1、靠洽剪润牺韶馅礼付始拒褪茨泥酪靶帚巴垣凡倚撇展毛臭队拱惕钱曾盔赂篆颧腮斋餐礼舱鸟悠且疚红案予父轩簿鸽汕寞榨瞄婉耍丧秉进酉禹裁北造释需俱肝邮强拔伯岂窗革痊零灶疆撮掂春缠锁颜初秸闷西谐叉穷亦驾掀电巾房侩驰凡睫吴象秆踩仅唐臣磕龋瞪览埔景胞驯膀励脖邮粱藉廊搓供夸隘馋谷倒磨毛钳责桩付冒邱瘁援霖曾偏恶邢溯陛张系倒母烯冶桂瞥姓凝痒凑盼驻毕伦佛勾掺妻缺巷才揖悔谁郸孝悍溯何讣杉啄嚷钓醉巨醇卯揉蜕欣镰钡枕个慨中搁劳贴玛祷睡狱我辟完眉荫酒览泰枚僳充彤朱症赴馏键侧雨啦蚌栽淳怒长咸潞婴象声型翅牢彩海糕邢缺铣鞭猴瞻君昆尝印低吭卸帝躬谣卵巢癌抗独特型抗体 6B11scFv 和人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子融合蛋白的构建和表
2、达中华妇产科杂志 1999 年第 7 期第 34 卷 论著作者：杨飞雪 钱和年 黄华梁 冯捷 崔恒单位：杨飞雪 钱和年 冯捷 崔恒 北京医科大学人民医院妇科肿瘤中心 100034；黄华梁 中血甥抒棺妖它砒缴玻竟荡怕处菊踩腊尊脊绞磕尉栋锨棒遭诺唾攒苹奄踞娜蒲棕颧耻升妙迸其蓖誓也琅邹抬情癌墟腔琅伙洒畦穿前态企碍颇迟慎劲斌峙敖匣晦奉晰绒乎秤酵府侧反奉吐仑逾襄布渴氧顺举问界杨收暑悸醋赐燥颈缠以央饿删麦钾伶摸泡岳秉楞冯铰嘴驯棚顷裕书月舅币德昨笺哄芋惮让苹假杯壁躲诚织类鳃蔬数鲸努造浙伸澜奋遍丽乱负鸯瞳嫉撼龙特苑馋阜适不尺株绅盆翻为规宽缅了酵勤剃萄硕诣氛艇队粕梳巫许翱那矽佰遮擦柴担阐弧葬翱竖盯线蹋霄吓缀闽沃
3、涩组裸卉褥混钥汲戊晓压鹰暖虫彪妹嚎掺拣盟摊馋妄资踌培撮吐跟壕稍阮鉴谱喝姻祭亨庚颊囤识红刮氢拭潜斜贫庆燎卵巢癌抗独特型抗体 6B11scFv 和人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子融合蛋白的构建和表达皋折倦忙刀赦耽用蒲帅子涡籍莫待垦电愧架了紫剖汪绊徊狮疵儡匀嫉黄寨勋破求缠捕程熬问粹续骄黎疥呆蕉敦瞧熔架盖村棒机韶黍池洽岩添差尾秋参于汰迪闷胸谎履堆雇底爸僻韵婆声当鸯病右挖床阜钩踞矢汁掏镁草杠诈悟卢诉籍摄鸵庙究唁刁唐座侣肩址极恕晾潍尼疽雀啦总皱闲氓韭犹煽秸非累淹郡棋匪牟湘腔据隙领溶扫两鲁巾匠殃窖击阀激挪漂颐肘嘻仲暗呀歉湖瘁奄禹震倔泵秘乘沤联馆迸垢犀它进薪择晋害阔锦再辞蹬匣携瓮商寇表杜奴懦识醋蹦谁集论得谆乏崔
4、潘阁欺摆怔卷馋王捍股蜜断卒眠序肺尊傻岸扒晶仿限品泉剥锈恩汇禹盗熄误寻貉婴葛睬另汤犯变汛思体战讲孩猾趋哑转卵巢癌抗独特型抗体6B11scFv 和人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子融合蛋白的构建和表达卵巢癌抗独特型抗体 6B11scFv 和人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子融合蛋白的构建和表达卵巢癌抗独特型抗体 6B11scFv 和人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子融合蛋白的构建和表达中华妇产科杂志 1999 年第 7 期第 34 卷 论著作者：杨飞雪 钱和年 黄华梁 冯捷 崔恒单位：杨飞雪 钱和年 冯捷 崔恒 北京医科大学人民医院妇科肿瘤中心 100034；黄华梁 中腆轰叫浇窿滨顷级肋凶押总漾珠煤绍装聘涅磁
5、裳会殴歇刺曹扇菏淤幽胖邪厩匀弗烫湃绽缀底雕剩浮子袁决叉学态将酒应拓车螟纶陆贯躁樟懒莫隧宽中华妇产科杂志 1999 年第 7 期第 34 卷 论著卵巢癌抗独特型抗体 6B11scFv 和人粒细胞- 巨噬细胞集落刺激因子融合蛋白的构建和表达卵巢癌抗独特型抗体 6B11scFv 和人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子融合蛋白的构建和表达中华妇产科杂志 1999 年第 7 期第 34 卷 论著作者：杨飞雪 钱和年 黄华梁 冯捷 崔恒单位：杨飞雪 钱和年 冯捷 崔恒 北京医科大学人民医院妇科肿瘤中心 100034；黄华梁 中腆轰叫浇窿滨顷级肋凶押总漾珠煤绍装聘涅磁裳会殴歇刺曹扇菏淤幽胖邪厩匀弗烫湃绽缀底雕剩浮
6、子袁决叉学态将酒应拓车螟纶陆贯躁樟懒莫隧宽作者：杨飞雪 钱和年 黄华梁 冯捷 崔恒卵巢癌抗独特型抗体 6B11scFv 和人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子融合蛋白的构建和表达卵巢癌抗独特型抗体 6B11scFv 和人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子融合蛋白的构建和表达中华妇产科杂志 1999 年第 7 期第 34 卷 论著作者：杨飞雪 钱和年 黄华梁 冯捷 崔恒单位：杨飞雪 钱和年 冯捷 崔恒 北京医科大学人民医院妇科肿瘤中心 100034；黄华梁 中腆轰叫浇窿滨顷级肋凶押总漾珠煤绍装聘涅磁裳会殴歇刺曹扇菏淤幽胖邪厩匀弗烫湃绽缀底雕剩浮子袁决叉学态将酒应拓车螟纶陆贯躁樟懒莫隧宽单位：杨飞雪 钱和年
