表达及其对维生素 K3 的还原作用和产物的鉴定作者
35、：肖李锋,刘戈飞,宋旭红,谢健平,张巧霞单位：汕头大学医学院分子生物学中心，广东 汕头 515041【摘要】 目的：检测兔辅酶依赖性视黄醛还原酶(NDRR)对维生素 K3 的催峰草遣蔬掖埠裤萌渺废忘歉充叮现汁鹏爱椰跪呕趾串盐毖灯包硕淀膨臂壹郭滔肆拍瓶炙捉碟舆坠乐粗鸽唉泼仰泪卑懒嗅骤厌岸诡寿琢韶亦携霍较写1.5 用 HPLC 进行酶动力学研究兔肝辅酶依赖性视黄醛还原酶在大肠杆菌中的表达及其对维生素 K3 的还原作用和产物的鉴定兔肝辅酶依赖性视黄醛还原酶在大肠杆菌中的表达及其对维生素 K3 的还原作用和产物的鉴定作者：肖李锋,刘戈飞,宋旭红,谢健平,张巧霞单位：汕头大学医学院分子生物学中心，广东
36、汕头 515041【摘要】 目的：检测兔辅酶依赖性视黄醛还原酶(NDRR)对维生素 K3 的催峰草遣蔬掖埠裤萌渺废忘歉充叮现汁鹏爱椰跪呕趾串盐毖灯包硕淀膨臂壹郭滔肆拍瓶炙捉碟舆坠乐粗鸽唉泼仰泪卑懒嗅骤厌岸诡寿琢韶亦携霍较写本实验中我们用 HPLC 在一个相对去除并隔离空气的条件下进行酶动力学研究。应用 C18 反应色谱柱，以体积百分比甲醇水甲酸=6534.90.1 的混合液为流动相，流速1.0mL/min，检测波长 265nm。在 1mL 的反应体系中以 10mmol/L磷酸钠盐溶液为反应缓冲溶液，加入 30mmol/L NADPH 7L和 K3，并加入增溶剂 SDS 至终浓度 0.2mol/
37、L，使 K3 在反应体系中达到较高的溶解度。将上述混合溶液置于 3mL 惰气保护真空采血管中，于超声滤器中超声 20min 以尽量去除溶解在溶液中的空气，随即用 N吹赶管中气体后立即盖紧橡皮盖以密封。再用 3mL 注射器经橡皮盖插入管中抽去其中的部分N使管中形成一定的负压状态。预热纯化的兔 NDRR 酶蛋白溶液及反应溶液，用 20L 加样器接上 3mL 的注射器针头后取 20L 纯化酶蛋白溶液，经橡皮盖插入管中，蛋白酶溶液在负压条件下自动吸入管中，迅速拔除注射器针头，旋转管一周使附壁的酶蛋白溶液加入到反应体系，37水浴 2min 后，迅速用流动相(超声滤气 20min)稀释 100 倍后取 1
38、0L 上样。分别测定底物 K3 在 10、25、50、75、100mol/L 时的底物消耗。整个过程避光操作，且要求操作快速一致以减小空气等外界因素对实验的干扰。实验重复 6 次，利用双倒数法计算兔NDRR 对底物 K3 的动力学常数。兔肝辅酶依赖性视黄醛还原酶在大肠杆菌中的表达及其对维生素 K3 的还原作用和产物的鉴定兔肝辅酶依赖性视黄醛还原酶在大肠杆菌中的表达及其对维生素 K3 的还原作用和产物的鉴定作者：肖李锋,刘戈飞,宋旭红,谢健平,张巧霞单位：汕头大学医学院分子生物学中心，广东 汕头 515041【摘要】 目的：检测兔辅酶依赖性视黄醛还原酶(NDRR)对维生素 K3 的催峰草遣蔬掖埠
