1、ICS 67.050X04LS中 华 人 民 共 和 国 粮 食 行 业 标 准LS/T XXXXXXXXX粮油检验 植物油脂中缩水甘油脂肪酸酯的测定Inspection of grain and oilsDetermination of glycidol fatty acid esters in vegetable oils（征求意见稿）XXXX - XX - XX 发布 XXXX - XX - XX 实施国 家 粮 食 和 物 资 储 备 局 发 布LS/T XXXXXXXXXI前 言本标准按照GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。本标准由国家粮食和物资储备局提出。本标准由全国粮油标
2、准化技术委员会（SAC/TC 270）归口。本标准起草单位：国家粮食和物资储备局科学研究院等。本标准主要起草人：LS/T XXXXXXXXX1粮油检验 植物油脂中缩水甘油脂肪酸酯的测定1 范围本标准规定了植物油脂中缩水甘油脂肪酸酯测定的原理、试剂和材料、仪器和设备、试样制备、分析步骤、结果计算和精密度要求。本标准适用于植物油脂中缩水甘油脂肪酸酯含量的测定。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 5490 粮油检验 一般规则GB/T 6682 分析实验
3、室用水规格和试验方法GB/T 15687 动植物油脂 试样的制备第一法 液相色谱-质谱法3 原理植物油脂中的缩水甘油脂肪酸酯经固相萃取柱净化、富集后，用液相色谱-质谱仪分析，外标法定量。4 试剂和材料除另有说明外，所用试剂均为分析纯试剂；实验用水应符合GB/T 6682中一级水的规定。4.1 甲基叔丁基醚：色谱纯。4.2 乙酸乙酯：色谱纯。4.3 正己烷：色谱纯。4.4 甲醇：色谱纯。4.5 异丙醇：色谱纯。4.6 甲醇/异丙醇（50/50，v/v）：50mL 甲醇（4.4）与 50mL 异丙醇（4.5）混匀。LS/T XXXXXXXXX24.7 甲基叔丁基醚/乙酸乙酯（80/20，v/v）：
4、80mL 甲基叔丁基醚（4.1）与 20mL 乙酸乙酯（4.2）混匀。4.8 正己烷/乙酸乙酯（95/5，v/v）：95mL 正己烷（4.3）与 5mL 乙酸乙酯（4.2）混匀。4.9 标准品：缩水甘油棕榈酸酯，纯度95%；缩水甘油硬脂酸酯，纯度95%；缩水甘油油酸酯，纯度95%；缩水甘油亚油酸酯，纯度95%；缩水甘油亚麻酸酯，纯度95%。4.10 标准储备液：准确称取 50mg 缩水甘油脂肪酸酯标准品，用甲醇/异丙醇（4.6）配制成500g/mL 的标准储备液，保存于-18冰箱中。4.11 标准工作液：用甲醇/异丙醇（4.6）稀释标准储备液（4.10），依次配制浓度为10g/mL、1000n
5、g/mL、200ng/mL、50ng/mL、10ng/mL、5ng/mL 的标准工作液。4.12 滤膜：0.22m 有机膜。5 仪器和设备5.1 分析天平：感量 0.01g。5.2 液相色谱-四级杆-质谱联用仪。5.3 氮吹仪。5.4 涡旋振荡器。5.5 固相萃取柱 C18（500mg）。5.6 固相萃取柱 Silica（500mg）。6 试样制备按GB/T 15687规定的方法制备试样。7 分析步骤7.1 样品溶解准确称取1g植物油（精确至0.01g）于玻璃烧杯中，加入6mL甲基叔丁基醚/乙酸乙酯（4.7）将样品溶解，转移到10mL容量瓶中，定容后摇匀，待测。7.2 固相萃取用甲醇（4.4）
6、连续清洗C18固相萃取柱（5.5）4次，每次甲醇（4.4）用量为1mL，用微量注射器注入100L待测样品溶液（7.1），再用甲醇（4.4）洗脱3次，每次甲醇（4.4）用量为2mL。洗脱液用玻璃管收集，氮气吹干后加入2mL正己烷/乙酸乙酯（4.8），用旋涡混合仪震荡30s至充分溶解。然后转移到用正己烷/乙酸乙酯（4.8）清洗过4次（每次用量为1mL）的Silica固相萃取柱（5.6）上，用6mL正己烷/乙酸乙酯（4.8）分3次清洗玻璃管并全部转移到Silica固相萃取柱（5.6）上，进行样品的LS/T XXXXXXXXX3洗脱。收集洗脱液，氮气吹干，再准确加入1mL甲醇/异丙醇（4.6）充分溶解