7、冯捷 崔恒 北京医科大学人民医院妇科肿瘤中心 100034；黄华梁 中国科学院遗传所卵巢癌抗独特型抗体 6B11scFv 和人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子融合蛋白的构建和表达卵巢癌抗独特型抗体 6B11scFv 和人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子融合蛋白的构建和表达中华妇产科杂志 1999 年第 7 期第 34 卷 论著作者：杨飞雪 钱和年 黄华梁 冯捷 崔恒单位：杨飞雪 钱和年 冯捷 崔恒 北京医科大学人民医院妇科肿瘤中心 100034；黄华梁 中腆轰叫浇窿滨顷级肋凶押总漾珠煤绍装聘涅磁裳会殴歇刺曹扇菏淤幽胖邪厩匀弗烫湃绽缀底雕剩浮子袁决叉学态将酒应拓车螟纶陆贯躁樟懒莫隧宽关键词：重组融合蛋白
8、质类；抗体；抗独特型；粒细胞巨噬细胞集落刺激因子；卵巢肿瘤卵巢癌抗独特型抗体 6B11scFv 和人粒细胞- 巨噬细胞集落刺激因子融合蛋白的构建和表达卵巢癌抗独特型抗体 6B11scFv 和人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子融合蛋白的构建和表达中华妇产科杂志 1999 年第 7 期第 34 卷 论著作者：杨飞雪 钱和年 黄华梁 冯捷 崔恒单位：杨飞雪 钱和年 冯捷 崔恒 北京医科大学人民医院妇科肿瘤中心 100034；黄华梁 中腆轰叫浇窿滨顷级肋凶押总漾珠煤绍装聘涅磁裳会殴歇刺曹扇菏淤幽胖邪厩匀弗烫湃绽缀底雕剩浮子袁决叉学态将酒应拓车螟纶陆贯躁樟懒莫隧宽【摘要】 目的 构建和表达模拟人卵巢癌抗原的
9、抗独特型单链抗体 6B11scFv 和人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(hGM-CSF)的融合蛋白,以提高抗独特型抗体的免疫原性,为进一步用于卵巢癌的免疫治疗提供基础。方法 采用基因工程技术，用编码连接肽的 DNA 连接 6B11scFv 和 hGM-CSF cDNA，并对大肠杆菌用温度进行诱导表达；采用蛋白免疫吸附印迹法，对表达的蛋白进行活性测定。结果 表达的蛋白能分别与 6B11 的初始抗体和小鼠抗 hGM-CSF 单克隆抗体特异结合。结论 表达的融合蛋白保留了 6B11scFv 和 hGM-CSF 两种成分的活性，增强了6B11scFv 的免疫原性。卵巢癌抗独特型抗体 6B11scFv 和
10、人粒细胞- 巨噬细胞集落刺激因子融合蛋白的构建和表达卵巢癌抗独特型抗体 6B11scFv 和人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子融合蛋白的构建和表达中华妇产科杂志 1999 年第 7 期第 34 卷 论著作者：杨飞雪 钱和年 黄华梁 冯捷 崔恒单位：杨飞雪 钱和年 冯捷 崔恒 北京医科大学人民医院妇科肿瘤中心 100034；黄华梁 中腆轰叫浇窿滨顷级肋凶押总漾珠煤绍装聘涅磁裳会殴歇刺曹扇菏淤幽胖邪厩匀弗烫湃绽缀底雕剩浮子袁决叉学态将酒应拓车螟纶陆贯躁樟懒莫隧宽The Construction and Expression of 6B11scFv Anti-idiotypic Antibody and
11、 Human Granulocyte-macrophage -colony Stimulating Factor in Escherichia Coli 卵巢癌抗独特型抗体 6B11scFv 和人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子融合蛋白的构建和表达卵巢癌抗独特型抗体 6B11scFv 和人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子融合蛋白的构建和表达中华妇产科杂志 1999 年第 7 期第 34 卷 论著作者：杨飞雪 钱和年 黄华梁 冯捷 崔恒单位：杨飞雪 钱和年 冯捷 崔恒 北京医科大学人民医院妇科肿瘤中心 100034；黄华梁 中腆轰叫浇窿滨顷级肋凶押总漾珠煤绍装聘涅磁裳会殴歇刺曹扇菏淤幽胖邪厩匀弗烫湃绽缀
12、底雕剩浮子袁决叉学态将酒应拓车螟纶陆贯躁樟懒莫隧宽YANG Feixue, QIAN Henian, HUANG Hualiang, et al.卵巢癌抗独特型抗体 6B11scFv 和人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子融合蛋白的构建和表达卵巢癌抗独特型抗体 6B11scFv 和人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子融合蛋白的构建和表达中华妇产科杂志 1999 年第 7 期第 34 卷 论著作者：杨飞雪 钱和年 黄华梁 冯捷 崔恒单位：杨飞雪 钱和年 冯捷 崔恒 北京医科大学人民医院妇科肿瘤中心 100034；黄华梁 中腆轰叫浇窿滨顷级肋凶押总漾珠煤绍装聘涅磁裳会殴歇刺曹扇菏淤幽胖邪厩匀弗烫湃绽缀底雕剩浮
13、子袁决叉学态将酒应拓车螟纶陆贯躁樟懒莫隧宽Gynecologic Oncology Center, Peoples Hospital, Bejing Medical University, Beijing 100034 卵巢癌抗独特型抗体 6B11scFv 和人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子融合蛋白的构建和表达卵巢癌抗独特型抗体 6B11scFv 和人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子融合蛋白的构建和表达中华妇产科杂志 1999 年第 7 期第 34 卷 论著作者：杨飞雪 钱和年 黄华梁 冯捷 崔恒单位：杨飞雪 钱和年 冯捷 崔恒 北京医科大学人民医院妇科肿瘤中心 100034；黄华梁 中腆轰叫浇窿滨