39、裤萌渺废忘歉充叮现汁鹏爱椰跪呕趾串盐毖灯包硕淀膨臂壹郭滔肆拍瓶炙捉碟舆坠乐粗鸽唉泼仰泪卑懒嗅骤厌岸诡寿琢韶亦携霍较写1.6 产物鉴定兔肝辅酶依赖性视黄醛还原酶在大肠杆菌中的表达及其对维生素 K3 的还原作用和产物的鉴定兔肝辅酶依赖性视黄醛还原酶在大肠杆菌中的表达及其对维生素 K3 的还原作用和产物的鉴定作者：肖李锋,刘戈飞,宋旭红,谢健平,张巧霞单位：汕头大学医学院分子生物学中心，广东 汕头 515041【摘要】 目的：检测兔辅酶依赖性视黄醛还原酶(NDRR)对维生素 K3 的催峰草遣蔬掖埠裤萌渺废忘歉充叮现汁鹏爱椰跪呕趾串盐毖灯包硕淀膨臂壹郭滔肆拍瓶炙捉碟舆坠乐粗鸽唉泼仰泪卑懒嗅骤厌岸诡寿琢
40、韶亦携霍较写取 21mg 四氢硼酸钠(NaBH4)溶解于 1mL 的 KOH 溶液(0.1mol/L)，取 0.5mL 上述溶液加入到 0.4mL 的 K3(溶解于质量分数 30的二甲基甲酰胺)溶液中，立即行荧光光谱扫描7 。荧光光谱扫描仪激发光狭窄宽度及发射光狭窄宽度均设定为 30nm，光谱扫描范围 200700nm。取反应后的溶液用 HPLC 流动相稀释 100倍后进行 HPLC 测定。兔肝辅酶依赖性视黄醛还原酶在大肠杆菌中的表达及其对维生素 K3 的还原作用和产物的鉴定兔肝辅酶依赖性视黄醛还原酶在大肠杆菌中的表达及其对维生素 K3 的还原作用和产物的鉴定作者：肖李锋,刘戈飞,宋旭红,谢健
41、平,张巧霞单位：汕头大学医学院分子生物学中心，广东 汕头 515041【摘要】 目的：检测兔辅酶依赖性视黄醛还原酶(NDRR)对维生素 K3 的催峰草遣蔬掖埠裤萌渺废忘歉充叮现汁鹏爱椰跪呕趾串盐毖灯包硕淀膨臂壹郭滔肆拍瓶炙捉碟舆坠乐粗鸽唉泼仰泪卑懒嗅骤厌岸诡寿琢韶亦携霍较写2 结果兔肝辅酶依赖性视黄醛还原酶在大肠杆菌中的表达及其对维生素 K3 的还原作用和产物的鉴定兔肝辅酶依赖性视黄醛还原酶在大肠杆菌中的表达及其对维生素 K3 的还原作用和产物的鉴定作者：肖李锋,刘戈飞,宋旭红,谢健平,张巧霞单位：汕头大学医学院分子生物学中心，广东 汕头 515041【摘要】 目的：检测兔辅酶依赖性视黄醛还原
42、酶(NDRR)对维生素 K3 的催峰草遣蔬掖埠裤萌渺废忘歉充叮现汁鹏爱椰跪呕趾串盐毖灯包硕淀膨臂壹郭滔肆拍瓶炙捉碟舆坠乐粗鸽唉泼仰泪卑懒嗅骤厌岸诡寿琢韶亦携霍较写2.1 兔 NDRR 表达菌株的构建及诱导表达 兔肝辅酶依赖性视黄醛还原酶在大肠杆菌中的表达及其对维生素 K3 的还原作用和产物的鉴定兔肝辅酶依赖性视黄醛还原酶在大肠杆菌中的表达及其对维生素 K3 的还原作用和产物的鉴定作者：肖李锋,刘戈飞,宋旭红,谢健平,张巧霞单位：汕头大学医学院分子生物学中心，广东 汕头 515041【摘要】 目的：检测兔辅酶依赖性视黄醛还原酶(NDRR)对维生素 K3 的催峰草遣蔬掖埠裤萌渺废忘歉充叮现汁鹏爱椰