7、样品，转移到进样瓶中待测。7.3 测定7.3.1 液相色谱条件色谱柱：反相色谱柱（4.6mm150 mm，5m）或相当型号色谱柱。柱温：40 oC。进样量：20L。流动相：A为甲醇/水（92:8，v/v），B为异丙醇。流动相洗脱程序：0-18.0 min，0%B（流速为1mL/min）；18.1-32.0min，100%B（流速为0.5mL/min）；32.1-42.0min，0%B（流速为1mL/min）。7.3.2 质谱条件离子源：APCI源。喷雾器温度：500 oC。干燥气温度：350 oC。鞘气压力：50arb。辅助气压力：25arb。电晕电流：8A。选择性离子监测（SIM）：C16:
8、0-GE为m/z 313.3，C18:0-GE为m/z 341.2，C18:1-GE为m/z 339.4，C18:2-GE为m/z 337.3，C18:3-GE为m/z 335.3。8 结果计算样品中缩水甘油脂肪酸酯的含量（mg/kg)按式（1）计算：（1）10mVcQ式中：Q待测样品中缩水甘油脂肪酸酯的含量，mg/kg；c通过标准曲线获得的样品提取液中缩水甘油脂肪酸酯的浓度，mg/mL；V样品提取液的定容体积，mL；m样品的称样量，g；取两次测定结果的平均值，计算结果保留到小数点后两位。测定结果不符合重复性要求时，应按GB/T 5490 的规定重新测定，计算结果。9 精密度在重复性条件下获得
9、两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。第二法 气相色谱-质谱法LS/T XXXXXXXXX410 原理植物油脂中缩水甘油脂肪酸酯在溴化钠的酸性水溶液中转化为 3-溴代丙二醇（3-MBPD）单酯。在酸性甲醇溶液中，3-MBPD 单酯转化为游离 3-MBPD，3-MBPD 用苯基硼酸衍生后进行气相色谱-质谱分析。最终以缩水甘油含量评价植物油脂中缩水甘油脂肪酸酯的含量，内标法定量。11 试剂和材料除另有说明外，所用试剂均为分析纯试剂；实验用水应符合 GB/T 6682 中一级水的规定。11.1 四氢呋喃（无水）：色谱纯。11.2 甲醇：色谱纯。11.3 正庚烷：色谱纯。11.4 丙酮
10、：色谱纯。11.5 甲苯：色谱纯。11.6 硫酸：质量分数为95%。11.7 碳酸氢钠：纯度99%。11.8 硫酸钠：纯度99%。11.9 苯基硼酸：纯度97%。11.10 溴化钠：纯度99.5%。11.11 丙酮/超纯水（19/1, v/v）：190mL 丙酮（11.4）与 10mL 超纯水混合。11.12 溴化钠的酸性水溶液（溴化钠 3mg/mL，硫酸 5%，v/v）：称取 1.0g 溴化钠（11.10），用10mL 超纯水溶解；移取 180L 至空瓶，加入 0.3mL 硫酸（11.6）和 5.5mL 超纯水，震荡混匀。11.13 碳酸氢钠溶液（0.6%，w/v）：称取 0.6g 碳酸氢钠
11、（11.7）至 100mL 容量瓶中，加超纯水超声溶解，定容至刻度线后混匀。11.14 硫酸/甲醇溶液（1.8%, v/v）：取 1.8mL 硫酸（11.6）至 100mL 容量瓶中，用甲醇（11.2）定容至刻度线后混匀。11.15 饱和碳酸氢钠溶液：称取 9.6g 碳酸氢钠（11.7）至 100mL 容量瓶中，加超纯水超声溶解定容至刻度线后混匀。11.16 硫酸钠溶液（20%, w/v）：称取 20.0g 硫酸钠（11.8）至 100mL 容量瓶中，加超纯水超声溶解，定容至刻度后混匀。11.17 饱和苯基硼酸溶液：称取 3.0g 苯基硼酸（11.9），用 12mL 丙酮/超纯水（11.11）
12、溶解，震荡并充分混匀。11.18 标准品：缩水甘油棕榈酸酯（Gly-P），纯度98%；氘代缩水甘油棕榈酸酯（Gly-P-d5），纯度98%。LS/T XXXXXXXXX511.19 标准储备液 1：准确称取 Gly-P 标准品 10mg，用无水四氢呋喃（11.1）或甲苯（11.2）配制成1mg/mL 的标准储备液，保存于-18 oC 冰箱中。11.20 标准储备液 2：准确称取 Gly-P-d5 标准品 10mg，用无水四氢呋喃（11.1）或甲苯（11.2）配制成 1mg/mL 的标准储备液，保存于-18 oC 冰箱中。11.21 标准工作液：用无水四氢呋喃（11.1）或甲苯（11.2）稀释标