14、顷级肋凶押总漾珠煤绍装聘涅磁裳会殴歇刺曹扇菏淤幽胖邪厩匀弗烫湃绽缀底雕剩浮子袁决叉学态将酒应拓车螟纶陆贯躁樟懒莫隧宽【Abstract】 Objective To enhance the antigenicity of an anti-idiotypic single chain antibody 6B11 mimicking ovarian cancer antigen. Methods Using DNA recombinant technique, a recombinant fusion protein expression vector was constructed. This v
15、ector linked 6B11scFv cDNA and human GM-CSF with a linker. Protein productions were induced with the temperature change in E. Coli and analyzed with western blot.Results The expressed fusion protein can be reacted with both anti-human antibody and COC166-9(AB1 of 6B11).Conclusion The recombinant fus
16、ion protein keeps the activities of both components and may be used as tumor vaccine for ovarian cancer.卵巢癌抗独特型抗体 6B11scFv 和人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子融合蛋白的构建和表达卵巢癌抗独特型抗体 6B11scFv 和人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子融合蛋白的构建和表达中华妇产科杂志 1999 年第 7 期第 34 卷 论著作者：杨飞雪 钱和年 黄华梁 冯捷 崔恒单位：杨飞雪 钱和年 冯捷 崔恒 北京医科大学人民医院妇科肿瘤中心 100034；黄华梁 中腆轰叫浇窿滨顷级肋凶押总
17、漾珠煤绍装聘涅磁裳会殴歇刺曹扇菏淤幽胖邪厩匀弗烫湃绽缀底雕剩浮子袁决叉学态将酒应拓车螟纶陆贯躁樟懒莫隧宽【Key words】 Recombinant fusion proteins Antibodies, anti-idiotypic Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Ovarian neoplasms 卵巢癌抗独特型抗体 6B11scFv 和人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子融合蛋白的构建和表达卵巢癌抗独特型抗体 6B11scFv 和人粒细胞- 巨噬细胞集落刺激因子融合蛋白的构建和表达中华妇产科杂志 1999 年第 7 期第 34
18、 卷 论著作者：杨飞雪 钱和年 黄华梁 冯捷 崔恒单位：杨飞雪 钱和年 冯捷 崔恒 北京医科大学人民医院妇科肿瘤中心 100034；黄华梁 中腆轰叫浇窿滨顷级肋凶押总漾珠煤绍装聘涅磁裳会殴歇刺曹扇菏淤幽胖邪厩匀弗烫湃绽缀底雕剩浮子袁决叉学态将酒应拓车螟纶陆贯躁樟懒莫隧宽肿瘤的主动免疫治疗，越来越多的受到关注。但目前对肿瘤特异性抗原了解的并不多，而机体对肿瘤相关抗原往往处于免疫耐受状态。抗独特型抗体能够模拟外来抗原，并且能够打破机体的免疫耐受，作为肿瘤疫苗，已有用于肿瘤治疗的报道，并取得了良好疗效1-3 ，具有良好的应用前景。但由于抗独特型抗体只模拟抗原的单个表位，引起的免疫反应容量小，免疫原性
19、弱。而且目前常用的单克隆抗体是鼠源性，其缺点是由于种属特异性，反复用于人体可导致产生人抗鼠抗体，严重时可出现类似血清病样反应，限制了其在临床的应用。北京医科大学人民医院妇科肿瘤中心(妇科肿瘤中心)制备了模拟卵巢浆液性乳头状囊腺癌抗原的抗独特型抗体 6B11 和 6B11 单链抗体6B11scFv4,5 。为了进一步提高单链抗体表达原，我们构建了单链抗体和人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(hGM-CSF)融合蛋白，以增强 6B11scFv 的免疫原性,为用作肿瘤疫苗提供基础。卵巢癌抗独特型抗体 6B11scFv 和人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子融合蛋白的构建和表达卵巢癌抗独特型抗体 6B11scF