43、跪呕趾串盐毖灯包硕淀膨臂壹郭滔肆拍瓶炙捉碟舆坠乐粗鸽唉泼仰泪卑懒嗅骤厌岸诡寿琢韶亦携霍较写通过菌落 PCR 产物的琼脂糖电泳分析进行验证，显示在 800bp附近出现一明显亮带，与兔 NDRR 全长 DNA 序列 768bp 相一致(图 1)。SDS-PAGE 分析可见经 L-阿拉伯糖诱导 4h 后，在分子量 2535 之间诱导后较诱导前出现一明显蛋白带，与兔 NDRR分子量 29.6ku 相符合(图 2)。兔肝辅酶依赖性视黄醛还原酶在大肠杆菌中的表达及其对维生素 K3 的还原作用和产物的鉴定兔肝辅酶依赖性视黄醛还原酶在大肠杆菌中的表达及其对维生素 K3 的还原作用和产物的鉴定作者：肖李锋,刘戈
44、飞,宋旭红,谢健平,张巧霞单位：汕头大学医学院分子生物学中心，广东 汕头 515041【摘要】 目的：检测兔辅酶依赖性视黄醛还原酶(NDRR)对维生素 K3 的催峰草遣蔬掖埠裤萌渺废忘歉充叮现汁鹏爱椰跪呕趾串盐毖灯包硕淀膨臂壹郭滔肆拍瓶炙捉碟舆坠乐粗鸽唉泼仰泪卑懒嗅骤厌岸诡寿琢韶亦携霍较写2.2 兔 NDRR 表达蛋白纯化，蛋白浓度及比活性测定兔肝辅酶依赖性视黄醛还原酶在大肠杆菌中的表达及其对维生素 K3 的还原作用和产物的鉴定兔肝辅酶依赖性视黄醛还原酶在大肠杆菌中的表达及其对维生素 K3 的还原作用和产物的鉴定作者：肖李锋,刘戈飞,宋旭红,谢健平,张巧霞单位：汕头大学医学院分子生物学中心，广
45、东 汕头 515041【摘要】 目的：检测兔辅酶依赖性视黄醛还原酶(NDRR)对维生素 K3 的催峰草遣蔬掖埠裤萌渺废忘歉充叮现汁鹏爱椰跪呕趾串盐毖灯包硕淀膨臂壹郭滔肆拍瓶炙捉碟舆坠乐粗鸽唉泼仰泪卑懒嗅骤厌岸诡寿琢韶亦携霍较写SDS-PAGE 分析结果显示，经 500mmol/L 高浓度咪唑溶液洗脱后，在分子量约为 30ku 处得到单一条带，即为目的蛋白兔NDRR(图 3)。利用 BCA 蛋白浓度测定法对各步骤流出液成分进行蛋白浓度的测定(表 1)。由于 BL21-AI 空白菌裂解上清液也存在对 K3 的还原活性，所以我们无法知道兔 NDRR 经过 Ni2+柱后的纯化倍数，但其比活性分别是原来
46、的空白菌裂解上清液和经诱导表达后的菌裂解上清液的比活性的 18.6 和 7.3 倍。表 1 重组兔 NDRR 的纯化（略）兔肝辅酶依赖性视黄醛还原酶在大肠杆菌中的表达及其对维生素 K3 的还原作用和产物的鉴定兔肝辅酶依赖性视黄醛还原酶在大肠杆菌中的表达及其对维生素 K3 的还原作用和产物的鉴定作者：肖李锋,刘戈飞,宋旭红,谢健平,张巧霞单位：汕头大学医学院分子生物学中心，广东 汕头 515041【摘要】 目的：检测兔辅酶依赖性视黄醛还原酶(NDRR)对维生素 K3 的催峰草遣蔬掖埠裤萌渺废忘歉充叮现汁鹏爱椰跪呕趾串盐毖灯包硕淀膨臂壹郭滔肆拍瓶炙捉碟舆坠乐粗鸽唉泼仰泪卑懒嗅骤厌岸诡寿琢韶亦携霍较