13、准储备液 1（11.19）至浓度为100g/mL 和 10g/mL 的标准工作液。11.22 内标工作液：用无水四氢呋喃（11.1）或甲苯（11.2）稀释标准储备液 2（11.20）至浓度为50g/mL 的内标工作液。11.23 滤膜：0.22m 有机膜。12 仪器和设备12.1 分析天平：感量 0.1g，0.0001g。12.2 气相色谱-质谱联用仪。12.3 可控温摇床。12.4 氮吹仪。12.5 超声水浴。12.6 涡旋振荡器。12.7 离心机。13 试样制备按GB/T 15687规定的方法制备试样。14 分析步骤14.1 开环反应称取 100-110mg 植物油（精确至 0.0001g
14、）于带有螺旋盖的管中，加入 50L 内标工作液（11.21）和 2mL 无水四氢呋喃（11.1），涡旋 15s 使之混匀。加入 30L 溴化钠的酸性水溶液（11.12），涡旋后在 50oC 摇床（12.3）震荡反应 15min。加入 3mL 0.6%的碳酸氢钠溶液（11.13）以终止反应。为将油脂从水相中分离出来，向样品中加入 2mL 正庚烷（11.3），旋涡 15s，静置，将上层液相转移至干净的管中，氮吹至干（35-40 oC 下，15-20min），用 1mL 无水四氢呋喃（10.1）复溶，待水解。14.2 水解反应LS/T XXXXXXXXX6向待水解液（14.1）中加入1.8mL硫酸/
15、甲醇溶液（11.14），涡旋10s，然后将其置于40 oC摇床震荡反应16h。反应结束后，向样品溶液中加入0.5mL饱和碳酸氢钠溶液（11.15），涡旋10s，以终止反应。氮吹至约1mL，待净化。14.3 净化待净化液（14.2）中依次加入2mL硫酸钠溶液（11.16）和2mL正庚烷（11.3），涡旋10s充分混合。静置，待两相自然分层后弃去上层液相（含有脂肪酸甲酯的正庚烷），并用正庚烷（11.3）重复提取1次，残留液待衍生化反应。14.4 衍生化向残留液（14.3）中加入250L饱和苯基硼酸溶液（11.17），涡旋10s，室温下超声处理5min。加入1mL正庚烷（11.3），涡旋10s，转移
16、上层液相至空瓶；用1mL正庚烷（11.3）再提取一次，混合两次提取液。氮吹至全干。加入1mL正庚烷（11.3）复溶，涡旋10s至充分溶解，滤膜（11.23）过滤后转移到进样瓶中待测。14.5 测定14.5.1 气相色谱条件色谱柱：聚二甲基硅氧烷毛细管色谱柱(30m0.25mm1.0m)或相当型号色谱柱。进样量：1.0L。进样方式：脉冲不分流进样。进样口温度：250 oC。载气：高纯氦气（纯度99.999%）。流速：0.8mL/min。升温程序：80 oC保持1min；以10 oC/min的速率升温至170 oC，再以3 oC/min的速率升温至200 oC；然后以15 oC/min的速率升温至
17、300 oC，保持15min。14.5.2 质谱条件传输线温度：300 oC。离子源温度：230 oC。四极杆温度：150 oC。离子源：电子轰击模式（EI）。选择离子监测模式（SIM）参数：（1）3-MBPD的苯基硼酸衍生物（m/z）147（定量离子）；240（定性离子）；（2）3-MBPD-d5的苯基硼酸衍生物（m/z）150（定量离子）；245（定性离子）。溶剂延迟时间：5min。15 结果计算用标准工作液（11.21）和内标工作液（11.22）配制不同浓度比例的标准溶液，做标准曲线式（2）。（2）baxyLS/T XXXXXXXXX7式中：y3-MBPD定量离子（m/z 147）与3-
18、MBPD-d5定量离子（m/z 150）的峰面积之比；xGly-P（以Gly计）与内标Gly-P-d5（以Gly-d5计）的质量比。样品中缩水甘油脂肪酸酯的含量（mg/kg）按式（3）计算：（3）waISbAc115047式中：c待测样品中缩水甘油脂肪酸酯的含量（以缩水甘油计），mg/kg；A147测试样中3-MBPD衍生物对应的峰面积，m/z 147；IS加入待测样品中的内标物的质量，g；A150测试样中3-MBPD-d5衍生物对应的峰面积，m/z 150；a校准曲线的斜率；w待测样品的质量，g；b校准曲线的 y轴截距。取两次测定结果的平均值，计算结果保留到小数点后两位。测定结果不符合重复性要求时，应按GB/T 5490的规定重新测定，计算结果。16 精密度在重复性条件下获得两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的 10%。_