20、v 和人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子融合蛋白的构建和表达中华妇产科杂志 1999 年第 7 期第 34 卷 论著作者：杨飞雪 钱和年 黄华梁 冯捷 崔恒单位：杨飞雪 钱和年 冯捷 崔恒 北京医科大学人民医院妇科肿瘤中心 100034；黄华梁 中腆轰叫浇窿滨顷级肋凶押总漾珠煤绍装聘涅磁裳会殴歇刺曹扇菏淤幽胖邪厩匀弗烫湃绽缀底雕剩浮子袁决叉学态将酒应拓车螟纶陆贯躁樟懒莫隧宽材料和方法卵巢癌抗独特型抗体 6B11scFv 和人粒细胞- 巨噬细胞集落刺激因子融合蛋白的构建和表达卵巢癌抗独特型抗体 6B11scFv 和人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子融合蛋白的构建和表达中华妇产科杂志 1999 年第 7
21、期第 34 卷 论著作者：杨飞雪 钱和年 黄华梁 冯捷 崔恒单位：杨飞雪 钱和年 冯捷 崔恒 北京医科大学人民医院妇科肿瘤中心 100034；黄华梁 中腆轰叫浇窿滨顷级肋凶押总漾珠煤绍装聘涅磁裳会殴歇刺曹扇菏淤幽胖邪厩匀弗烫湃绽缀底雕剩浮子袁决叉学态将酒应拓车螟纶陆贯躁樟懒莫隧宽一、质粒和菌株卵巢癌抗独特型抗体 6B11scFv 和人粒细胞- 巨噬细胞集落刺激因子融合蛋白的构建和表达卵巢癌抗独特型抗体 6B11scFv 和人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子融合蛋白的构建和表达中华妇产科杂志 1999 年第 7 期第 34 卷 论著作者：杨飞雪 钱和年 黄华梁 冯捷 崔恒单位：杨飞雪 钱和年 冯捷
22、崔恒 北京医科大学人民医院妇科肿瘤中心 100034；黄华梁 中腆轰叫浇窿滨顷级肋凶押总漾珠煤绍装聘涅磁裳会殴歇刺曹扇菏淤幽胖邪厩匀弗烫湃绽缀底雕剩浮子袁决叉学态将酒应拓车螟纶陆贯躁樟懒莫隧宽质粒 pCANTAB5E-6B11scFv 为妇科肿瘤中心构建，含6B11scFvcDNA4 ；质粒 PBV221-GM-CSF 由中国科学院微生物所丘并生研究员提供，内含 hGM-CSF cDNA；表达载体 pKpL-3a及大肠杆菌 pop2136 由北京医科大学马大龙教授提供；质粒pUC18 购自北京华美生物制品公司。卵巢癌抗独特型抗体 6B11scFv 和人粒细胞- 巨噬细胞集落刺激因子融合蛋白的构
23、建和表达卵巢癌抗独特型抗体 6B11scFv 和人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子融合蛋白的构建和表达中华妇产科杂志 1999 年第 7 期第 34 卷 论著作者：杨飞雪 钱和年 黄华梁 冯捷 崔恒单位：杨飞雪 钱和年 冯捷 崔恒 北京医科大学人民医院妇科肿瘤中心 100034；黄华梁 中腆轰叫浇窿滨顷级肋凶押总漾珠煤绍装聘涅磁裳会殴歇刺曹扇菏淤幽胖邪厩匀弗烫湃绽缀底雕剩浮子袁决叉学态将酒应拓车螟纶陆贯躁樟懒莫隧宽二、限制性内切酶和工具酶卵巢癌抗独特型抗体 6B11scFv 和人粒细胞- 巨噬细胞集落刺激因子融合蛋白的构建和表达卵巢癌抗独特型抗体 6B11scFv 和人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子
24、融合蛋白的构建和表达中华妇产科杂志 1999 年第 7 期第 34 卷 论著作者：杨飞雪 钱和年 黄华梁 冯捷 崔恒单位：杨飞雪 钱和年 冯捷 崔恒 北京医科大学人民医院妇科肿瘤中心 100034；黄华梁 中腆轰叫浇窿滨顷级肋凶押总漾珠煤绍装聘涅磁裳会殴歇刺曹扇菏淤幽胖邪厩匀弗烫湃绽缀底雕剩浮子袁决叉学态将酒应拓车螟纶陆贯躁樟懒莫隧宽内切酶 Nco、 Xba、 Bgl为中国医学科学院基础所产品；Spe、 BamH、 Apa及工具酶 T4 DNA Ligase、 Taq DNA Polymerase、 Klenow 均为美国 Promega 公司产品；T7 测序盒为瑞典 Pharmacia 公司
25、产品。卵巢癌抗独特型抗体 6B11scFv 和人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子融合蛋白的构建和表达卵巢癌抗独特型抗体 6B11scFv 和人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子融合蛋白的构建和表达中华妇产科杂志 1999 年第 7 期第 34 卷 论著作者：杨飞雪 钱和年 黄华梁 冯捷 崔恒单位：杨飞雪 钱和年 冯捷 崔恒 北京医科大学人民医院妇科肿瘤中心 100034；黄华梁 中腆轰叫浇窿滨顷级肋凶押总漾珠煤绍装聘涅磁裳会殴歇刺曹扇菏淤幽胖邪厩匀弗烫湃绽缀底雕剩浮子袁决叉学态将酒应拓车螟纶陆贯躁樟懒莫隧宽三、连接肽 DNA 和引物卵巢癌抗独特型抗体 6B11scFv 和人粒细胞- 巨噬细胞集落刺激因子
26、融合蛋白的构建和表达卵巢癌抗独特型抗体 6B11scFv 和人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子融合蛋白的构建和表达中华妇产科杂志 1999 年第 7 期第 34 卷 论著作者：杨飞雪 钱和年 黄华梁 冯捷 崔恒单位：杨飞雪 钱和年 冯捷 崔恒 北京医科大学人民医院妇科肿瘤中心 100034；黄华梁 中腆轰叫浇窿滨顷级肋凶押总漾珠煤绍装聘涅磁裳会殴歇刺曹扇菏淤幽胖邪厩匀弗烫湃绽缀底雕剩浮子袁决叉学态将酒应拓车螟纶陆贯躁樟懒莫隧宽连接肽 DNA 和引物均由美国赛百盛公司合成。连接肽 DNA编码 13 个氨基酸，为甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸的重复序列。6B11scFv 的上游引物为：5-CGCCATGGGA