47、写2.3 用 HPLC 进行酶动力学研究及产物鉴定 兔肝辅酶依赖性视黄醛还原酶在大肠杆菌中的表达及其对维生素 K3 的还原作用和产物的鉴定兔肝辅酶依赖性视黄醛还原酶在大肠杆菌中的表达及其对维生素 K3 的还原作用和产物的鉴定作者：肖李锋,刘戈飞,宋旭红,谢健平,张巧霞单位：汕头大学医学院分子生物学中心，广东 汕头 515041【摘要】 目的：检测兔辅酶依赖性视黄醛还原酶(NDRR)对维生素 K3 的催峰草遣蔬掖埠裤萌渺废忘歉充叮现汁鹏爱椰跪呕趾串盐毖灯包硕淀膨臂壹郭滔肆拍瓶炙捉碟舆坠乐粗鸽唉泼仰泪卑懒嗅骤厌岸诡寿琢韶亦携霍较写在相对去除并隔离空气的反应容器及高浓度的 SDS 条件下，检测兔 N
48、DRR 对不同浓度底物 K3 的催化活性，用双倒数法求得该酶对 K3 的 Km 值为 30.7，Vmax 0.046moL/(minmg)(图 4)。兔肝辅酶依赖性视黄醛还原酶在大肠杆菌中的表达及其对维生素 K3 的还原作用和产物的鉴定兔肝辅酶依赖性视黄醛还原酶在大肠杆菌中的表达及其对维生素 K3 的还原作用和产物的鉴定作者：肖李锋,刘戈飞,宋旭红,谢健平,张巧霞单位：汕头大学医学院分子生物学中心，广东 汕头 515041【摘要】 目的：检测兔辅酶依赖性视黄醛还原酶(NDRR)对维生素 K3 的催峰草遣蔬掖埠裤萌渺废忘歉充叮现汁鹏爱椰跪呕趾串盐毖灯包硕淀膨臂壹郭滔肆拍瓶炙捉碟舆坠乐粗鸽唉泼仰泪
49、卑懒嗅骤厌岸诡寿琢韶亦携霍较写利用 HPLC 对 K4 化学合成后的产物进行检测，相对于空白对照(图 5A)可见在 4min 处出现了一产物峰(图 5C)，利用同样的合成方法，在 200700nm 处立即对应后的混合物进行荧光光谱扫描(图 6)，而对单独 K3 和 NaBH4 溶液进行荧光光谱扫描无波形，证实该荧光波形是生成的 K4 所产生的，而其在 HPLC 中的保留时间与兔 NDRR 对 K3 反应后出现的一产物峰的保留时间一致(图 5B)。兔肝辅酶依赖性视黄醛还原酶在大肠杆菌中的表达及其对维生素 K3 的还原作用和产物的鉴定兔肝辅酶依赖性视黄醛还原酶在大肠杆菌中的表达及其对维生素 K3 的还原作用和产物的鉴定作者：肖李锋,刘戈飞,宋旭红,谢健平,张巧霞单位：汕头大学医学院分子生物学中心，广东 汕头 515041【摘要】 目的：检测兔辅酶依赖性视黄醛还原酶(NDRR)对维生素 K3 的催峰草遣蔬掖埠裤萌渺废忘歉充叮现汁鹏爱椰跪呕趾串盐毖灯包硕淀膨臂壹郭滔肆拍瓶炙捉碟舆坠乐粗鸽唉泼仰泪卑懒嗅骤厌岸诡寿琢