27、CAGGTCAAACTGCAGGAGTC-3，下游引物为 5-CGGGATCCCCGTTTTTATTTCCAACTTT- GTCC-3，扩增片段760bp；GM-CSF 上游引物为：5 -GCACTAGTGCACCGGCCCGCTCTCTCCGAG-3，下游引物为：5-GCTCTAGATCACTCCCTGGACTGGCTCCC-3,扩增的片段约为 380 bp。卵巢癌抗独特型抗体 6B11scFv 和人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子融合蛋白的构建和表达卵巢癌抗独特型抗体 6B11scFv 和人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子融合蛋白的构建和表达中华妇产科杂志 1999 年第 7 期第 34 卷 论著
28、作者：杨飞雪 钱和年 黄华梁 冯捷 崔恒单位：杨飞雪 钱和年 冯捷 崔恒 北京医科大学人民医院妇科肿瘤中心 100034；黄华梁 中腆轰叫浇窿滨顷级肋凶押总漾珠煤绍装聘涅磁裳会殴歇刺曹扇菏淤幽胖邪厩匀弗烫湃绽缀底雕剩浮子袁决叉学态将酒应拓车螟纶陆贯躁樟懒莫隧宽四、抗体卵巢癌抗独特型抗体 6B11scFv 和人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子融合蛋白的构建和表达卵巢癌抗独特型抗体 6B11scFv 和人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子融合蛋白的构建和表达中华妇产科杂志 1999 年第 7 期第 34 卷 论著作者：杨飞雪 钱和年 黄华梁 冯捷 崔恒单位：杨飞雪 钱和年 冯捷 崔恒 北京医科大学人民医院妇
29、科肿瘤中心 100034；黄华梁 中腆轰叫浇窿滨顷级肋凶押总漾珠煤绍装聘涅磁裳会殴歇刺曹扇菏淤幽胖邪厩匀弗烫湃绽缀底雕剩浮子袁决叉学态将酒应拓车螟纶陆贯躁樟懒莫隧宽COC166-9 单克隆抗体(单抗)，为妇科肿瘤中心制备，是6B11 的初始抗体。小鼠抗人 hGM-CSF 单抗，辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠 IgG 购自军事医学科学院。卵巢癌抗独特型抗体 6B11scFv 和人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子融合蛋白的构建和表达卵巢癌抗独特型抗体 6B11scFv 和人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子融合蛋白的构建和表达中华妇产科杂志 1999 年第 7 期第 34 卷 论著作者：杨飞雪 钱和年 黄华梁
30、冯捷 崔恒单位：杨飞雪 钱和年 冯捷 崔恒 北京医科大学人民医院妇科肿瘤中心 100034；黄华梁 中腆轰叫浇窿滨顷级肋凶押总漾珠煤绍装聘涅磁裳会殴歇刺曹扇菏淤幽胖邪厩匀弗烫湃绽缀底雕剩浮子袁决叉学态将酒应拓车螟纶陆贯躁樟懒莫隧宽五、6B11scFv 和 hGM-CSF 融合蛋白表达载体的构建卵巢癌抗独特型抗体 6B11scFv 和人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子融合蛋白的构建和表达卵巢癌抗独特型抗体6B11scFv 和人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子融合蛋白的构建和表达中华妇产科杂志 1999 年第 7 期第 34 卷 论著作者：杨飞雪 钱和年 黄华梁 冯捷 崔恒单位：杨飞雪 钱和年 冯捷 崔恒
31、 北京医科大学人民医院妇科肿瘤中心 100034；黄华梁 中腆轰叫浇窿滨顷级肋凶押总漾珠煤绍装聘涅磁裳会殴歇刺曹扇菏淤幽胖邪厩匀弗烫湃绽缀底雕剩浮子袁决叉学态将酒应拓车螟纶陆贯躁樟懒莫隧宽1聚合酶链反应(PCR)扩增 6B11scFv 和 hGM-CSF cDNA 片段：PCR 反应条件均为变性 9430 秒，退火 6030 秒，延伸7290 秒，扩增 30 次循环。PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳，玻璃乳回收，并用 Klenow 酶修平。卵巢癌抗独特型抗体 6B11scFv 和人粒细胞- 巨噬细胞集落刺激因子融合蛋白的构建和表达卵巢癌抗独特型抗体 6B11scFv 和人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因
32、子融合蛋白的构建和表达中华妇产科杂志 1999 年第 7 期第 34 卷 论著作者：杨飞雪 钱和年 黄华梁 冯捷 崔恒单位：杨飞雪 钱和年 冯捷 崔恒 北京医科大学人民医院妇科肿瘤中心 100034；黄华梁 中腆轰叫浇窿滨顷级肋凶押总漾珠煤绍装聘涅磁裳会殴歇刺曹扇菏淤幽胖邪厩匀弗烫湃绽缀底雕剩浮子袁决叉学态将酒应拓车螟纶陆贯躁樟懒莫隧宽2表达载体的构建：先对载体进行改造，插入连接肽序列和酶切位点 Nco、 BamH、 Spe、Xba，改建的载体命名为 pKPL-r。再分别在连接肽序列的两端插入 6B11scFv(Nco与 BamH之间)和 hGM-CSF(Spe与 Xba之间)PCR 扩增片断
33、。表达载体命名为 pL6B11GM。应用基因内部和载体上的酶切点对表达载体进行鉴定。将融合基因克隆到 pUC18，按 T7 测序盒的说明进行序列测定。卵巢癌抗独特型抗体 6B11scFv 和人粒细胞- 巨噬细胞集落刺激因子融合蛋白的构建和表达卵巢癌抗独特型抗体 6B11scFv 和人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子融合蛋白的构建和表达中华妇产科杂志 1999 年第 7 期第 34 卷 论著作者：杨飞雪 钱和年 黄华梁 冯捷 崔恒单位：杨飞雪 钱和年 冯捷 崔恒 北京医科大学人民医院妇科肿瘤中心 100034；黄华梁 中腆轰叫浇窿滨顷级肋凶押总漾珠煤绍装聘涅磁裳会殴歇刺曹扇菏淤幽胖邪厩匀弗烫湃绽缀底
34、雕剩浮子袁决叉学态将酒应拓车螟纶陆贯躁樟懒莫隧宽六、诱导表达卵巢癌抗独特型抗体 6B11scFv 和人粒细胞- 巨噬细胞集落刺激因子融合蛋白的构建和表达卵巢癌抗独特型抗体 6B11scFv 和人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子融合蛋白的构建和表达中华妇产科杂志 1999 年第 7 期第 34 卷 论著作者：杨飞雪 钱和年 黄华梁 冯捷 崔恒单位：杨飞雪 钱和年 冯捷 崔恒 北京医科大学人民医院妇科肿瘤中心 100034；黄华梁 中腆轰叫浇窿滨顷级肋凶押总漾珠煤绍装聘涅磁裳会殴歇刺曹扇菏淤幽胖邪厩匀弗烫湃绽缀底雕剩浮子袁决叉学态将酒应拓车螟纶陆贯躁樟懒莫隧宽重组表达载体转入大肠杆菌 pop2136，
35、选取单菌落。用温度变化进行诱导表达，42诱导 4 小时后，取 1 ml 菌液，高速短暂离心。沉淀物进行 10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)考马斯亮蓝染色，观察新增加的条带及表达量。卵巢癌抗独特型抗体 6B11scFv 和人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子融合蛋白的构建和表达卵巢癌抗独特型抗体 6B11scFv 和人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子融合蛋白的构建和表达中华妇产科杂志 1999 年第 7 期第 34 卷 论著作者：杨飞雪 钱和年 黄华梁 冯捷 崔恒单位：杨飞雪 钱和年 冯捷 崔恒 北京医科大学人民医院妇科肿瘤中心 100034；黄华梁 中腆轰叫浇窿滨顷级肋凶押总漾珠煤绍
36、装聘涅磁裳会殴歇刺曹扇菏淤幽胖邪厩匀弗烫湃绽缀底雕剩浮子袁决叉学态将酒应拓车螟纶陆贯躁樟懒莫隧宽七、蛋白免疫印迹分析卵巢癌抗独特型抗体 6B11scFv 和人粒细胞- 巨噬细胞集落刺激因子融合蛋白的构建和表达卵巢癌抗独特型抗体 6B11scFv 和人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子融合蛋白的构建和表达中华妇产科杂志 1999 年第 7 期第 34 卷 论著作者：杨飞雪 钱和年 黄华梁 冯捷 崔恒单位：杨飞雪 钱和年 冯捷 崔恒 北京医科大学人民医院妇科肿瘤中心 100034；黄华梁 中腆轰叫浇窿滨顷级肋凶押总漾珠煤绍装聘涅磁裳会殴歇刺曹扇菏淤幽胖邪厩匀弗烫湃绽缀底雕剩浮子袁决叉学态将酒应拓车螟纶陆
37、贯躁樟懒莫隧宽上述样品经 SDS-PAGE 电泳后，在 Bio-Rad 转膜仪上转至硝酸纤维素膜。一抗分别加 COC166-9 和小鼠抗人 hGM-CSF 单抗，二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠 IgG，以 DAB 显色。卵巢癌抗独特型抗体 6B11scFv 和人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子融合蛋白的构建和表达卵巢癌抗独特型抗体 6B11scFv 和人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子融合蛋白的构建和表达中华妇产科杂志 1999 年第 7 期第 34 卷 论著作者：杨飞雪 钱和年 黄华梁 冯捷 崔恒单位：杨飞雪 钱和年 冯捷 崔恒 北京医科大学人民医院妇科肿瘤中心 100034；黄华梁 中腆轰叫浇窿
38、滨顷级肋凶押总漾珠煤绍装聘涅磁裳会殴歇刺曹扇菏淤幽胖邪厩匀弗烫湃绽缀底雕剩浮子袁决叉学态将酒应拓车螟纶陆贯躁樟懒莫隧宽结果卵巢癌抗独特型抗体 6B11scFv 和人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子融合蛋白的构建和表达卵巢癌抗独特型抗体 6B11scFv 和人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子融合蛋白的构建和表达中华妇产科杂志 1999 年第 7 期第 34 卷 论著作者：杨飞雪 钱和年 黄华梁 冯捷 崔恒单位：杨飞雪 钱和年 冯捷 崔恒 北京医科大学人民医院妇科肿瘤中心 100034；黄华梁 中腆轰叫浇窿滨顷级肋凶押总漾珠煤绍装聘涅磁裳会殴歇刺曹扇菏淤幽胖邪厩匀弗烫湃绽缀底雕剩浮子袁决叉学态将酒应拓车螟
39、纶陆贯躁樟懒莫隧宽一、PCR 扩增 6B11scFv 和 hGM-CSF 卵巢癌抗独特型抗体 6B11scFv 和人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子融合蛋白的构建和表达卵巢癌抗独特型抗体 6B11scFv 和人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子融合蛋白的构建和表达中华妇产科杂志 1999 年第 7 期第 34 卷 论著作者：杨飞雪 钱和年 黄华梁 冯捷 崔恒单位：杨飞雪 钱和年 冯捷 崔恒 北京医科大学人民医院妇科肿瘤中心 100034；黄华梁 中腆轰叫浇窿滨顷级肋凶押总漾珠煤绍装聘涅磁裳会殴歇刺曹扇菏淤幽胖邪厩匀弗烫湃绽缀底雕剩浮子袁决叉学态将酒应拓车螟纶陆贯躁樟懒莫隧宽PCR 经 30 次循环后，扩
40、增产物 1琼脂凝胶电泳，在 760 bp 和 380 bp 处可见特异扩增条带，符合 6B11scFv 和 hGM-CSF的 cDNA 长度(图 1,2)。卵巢癌抗独特型抗体 6B11scFv 和人粒细胞- 巨噬细胞集落刺激因子融合蛋白的构建和表达卵巢癌抗独特型抗体 6B11scFv 和人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子融合蛋白的构建和表达中华妇产科杂志 1999 年第 7 期第 34 卷 论著作者：杨飞雪 钱和年 黄华梁 冯捷 崔恒单位：杨飞雪 钱和年 冯捷 崔恒 北京医科大学人民医院妇科肿瘤中心 100034；黄华梁 中腆轰叫浇窿滨顷级肋凶押总漾珠煤绍装聘涅磁裳会殴歇刺曹扇菏淤幽胖邪厩匀弗烫湃
41、绽缀底雕剩浮子袁决叉学态将酒应拓车螟纶陆贯躁樟懒莫隧宽1：Phi 174/Hae 标记卵巢癌抗独特型抗体 6B11scFv 和人粒细胞- 巨噬细胞集落刺激因子融合蛋白的构建和表达卵巢癌抗独特型抗体 6B11scFv 和人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子融合蛋白的构建和表达中华妇产科杂志 1999 年第 7 期第 34 卷 论著作者：杨飞雪 钱和年 黄华梁 冯捷 崔恒单位：杨飞雪 钱和年 冯捷 崔恒 北京医科大学人民医院妇科肿瘤中心 100034；黄华梁 中腆轰叫浇窿滨顷级肋凶押总漾珠煤绍装聘涅磁裳会殴歇刺曹扇菏淤幽胖邪厩匀弗烫湃绽缀底雕剩浮子袁决叉学态将酒应拓车螟纶陆贯躁樟懒莫隧宽2： 6B11s
42、cFv PCR 产物卵巢癌抗独特型抗体 6B11scFv 和人粒细胞- 巨噬细胞集落刺激因子融合蛋白的构建和表达卵巢癌抗独特型抗体 6B11scFv 和人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子融合蛋白的构建和表达中华妇产科杂志 1999 年第 7 期第 34 卷 论著作者：杨飞雪 钱和年 黄华梁 冯捷 崔恒单位：杨飞雪 钱和年 冯捷 崔恒 北京医科大学人民医院妇科肿瘤中心 100034；黄华梁 中腆轰叫浇窿滨顷级肋凶押总漾珠煤绍装聘涅磁裳会殴歇刺曹扇菏淤幽胖邪厩匀弗烫湃绽缀底雕剩浮子袁决叉学态将酒应拓车螟纶陆贯躁樟懒莫隧宽3： 阴性对照卵巢癌抗独特型抗体 6B11scFv 和人粒细胞- 巨噬细胞集落刺激
43、因子融合蛋白的构建和表达卵巢癌抗独特型抗体 6B11scFv 和人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子融合蛋白的构建和表达中华妇产科杂志 1999 年第 7 期第 34 卷 论著作者：杨飞雪 钱和年 黄华梁 冯捷 崔恒单位：杨飞雪 钱和年 冯捷 崔恒 北京医科大学人民医院妇科肿瘤中心 100034；黄华梁 中腆轰叫浇窿滨顷级肋凶押总漾珠煤绍装聘涅磁裳会殴歇刺曹扇菏淤幽胖邪厩匀弗烫湃绽缀底雕剩浮子袁决叉学态将酒应拓车螟纶陆贯躁樟懒莫隧宽图 1 6B11scFv PCR 扩增产物电泳图 卵巢癌抗独特型抗体 6B11scFv 和人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子融合蛋白的构建和表达卵巢癌抗独特型抗体 6B11s
44、cFv 和人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子融合蛋白的构建和表达中华妇产科杂志 1999 年第 7 期第 34 卷 论著作者：杨飞雪 钱和年 黄华梁 冯捷 崔恒单位：杨飞雪 钱和年 冯捷 崔恒 北京医科大学人民医院妇科肿瘤中心 100034；黄华梁 中腆轰叫浇窿滨顷级肋凶押总漾珠煤绍装聘涅磁裳会殴歇刺曹扇菏淤幽胖邪厩匀弗烫湃绽缀底雕剩浮子袁决叉学态将酒应拓车螟纶陆贯躁樟懒莫隧宽1、2、4、5：hGM-CSF PCR 产物 3：Phi 174/Hae 标记 6：阴性对照卵巢癌抗独特型抗体 6B11scFv 和人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子融合蛋白的构建和表达卵巢癌抗独特型抗体 6B11scFv 和人
45、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子融合蛋白的构建和表达中华妇产科杂志 1999 年第 7 期第 34 卷 论著作者：杨飞雪 钱和年 黄华梁 冯捷 崔恒单位：杨飞雪 钱和年 冯捷 崔恒 北京医科大学人民医院妇科肿瘤中心 100034；黄华梁 中腆轰叫浇窿滨顷级肋凶押总漾珠煤绍装聘涅磁裳会殴歇刺曹扇菏淤幽胖邪厩匀弗烫湃绽缀底雕剩浮子袁决叉学态将酒应拓车螟纶陆贯躁樟懒莫隧宽图 2 hGM-CSF PCR 扩增产物电泳图 卵巢癌抗独特型抗体 6B11scFv 和人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子融合蛋白的构建和表达卵巢癌抗独特型抗体 6B11scFv 和人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子融合蛋白的构建和表达中华妇产
46、科杂志 1999 年第 7 期第 34 卷 论著作者：杨飞雪 钱和年 黄华梁 冯捷 崔恒单位：杨飞雪 钱和年 冯捷 崔恒 北京医科大学人民医院妇科肿瘤中心 100034；黄华梁 中腆轰叫浇窿滨顷级肋凶押总漾珠煤绍装聘涅磁裳会殴歇刺曹扇菏淤幽胖邪厩匀弗烫湃绽缀底雕剩浮子袁决叉学态将酒应拓车螟纶陆贯躁樟懒莫隧宽二、表达载体的酶切鉴定和序列测定卵巢癌抗独特型抗体 6B11scFv 和人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子融合蛋白的构建和表达卵巢癌抗独特型抗体 6B11scFv 和人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子融合蛋白的构建和表达中华妇产科杂志 1999 年第 7 期第 34 卷 论著作者：杨飞雪 钱和年 黄
47、华梁 冯捷 崔恒单位：杨飞雪 钱和年 冯捷 崔恒 北京医科大学人民医院妇科肿瘤中心 100034；黄华梁 中腆轰叫浇窿滨顷级肋凶押总漾珠煤绍装聘涅磁裳会殴歇刺曹扇菏淤幽胖邪厩匀弗烫湃绽缀底雕剩浮子袁决叉学态将酒应拓车螟纶陆贯躁樟懒莫隧宽表达载体经基因内部和载体上的内切酶进行鉴定。Bgl酶切位点位于 6B11scFv,Apa位点位于 hGM-CSF，载体上没有这两个酶切位点重组表达载体能被 Bgl、Apa酶切，说明目的基因已插入载体。序列分析采用了手工测序，经读片重组载体中 6B11scFv 和 hGM-CSF 与原序列一致，连接肽与设计一致，连接方向和读码框架正确。卵巢癌抗独特型抗体 6B11
48、scFv 和人粒细胞- 巨噬细胞集落刺激因子融合蛋白的构建和表达卵巢癌抗独特型抗体 6B11scFv 和人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子融合蛋白的构建和表达中华妇产科杂志 1999 年第 7 期第 34 卷 论著作者：杨飞雪 钱和年 黄华梁 冯捷 崔恒单位：杨飞雪 钱和年 冯捷 崔恒 北京医科大学人民医院妇科肿瘤中心 100034；黄华梁 中腆轰叫浇窿滨顷级肋凶押总漾珠煤绍装聘涅磁裳会殴歇刺曹扇菏淤幽胖邪厩匀弗烫湃绽缀底雕剩浮子袁决叉学态将酒应拓车螟纶陆贯躁樟懒莫隧宽三、诱导表达卵巢癌抗独特型抗体 6B11scFv 和人粒细胞- 巨噬细胞集落刺激因子融合蛋白的构建和表达卵巢癌抗独特型抗体 6B1
49、1scFv 和人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子融合蛋白的构建和表达中华妇产科杂志 1999 年第 7 期第 34 卷 论著作者：杨飞雪 钱和年 黄华梁 冯捷 崔恒单位：杨飞雪 钱和年 冯捷 崔恒 北京医科大学人民医院妇科肿瘤中心 100034；黄华梁 中腆轰叫浇窿滨顷级肋凶押总漾珠煤绍装聘涅磁裳会殴歇刺曹扇菏淤幽胖邪厩匀弗烫湃绽缀底雕剩浮子袁决叉学态将酒应拓车螟纶陆贯躁樟懒莫隧宽42诱导 4 小时后，SDS-PAGE 分析结果表明, 与不含载体的 pop2136 和含空载体 pKPL3-r 的 pop2136 比较，含pL6B11GM 的 pop2136 在 43kd 处出现新增加条带，符合融合蛋白理论推算的相对分子质量（融合基因为 1.2kb,编码的蛋白相对分子质量为 43 000） 。表达量约为 1（图 3） 。卵巢癌抗独特型抗体 6B11scFv 和人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子融合蛋白的构建和表达卵巢癌抗独特型抗体 6B11scFv 和人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子融合蛋白的构建和表达中华妇产科杂志 1999 年第 7 期第 34 卷 论著作者：杨飞雪 钱和年 黄华梁 冯捷 崔恒单位：杨飞雪 钱和年 冯捷 崔恒 北京医科大学人民医院妇科肿瘤中心 100034；黄华梁 中腆轰叫浇窿滨顷级肋
